基于液—固交替培養(yǎng)的水曲柳快速微繁系統(tǒng)研究

齊鳳慧 王雯萱 劉 林 湯明碩 宋飛翔 詹亞光*

（1. 東北林業(yè)大學(xué)東北鹽堿地植被恢復(fù)與重建教育部重點實驗室，哈爾濱 150040；2. 東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150040）

水曲柳（Rupr.）為木犀科（Oleaceae）白蠟樹屬（）高大落葉喬木，為我國東北珍貴的“三大硬闊”之一。在造林方面可與多種針葉闊葉樹形成針闊混交林，利于提高森林生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性，有利于恢復(fù)森林植被多樣性。水曲柳具有材質(zhì)堅硬，紋理通直，花紋美觀的特點，因其生產(chǎn)出的木材具有優(yōu)美的質(zhì)感而備受推崇，常被用于家具制造和作為特殊的建筑材料。傳統(tǒng)的水曲柳繁殖是以種子繁殖為主，但其種子屬于深休眠類型，休眠期高達(dá)218 d，生產(chǎn)周期長，給育苗生產(chǎn)帶來了一定的困難。水曲柳的嫁接和扦插等繁殖技術(shù)受到穗條數(shù)量少、位置效應(yīng)、采枝母樹的年齡效應(yīng)的影響，限制了規(guī)?；瘧?yīng)用。水曲柳的組織培養(yǎng)報道大多集中在胚的離體培養(yǎng)及體胚的誘導(dǎo)，而體胚誘導(dǎo)易發(fā)生畸形胚且成苗率較低。雖然近些年來對水曲柳組培微繁的研究有一些報道，但是這些研究結(jié)果還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能應(yīng)用于規(guī)?；a(chǎn)，而且水曲柳在繼代培養(yǎng)中往往都會出現(xiàn)頂芽休眠、葉片脫落、莖部出現(xiàn)白粉狀，基部形成大片愈傷等老化現(xiàn)象，這也是目前利用組織培養(yǎng)規(guī)?；敝乘缒狙芯康钠款i。

本研究針對水曲柳組培苗老化現(xiàn)象，通過對誘導(dǎo)條件、培養(yǎng)條件、萌發(fā)芽離體繁殖等因素的分析，探索一種快速打破水曲柳組培苗芽休眠并成功離體繁殖的方法，解決水曲柳組培苗易老化、易進(jìn)入休眠狀態(tài)的問題，為水曲柳種苗的快速繁殖提供可持續(xù)的循環(huán)培養(yǎng)技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 水曲柳組培苗腋芽的萌發(fā)

將莖部木質(zhì)化、頂芽休眠、葉片老化的水曲柳組培苗，切去根部，去除枯葉，接入添加0.4、0.6、0.8 mg·LTDZ 的WPM 固體培養(yǎng)基中，其中添加蔗糖30 g·L，瓊脂5.6 g·L。在光照和黑暗兩種條件下誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)，溫度25 ℃，光照強(qiáng)度為1 000～2 000 lx，光照時長為16 h。

1.2 懸浮培養(yǎng)對腋芽萌發(fā)的影響

選擇1.1 中篩選出的適合腋芽萌發(fā)的TDZ 濃度，以WPM 為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，蔗糖30 g·L，不含瓊脂的液體培養(yǎng)基，分裝在100 mL 三角瓶中，每瓶裝入50 mL，接入水曲柳組培苗，黑暗條件下，搖床轉(zhuǎn)速為60 r·min，溫度25 ℃。

1.3 不同激素組合對萌發(fā)芽離體再生的影響

將萌發(fā)出的腋芽切下后放入含有TDZ，GA，6-BA，NAA，2ip 不同組合的WPM 液體培養(yǎng)基中進(jìn)行伸長培養(yǎng)，60 r·min振蕩培養(yǎng)，蔗糖濃度為30 g·L。

