紫芽六堡茶轉(zhuǎn)錄組SSR位點序列分析

梁燕妮， 黃銀霞， 魏詩琴， 陳秋雨

(梧州學院，廣西梧州 543002)

六堡茶因其原產(chǎn)于廣西壯族自治區(qū)梧州蒼梧縣六堡鎮(zhèn)而得名，為廣西特色優(yōu)質(zhì)的歷史名茶，并以其“紅、濃、陳、醇”的特性聞名于世。六堡茶的制作以六堡鎮(zhèn)的群體種茶樹為原料，六堡群體種茶樹為灌木型中小葉種，樹勢開展，分枝密。從芽色分，以青苗茶為主，占60%，紫芽茶占20%，茶樹紅紫色芽葉是一種特異茶葉資源，紫芽六堡茶樹由于富含花青素成為當前茶樹新品種開發(fā)利用的熱點及研究的重點。

簡單重復序列(simple sequence repeat，簡稱SSR)別稱微衛(wèi)星DNA，以1～6個堿基為核心序列，具有多態(tài)性高、重復性好、穩(wěn)定性高等特點，隨著現(xiàn)代分子技術(shù)的發(fā)展，SSR技術(shù)已廣泛應用于植物分子輔助育種、種質(zhì)資源遺傳多樣性、繪制遺傳圖譜等方面的研究中。毛娟等利用30對茶樹核心SSR引物，對3個代表性的野生和栽培大理茶居群進行遺傳分析。陳春林等從紫娟茶樹轉(zhuǎn)錄組 46 041 條單基因簇(unigene)中篩選出57 976個SSR位點，并對SSR序列的分布特征進行了分析，篩選出44對高質(zhì)量引物。班秋艷等對陜西及臨近8個省份118份茶樹資源利用表達序列標簽(EST)-SSR分子標記進行了遺傳多樣性分析。但目前尚未見針對紫芽六堡茶SSR位點的分析報告。本研究基于轉(zhuǎn)錄組測序，首次對紫芽六堡茶轉(zhuǎn)錄組SSR位點的分布及其序列特征進行分析，以期為今后紫芽六堡茶品種選育、功能基因標記等提供基礎依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

所用鮮茶葉于2021年6月采自廣西壯族自治區(qū)梧州六堡鎮(zhèn)四柳村群體種六堡茶。分別采摘1芽1葉的紫芽、綠芽六堡茶葉片，用離心管裝好，迅速放入液氮中保存。每個樣品3次重復。將采集的樣品委托深圳華大基因股份有限公司進行轉(zhuǎn)錄組測序。

1.2 SSR位點搜索

針對Raw數(shù)據(jù)，本試驗采用SOAPnuke軟件進行數(shù)據(jù)的過濾與質(zhì)控，將包含接頭污染的讀長(reads)、未知堿基N含量大于5%的reads以及質(zhì)量值低于10的堿基含量大于20%的reads去除，以獲得高質(zhì)量序列。使用Trinity對干凈讀序(clean reads)進行組裝，然后使用Tgicl對轉(zhuǎn)錄本進行聚類去冗余得到unigene。使用MISA( http：//pgrc.ipk-gatersleben.de/misa)對獲得的unigene進行SSR位點搜索，搜索標準為單堿基重復次數(shù)12次以上，雙堿基重復次數(shù)6次以上，三堿基和四堿基重復次數(shù)5次以上，五堿基和六堿基重復次數(shù)4次以上；2個SSR之間的間隔堿基數(shù)>100 bp，SSR位點距離兩端側(cè)翼序列>150 bp。使用Primer 3 對檢測到的SSR進行引物設計。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所得數(shù)據(jù)使用Excel軟件進行處理分析，包括SSR位點的出現(xiàn)頻率、基元類型、基元組成、平均距離等。其中，SSR位點出現(xiàn)頻率是搜索到的SSR總數(shù)與unigene序列總數(shù)的比值；SSR位點的平均距離是搜索到的SSR總數(shù)與總unigene長度之比，根據(jù)這些數(shù)據(jù)所反映出的特征可以對SSR 位點的分布特征和序列特征進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫芽六堡茶轉(zhuǎn)錄組中SSR 位點的分布特征

通過對紫芽六堡茶葉片進行轉(zhuǎn)錄組測序，共獲得去冗余的unigene序列 165 570 條，總長度為 240 177 233 bp，其中G+C占41.49%。利用軟件SSRFinder對這些序列數(shù)據(jù)進行搜索，共在10 058 條unigene中找到符合條件的SSR，總長為 238 833 bp，SSR位點發(fā)生的頻率為6.04%，其中，8 867 條unigene含單個SSR位點，1 191條unigene 序列含有1個以上的SSR位點。共檢出 11 482 個SSR位點，出現(xiàn)的頻率為6.93%。SSR分布的平均距離為 20.92 kb，即平均每 20.92 kb就出現(xiàn)1個SSR(表1)。