1.4 不同培養(yǎng)方式對萌發(fā)芽再生的影響

選擇1.3 中腋芽伸長成活率較高的激素組合，以WPM 為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加蔗糖30 g·L，瓊脂5.6 g·L，將萌發(fā)出的腋芽切下后，接入該固體培養(yǎng)基中進(jìn)行伸長培養(yǎng)，分別于6、12、18 d 記錄芽的平均高度、伸長量以及增殖率。

1.5 水曲柳腋芽萌發(fā)的生物反應(yīng)器擴(kuò)大培養(yǎng)

挑選生長健壯的水曲柳組培苗接種在3 L 氣動式球形生物反應(yīng)器中，利用空氣泵通氣，溫度25 ℃，黑暗條件下進(jìn)行休眠芽萌發(fā)的擴(kuò)大培養(yǎng)，探索腋芽萌發(fā)培養(yǎng)基及培養(yǎng)方式是否適合擴(kuò)大培養(yǎng)，以及該技術(shù)的可重復(fù)性。

1.6 水曲柳再生苗的移栽

移栽基質(zhì)選擇草炭土和蛭石3∶1比例混合，分裝在小袋中，用含有3 mg·LIBA 和4 g·L生根粉溶液進(jìn)行浸泡，使基質(zhì)完全濕潤，將生根的組培苗洗去培養(yǎng)基后栽種到上述處理好的基質(zhì)中，用拉口袋封住，密封培養(yǎng)20 d。打開密封袋，培養(yǎng)至50 d，統(tǒng)計移栽成活率。

1.7 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析使用SPSS 17.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度TDZ對水曲柳腋芽萌發(fā)的影響

在不添加TDZ 的培養(yǎng)基中水曲柳腋芽不萌發(fā)，在不同濃度的TDZ 培養(yǎng)基中水曲柳腋芽萌發(fā)情況有較大差異（見表1）。分別在培養(yǎng)7 和24 d時統(tǒng)計了腋芽的萌發(fā)情況，腋芽的萌發(fā)率隨著TDZ 濃度的增加而增加，隨著培養(yǎng)時間的延長而增加。WY2 培養(yǎng)基中腋芽萌發(fā)率從38.68%增至48.11%；WY3 培養(yǎng)基中腋芽萌發(fā)率從45.83%增至53.13%。觀察腋芽的生長形態(tài)發(fā)現(xiàn)，同一棵苗上的腋芽先從靠近培養(yǎng)基的腋芽開始萌發(fā)，依次往上直至頂芽萌發(fā)（見圖1：a～c）。觀察不同濃度TDZ 培養(yǎng)基中萌發(fā)芽生長狀態(tài)，WY1 培養(yǎng)基中腋芽萌發(fā)后長勢比較瘦弱（見圖1a），WY2 培養(yǎng)基中萌發(fā)芽長勢比較健壯飽滿，且能伸長，數(shù)量較多（見圖1b），WY3 培養(yǎng)基中形成的新芽較短，易脆，不易伸長（見圖1c）。方差分析結(jié)果顯示，=364.361，=3，<0.01，說明不同濃度TDZ 下水曲柳休眠芽萌發(fā)率差異顯著。多重比較顯示添加TDZ 與CK 之間差異顯著，WY1 與WY2 和WY3 之間差異顯著，WY2與WY3之間差異不顯著。

表1 不同濃度的TDZ對水曲柳休眠芽萌發(fā)的影響Table 1 Effects of different concentrations of TDZ on the germination of dormant buds of F.mandshurica

圖1 水曲柳組織培養(yǎng)苗腋芽萌發(fā)Fig.1 Axillary bud germination of tissue culture seedlings of F.mandshurica