表1 轉(zhuǎn)錄組各SSR位點的分布特征

2.2 紫芽六堡茶轉(zhuǎn)錄組SSR的基元類型

紫芽六堡茶轉(zhuǎn)錄組中具有較為豐富的SSR堿基類型(表2)。其中重復率最高的為雙堿基，占SSR位點總數(shù)的55.01%，其次為三堿基、六堿基，分別占28.64%、8.22%，其他的重復堿基類型所占比例較低(圖1)。各重復堿基類型的出現(xiàn)頻率存在一定差異。主要集中在雙堿基和三堿基重復上，占總SSR的83.65%。其中，雙堿基重復類型出現(xiàn)頻率最高，為3.81%，出現(xiàn)頻率最低的是單堿基重復，僅為0.11%。從分布情況看，轉(zhuǎn)錄組中平均每20.92 kb就出現(xiàn)1個SSR，不同重復類型間平均分布距離存在差別。其中，單堿基重復的平均分布距離最長，為1 264.09 kb；其次是四堿基重復，平均分布距離為839.78 kb；雙堿基重復的平均距離最短，為38.03 kb。紫芽六堡茶轉(zhuǎn)錄組SSR位點的序列總長度為238 833 bp，平均長度為20.80 bp。

表2 紫芽六堡茶轉(zhuǎn)錄組SSR位點不同基元類型的分布狀況

2.3 紫芽六堡茶轉(zhuǎn)錄組SSR重復基元分析

紫芽六堡茶轉(zhuǎn)錄組SSR重復基元的序列特征詳見表3。由單堿基到六堿基重復基元種類數(shù)分別為 2、6、30、48、121、460 種，共667種。各堿基重復基元的數(shù)量分布不均衡，其中，單堿基重復基元數(shù)量最多的是 A/T，共186個，占SSR總位點數(shù)的1.62%，占單堿基重復基元總數(shù)的97.89%。雙堿基重復基元中，數(shù)量最多的類型是GA/TC，共 2 185 個，占SSR總位點數(shù)的19.03%，占雙堿基重復基元總數(shù)的35.45%；其次是AG/CT，共2 165個，占SSR總位點數(shù)的18.86%，占雙堿基重復基元總數(shù)的34.28%。三堿基重復基元中，數(shù)量最多的類型是GAA/TTC，共345個，占SSR總位點數(shù)的3.00%，占三堿基重復基元總數(shù)的10.49%；其次是AGA/TCT，共288個，占SSR總位點數(shù)的2.51%，占三堿基重復基元總數(shù)的8.76%。四堿基重復基元中，數(shù)量最多的類型是AAAT/ATTT，共55個，占SSR總位點數(shù)的0.48%，占四堿基重復基元總數(shù)的19.23%。

表3 SSR 位點重復的基元序列特征

五堿基重復基元中，數(shù)量最多的類型是AAAAG/CTTTT，共48個，占SSR總位點數(shù)的0.42%，占五堿基重復基元總數(shù)的10.50%。六堿基重復基元中，數(shù)量最多的類型分別是AAAAAT/ATTTTT、CAAAAA/TTTTTG、GATGAA/TTCATC，各有22個，各占SSR總位點數(shù)的0.19%，各占六堿基重復基元總數(shù)的2.33%。轉(zhuǎn)錄組中不同SSR重復基元類型的比例詳見圖2。

2.4 紫芽六堡茶轉(zhuǎn)錄組中各基元的重復次數(shù)

SSR的多態(tài)性受重復堿基序列長度的影響，而重復堿基序列長度由SSR重復次數(shù)決定。通過對紫芽六堡茶轉(zhuǎn)錄組中不同基元類型SSR位點重復出現(xiàn)次數(shù)的統(tǒng)計(表4)可知，6種基元重復次數(shù)主要集中在4～12次，重復出現(xiàn)4～12次的SSR位點數(shù)共計9 941個，占總SSR位點數(shù)的86.58%。其中，重復出現(xiàn)6次和5次的SSR位點數(shù)最多，分別占總SSR位點數(shù)的16.63%(1 910個)、15.89%(1 825個)；其次為重復7次和8次的，分別占總SSR位點數(shù)的10.53%(1 209個)、9.80%(1 125個)。統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，在重復出現(xiàn)6次的SSR位點中，雙堿基最多(1 062個)，其次是三堿基(673個)，五堿基最少(僅20個)。重復出現(xiàn)5次的SSR位點中，三堿基最多(1 375個)，四堿基、五堿基、六堿基的數(shù)量差別不大。SSR位點重復次數(shù)在12次以上的基元占總SSR位點數(shù)的13.42%。不同基元類型不同重復次數(shù)的SSR位點數(shù)分布情況見圖3。從圖3可以看出，隨著重復次數(shù)的增多，SSR位點的數(shù)量逐漸下降。

表4 不同基元類型不同重復次數(shù)的SSR 位點數(shù)量

2.5 紫芽六堡茶轉(zhuǎn)錄組SSR重復片段的長度分布

紫芽六堡茶轉(zhuǎn)錄組SSR重復片段的長度分布情況見圖4。SSR序列長度變化在12～70 bp之間，平均長度為20.80 bp。其中長度為24 bp的SSR位點數(shù)最多，共有1 838個，占SSR總數(shù)的16.01%。長度在12～20 bp的SSR有6 424個，占SSR總數(shù)的55.95%；>20 bp的SSR有5 058個，占SSR總數(shù)的44.05%。雙堿基中最常見的長度是12 bp(1 021個，9.24%)，長度變化幅度最大，最小為 12 bp 最長為70 bp。三堿基中最多的長度為15 bp(1 375個，11.98%)。四堿基、五堿基均以20 bp為主，分別有186(1.62%)、307(2.67%)個。六堿基中長度以24 bp(668個，5.82%)數(shù)量最多。