2.2 不同光照條件對水曲柳腋芽萌發(fā)的影響

在光照和黑暗兩種條件下培養(yǎng)24 d，觀察統(tǒng)計結(jié)果顯示：在兩種條件下腋芽萌發(fā)率都隨著TDZ 濃度的升高而增加（見表2）。對兩種培養(yǎng)條件下萌發(fā)的芽數(shù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果顯示=0.561，=1，=0.454>0.05，說明光照和黑暗培養(yǎng)條件下水曲柳休眠芽的萌發(fā)數(shù)量差異不顯著。從芽生長的形態(tài)上觀察發(fā)現(xiàn)，在光照條件下，苗的根部會長出大量的愈傷組織，而且萌發(fā)的芽長勢上瘦小易脆，芽切下后培養(yǎng)，在基部也會長出大量的愈傷組織，大多數(shù)的芽只有葉片長大，而沒有明顯莖的伸長（見圖1：d～f），而黑暗條件下，苗上長的愈傷組織較少，芽切下后培養(yǎng)，在基部愈傷組織長的相對較少，芽均有明顯莖的伸長，而且會在新形成的莖上再形成新芽（見圖1：g～h），當(dāng)TDZ濃度為0.6 mg·L時，芽萌發(fā)長度能達(dá)到0.67 cm（見圖1h）。因此，按照新芽平均長度和生長形態(tài)對比發(fā)現(xiàn)，黑暗條件更適合水曲柳腋芽的萌發(fā)且有助于后續(xù)離體伸長培養(yǎng)。

表2 不同光照條件對休眠芽萌發(fā)的影響Table 2 Effects of different light conditions on germination of dormant buds

2.3 懸浮培養(yǎng)對水曲柳腋芽萌發(fā)的影響

根據(jù)固體培養(yǎng)基中腋芽萌發(fā)和生長情況，我們選擇TDZ 濃度為0.6 mg·L的液體培養(yǎng)基，黑暗條件下對水曲柳組培苗進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。培養(yǎng)7 d觀察發(fā)現(xiàn)液體培養(yǎng)基中腋芽100%萌發(fā)（見表3，見圖2a），繼續(xù)培養(yǎng)到24 d，比較固體和液體兩種培養(yǎng)方式對腋芽萌發(fā)的差異，液體培養(yǎng)中腋芽萌發(fā)率是固體培養(yǎng)的2.10 倍，液體培養(yǎng)中芽的平均長度為0.87 cm（見圖2b），是固體培養(yǎng)基中的1.30倍。對固體、液體不同培養(yǎng)方式中腋芽萌發(fā)的數(shù)量進(jìn)行方差分析結(jié)果顯示：=63.138，=1，<0.001，說明不同培養(yǎng)方式下水曲柳腋芽萌發(fā)數(shù)量差異顯著。因此，液體懸浮培養(yǎng)更適合水曲柳腋芽的萌發(fā)。

圖2 腋芽在液體懸浮培養(yǎng)中的萌發(fā)Fig.2 Germination of axillary buds in liquid suspension culture

表3 不同培養(yǎng)方法對水曲柳芽的影響Table 3 Effects of different culture methods on the buds of F.mandshurica

2.4 不同激素組合對萌發(fā)芽離體再生的影響

將萌發(fā)的芽切下，接種在不同激素組合的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行伸長培養(yǎng)。培養(yǎng)20 d 統(tǒng)計結(jié)果顯示（見表4），Z4培養(yǎng)基（含1.0 mg·L2ip）芽的伸長量最大為0.79 cm；其次為Z1培養(yǎng)基（含0.05 mg·LTDZ+0.6 mg·LBA），芽的伸長量為0.72 cm；Z2培養(yǎng)基（含0.05 mg·LTDZ+1.0 mg·LGA+0.6 mg·LBA）中芽的伸長量為0.61 cm；Z3培養(yǎng)基（0.6 mg·LTDZ+1.0 mg·LBA）中芽的伸長量為0.11 cm；Z5培養(yǎng)基中（含0.6 mg·LTDZ＋1.0 mg·LNAA）出現(xiàn)負(fù)伸長的現(xiàn)象，可能是由于死亡數(shù)量過多造成的。除了Z1 培養(yǎng)基，其它培養(yǎng)基中芽均有死亡現(xiàn)象，死亡率為10%～60%。對不同激素組合中芽的活性進(jìn)行方差分析，結(jié)果顯示=11.623，=4，=0.02<0.05，說明含有不同激素的液體培養(yǎng)基對水曲柳嫩芽的成活影響差異顯著。

表4 不同激素組合下不定芽的伸長和增殖Table 4 Elongation and proliferation of adventitious buds in different hormone combinations

2.5 水曲柳腋芽萌發(fā)后離體伸長培養(yǎng)

將萌發(fā)后的腋芽切下后轉(zhuǎn)接入Z1 固體培養(yǎng)基中（含0.05 mg·LTDZ+0.6 mg·LBA），隨著培養(yǎng)時間的延長，芽也逐漸增高（見表5），培養(yǎng)18 d時苗平均高度為2.64 cm，同時也有分化出新的不定芽，增殖率為44.74%。觀察苗的生長形態(tài)，此時萌發(fā)的芽長成組培苗，有獨(dú)立的主干，葉片展開，綠色，生長健壯（見圖3）。由此可見，Z1 固體培養(yǎng)基比液體培養(yǎng)基更有利于嫩芽的伸長培養(yǎng)，同時兼有增殖效果。

圖3 萌發(fā)后腋芽離體伸長培養(yǎng)a增殖苗；b單苗；c苗高Fig.3 In vitro elongation culture of axillary buds after germinationa.Has proliferated seedlings；b.Single seedlings；c.Measures seedling height

表5 水曲柳腋芽萌發(fā)后離體伸長培養(yǎng)Table 5 In vitro elongation culture of F. mandshurica buds after germination

2.6 水曲柳腋芽萌發(fā)及離體伸長培養(yǎng)技術(shù)確立

為了驗證上述繁殖技術(shù)的可重復(fù)性，將26 棵水曲柳組培苗接種到液體培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)15 d后，將萌發(fā)的腋芽切下轉(zhuǎn)入Z1 固體培養(yǎng)基伸長培養(yǎng)20 d，最終獲得105 棵水曲柳組培苗，增殖系數(shù)達(dá)到4.04。隨機(jī)選擇59 棵組培苗接種至3L 生物反應(yīng)器中培養(yǎng)15 d，腋芽全部萌發(fā)（見圖4：a～b），共181 個新芽，將芽切下接種到Z1 固體培養(yǎng)基伸長培養(yǎng)20 d，獲得水曲柳組培苗（見圖4c），增殖系數(shù)為3.67。這一結(jié)果說明液體+固體兩種培養(yǎng)方式交替使用，可以打破水曲柳腋芽休眠，并在短時間內(nèi)使休眠芽萌發(fā)、再生成新苗。

圖4 液—固交替培養(yǎng)狀態(tài)a～b.液體培養(yǎng)萌發(fā)的芽；c.萌發(fā)的芽在固體培養(yǎng)中伸長Fig.4 Liquid-solid alternate culture statea-b.The sprouting bud in liquid culture；c.The germinated buds are elongated in solid culture

2.7 水曲柳組培苗的移栽

將生根的組培苗（見圖5a）洗掉培養(yǎng)基后移栽到基質(zhì)中，用塑料袋密封20 d 左右（見圖5b），打開，半開半閉狀態(tài)培養(yǎng)1 個月后移栽成活（見圖5c），成活率達(dá)90%。

圖5 水曲柳組培苗移栽a.生根苗；b.套袋密封培養(yǎng)；c.成活的苗Fig.5 Tissue culture seedlings of F.mandshurica were transplanteda.Rooting seedlings；b.Bagged and sealed culture；c.Surviving seedlings