3 討論與結(jié)論

通過對紫芽六堡茶進行轉(zhuǎn)錄組測序，共獲得165 570 條unigene序列，總長度為240 177 233 bp，共搜索到11 482個SSR位點，出現(xiàn)頻率為6.93%，略低于楊華等報道的茶樹轉(zhuǎn)錄組中SSR位點出現(xiàn)頻率(9.64%)，但高于南方紅豆杉(2.07%)、杜仲(2.90%)、短絲木樨(4.64%)、銀杏(5.95%)、馬尾松(3.45%)、云南松(3.07%)、甘薯(4.4%)等植物。紫芽六堡茶轉(zhuǎn)錄組SSR分布的平均距離為20.92 kb，分布水平高于云南松(29.00 kb)、杜仲(26.31 kb)、藤茶(31.69 kb)等植物。與其他已報道的茶樹比較(表5)可知，紫芽六堡茶的SSR位點出現(xiàn)頻率和平均距離與其他茶樹存在較大差異，這可能與本研究中搜索SSR的算法不一致、數(shù)據(jù)處理方法不同、以及進化程度不同等因素有關(guān)?？傮w來說，紫芽六堡茶轉(zhuǎn)錄組中SSR位點的種類和數(shù)量還是較為豐富的，可為今后分子育種提供依據(jù)。

表5 不同茶樹品種SSR位點信息比較

大多數(shù)研究表明，植物SSR重復基元以雙堿基與三堿基重復為主。本研究發(fā)現(xiàn)紫芽六堡茶轉(zhuǎn)錄組SSR重復基元以雙堿基重復最多，占SSR位點總數(shù)的55.01%，其次為三堿基重復，占SSR位點總數(shù)的28.64%，這與陳春林等報道的茶樹SSR優(yōu)勢重復類型一致。銀杏、獼猴桃、杏樹和桃樹等植物也是以雙堿基重復為主。而玉米、水稻、小麥等禾谷類作物則以三堿基重復為主。經(jīng)統(tǒng)計，紫芽六堡茶單堿基的優(yōu)勢重復基元為A/T，與已報道的大多茶樹單堿基優(yōu)勢重復基元一致；雙堿基的優(yōu)勢重復基元為GA/TC，而已報道的茶樹中則多以AG/CT為主；三堿基的優(yōu)勢重復基元為GAA/TTC，與龍井43一致；四堿基的優(yōu)勢重復基元為AAAT/ATTT，與龍井43、舒茶早、云抗10號、紫鵑等茶樹一致；五堿基的優(yōu)勢重復基元為AAAAT/ATTTT，與舒茶早、云抗10號一致；六堿基的優(yōu)勢重復基元為AAAAAT/ATTTTT，與云抗10號一致(表6)。表明基于轉(zhuǎn)錄組測序得到的SSR位點中可能普遍大量存在這類重復基元，推測可能是某些特定的DNA家族或者輔助合成某些優(yōu)勢蛋白。此外，在搜索到的紫芽六堡茶SSR位點中還發(fā)現(xiàn)了在高等植物轉(zhuǎn)錄組中較為少見的CG/GC 重復基元11個，以及在雙子葉植物中不常見的CCG/CGG重復基元45個，這些位點可能與一些特定的生理功能，如抗逆性、信號傳導、代謝調(diào)控等有關(guān)，表明紫芽六堡茶的SSR位點具有一定的特異性。

表6 不同茶樹品種SSR位點重復基元序列最多的堿基組成

有研究認為，SSR的多態(tài)性與SSR基元重復次數(shù)及序列長度密切相關(guān)。一般認為重復次數(shù)越多，長度越長，多態(tài)性越高，當重復次數(shù)>12次時，多態(tài)位點含量高，紫芽六堡茶基元重復次數(shù)在12次以上的占13.42%。當SSR長度在12～20 bp之間時，多態(tài)性表現(xiàn)一般；當SSR長度>20 bp時，則具有較高的多態(tài)性。紫芽六堡茶轉(zhuǎn)錄組的SSR平均長度為20.80 bp，其中序列長度>20 bp的占44.05%，高于四球茶(33.22%)、龍井43(19.77%)以及舒茶早(8.65%)。表明紫芽六堡茶轉(zhuǎn)錄組SSR具有很高多態(tài)性和利用價值。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，紫芽六堡茶的SSR種類豐富、可用性高、多態(tài)性高?？蔀檫M一步開發(fā)紫芽六堡茶功能基因SSR分子標記奠定基礎，對六堡茶種質(zhì)資源的保護及茶樹特定性狀的輔助選育、基因組學的研究等方面都具有重要的意義。