3 討論

目前，利用液體—固體交替培養(yǎng)打破水曲柳腋芽休眠問題，并在短時間內(nèi)獲得水曲柳組培苗的方法鮮見報道。在植物發(fā)育中細(xì)胞分裂素的作用之一就是芽的激活，隨著研究的不斷深入，許多信號元件被認(rèn)為是芽生長所必需的，在豌豆（）、擬南芥（）、矮牽?；ǎǎ┲幸呀?jīng)被證實。細(xì)胞分裂素可以促進(jìn)豌豆brc1 突變體的芽激活。植物生長素從腋芽向莖的轉(zhuǎn)運(yùn)過程可能是對蘋果（）的腋芽萌發(fā)起著至關(guān)重要的作用。抑制CK的合成和信號傳導(dǎo)并不會抑制蔗糖促進(jìn)當(dāng)代月季（）花腋芽的生長。細(xì)胞分裂素可能通過調(diào)節(jié)生長素轉(zhuǎn)運(yùn)或局部上調(diào)腋芽生長素生物合成來激活芽生長。然而，關(guān)于激素如何調(diào)節(jié)水曲柳芽生長的分子機(jī)制還鮮見報道。

TDZ 具有生長素和細(xì)胞分裂素的作用，可以誘導(dǎo)多種形態(tài)的發(fā)生，低濃度誘導(dǎo)腋芽增殖，高濃度誘導(dǎo)不定芽發(fā)育。本研究中利用單一的TDZ（0.4～0.8 mg·L）誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)，隨TDZ 濃度增加腋芽萌發(fā)率也增加，液體懸浮培養(yǎng)可使腋芽萌發(fā)率達(dá)100%。在蘋果中直接將細(xì)胞分裂素用于腋芽處可以激活腋芽的萌發(fā)。這也說明，在液體懸浮培養(yǎng)時，腋芽能夠直接接觸培養(yǎng)基，激素可以直接作用于腋芽而促使其萌發(fā)。而在固體培養(yǎng)時，植物激素是通過莖部運(yùn)輸?shù)揭秆刻?。在這個過程中可能會有其它因素導(dǎo)致了同樣的培養(yǎng)基中腋芽分化率出現(xiàn)明顯的差異。研究表明，生長素運(yùn)輸在控制芽的活性方面起中心作用，芽的生長與從芽中輸出生長素有密切的相關(guān)性。如果腋芽的活性需要植物生長素持續(xù)支持，那么試管培養(yǎng)可以間接解釋生長素在主莖中的運(yùn)動對腋芽活性的抑制。主莖中的生長素會降低莖的吸收強(qiáng)度，從而降低芽與主莖之間的生長素基本水平。如果這個水平太低，觸發(fā)正反饋信號調(diào)節(jié)，然后腋芽將保持休眠。

本研究中TDZ 只能使腋芽萌發(fā)，卻不適用于繼續(xù)伸長培養(yǎng)，因此，在腋芽離體伸長培養(yǎng)時，需要降低TDZ 濃度（0.6 mg·L降為0.05 mg·L），增加BA 濃度（0 增加到0.6 mg·L）。有研究表明，不定芽在高濃度BA 的培養(yǎng)基中長時間生長，會使植物中水分含量過高，從而影響植物的生長和再生，而降低BA 濃度（4.44～1.11μmol·L），不定芽明顯伸長。也有植物在伸長時需要增加BA 濃度，（6.7～13.3 μmol·L）萌發(fā)的芽才能伸長。在用葉片誘導(dǎo)的不定芽再生培養(yǎng)中，也是提高BA濃度（13.3μmol·L）后不定芽的伸長效果較好。

4 結(jié)論

我們開發(fā)了一種液體—固體交替培養(yǎng)水曲柳組培苗的技術(shù)，可以短時間內(nèi)使休眠芽萌發(fā)，再離體伸長培養(yǎng)獲得健壯的組培苗。該技術(shù)將為水曲柳種質(zhì)資源保存、大量繁殖及規(guī)?；a(chǎn)等應(yīng)用提供技術(shù)支持，尤其為進(jìn)一步研究水曲柳側(cè)枝分枝的調(diào)控機(jī)理奠定基礎(chǔ)。