6種細(xì)菌對(duì)蘋果炭疽葉枯病病菌的抑制作用

于占晶， 侯曉杰， 高群英， 孫文清， 劉海鵬， 梁魁景

(衡水學(xué)院生命科學(xué)系，河北衡水 053000)

我國(guó)是蘋果生產(chǎn)第一大國(guó)，蘋果種植面積和產(chǎn)量均位于世界首位，是具有明顯國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力的農(nóng)產(chǎn)品之一。蘋果病害的發(fā)生給果農(nóng)造成重大損失，蘋果炭疽葉枯病是近年來(lái)發(fā)生在蘋果葉片和果實(shí)上的一種病害，也是目前流行速度最快的一種病害。此病害最早在巴西發(fā)現(xiàn)，后在美國(guó)也有發(fā)生。我國(guó)于2010年首次在江蘇省徐州市豐縣發(fā)現(xiàn)此病害，目前，在山東、河南、江蘇、安徽、河北等各大蘋果產(chǎn)區(qū)都有發(fā)生。李保華教授對(duì)病菌進(jìn)行分離、培養(yǎng)和鑒定，確定該病是由炭疽菌引起的。該病菌在果苔枝和一年生的瘦弱枝上越冬，5月當(dāng)氣溫超過(guò) 15 ℃，枝條潤(rùn)濕超過(guò)48 h，越冬病菌開(kāi)始產(chǎn)孢，進(jìn)行初侵染，8月中下旬達(dá)發(fā)病高峰，發(fā)病時(shí)葉片呈現(xiàn)干枯的棕褐色病斑，枯葉如同被水燙過(guò)一樣，高溫高濕條件下，病斑擴(kuò)展迅速，病重葉片很快脫落。果實(shí)發(fā)病時(shí)呈現(xiàn)圓形褐色凹陷病斑，病斑周圍有紅色暈圈，病斑下果肉呈褐色海綿狀，深約 2 mm，嚴(yán)重時(shí)病果率達(dá)100% 。10月份隨氣溫下降，發(fā)病減緩。

目前生產(chǎn)上對(duì)于蘋果炭疽葉枯病的主要防治方法有：一是合理疏枝，使果園具有較好的透風(fēng)性；二是利用化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行治療，防止病菌大范圍侵染。但在實(shí)際應(yīng)用中栽培措施見(jiàn)效慢，防治過(guò)程中只可起到輔助作用；化學(xué)防治方法對(duì)于果實(shí)有嚴(yán)重的農(nóng)藥殘留，對(duì)人體健康產(chǎn)生危害。因此，采取一種高效、無(wú)毒、無(wú)污染的防治策略將成為研究防治蘋果炭疽葉枯病的重中之重。生物防治成為新的研究熱點(diǎn)，國(guó)內(nèi)已有一些植物內(nèi)生菌、土壤中篩選拮抗菌的研究，陳照等發(fā)現(xiàn)HAB-9菌株對(duì)檳榔炭疽病病菌等植物的抑菌作用有很大的不同，平均抑制率達(dá)到60.72%；抑制檳榔炭疽菌的效果相對(duì)明顯，平均抑制率達(dá)到70.60%；對(duì)黃瓜炭疽病病菌的抑制效果最不突出，抑菌率是50.21%。筆者從蘋果、姜中分離出一些內(nèi)生菌菌株，并從健康果園土壤中分離得到一些菌株，經(jīng)過(guò)初篩得到6株對(duì)蘋果炭疽葉枯病病菌有抑制作用的菌株，本研究旨在通過(guò)進(jìn)一步抑菌測(cè)定明確這6個(gè)菌株對(duì)病原菌的抑制效果，為下一步防治打下理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試細(xì)菌 J4(枯草芽孢桿菌，)、J6、T4、T7、P2、ZJ01(解淀粉芽孢桿菌，)，由衡水學(xué)院生命科學(xué)系園林植物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供，其中J4、J6從姜中得到，T4、T7從健康蘋果園土壤中分離得到，P2從蘋果中分離得到，ZJ01從棗葉片中分離得到，部分菌株還未鑒定。

1.1.2 供試病原菌 蘋果炭疽葉枯病病菌()，由衡水學(xué)院生命科學(xué)系園林植物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 供試培養(yǎng)基 采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)瓊脂(NA)培養(yǎng)基對(duì)蘋果炭疽葉枯病病菌和幾種細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)。

1.1.4 試驗(yàn)時(shí)間和地點(diǎn) 試驗(yàn)于2020年在衡水學(xué)院園林植物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌活化培養(yǎng) 從冰箱中取出備用細(xì)菌，用劃線法在NA培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)，用滅過(guò)菌的接種環(huán)蘸取細(xì)菌甘油溶液，“之”字形劃線到培養(yǎng)基上，置于28 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～5 d，備用。

1.2.2 蘋果炭疽葉枯病病菌的復(fù)壯 將保存在冰箱中的蘋果炭疽葉枯病病菌在PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，倒置于28 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～5 d，觀察病原菌的生長(zhǎng)狀況，備用。

1.2.3 蘋果炭疽葉枯病病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制測(cè)定 采用對(duì)峙培養(yǎng)法：在超凈工作臺(tái)上，用直徑為 6 mm 的打孔器打取蘋果炭疽葉枯病病菌菌落，倒置于PDA平板中央，用接種環(huán)蘸取細(xì)菌，在距離病原菌菌餅上下2.5 cm的地方分別劃線，每種細(xì)菌重復(fù)3次，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照。于28 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，48 h開(kāi)始測(cè)量記錄數(shù)據(jù)，每隔24 h記錄1次，培養(yǎng)至5 d。觀察菌落生長(zhǎng)情況，在距離菌餅中心左右各1 cm的地方分別測(cè)量抑菌帶的寬度求平均值，計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率。

抑菌率=(對(duì)照菌落直徑-處理抑菌帶寬度)/對(duì)照菌落直徑×100%。

1.2.4 蘋果炭疽葉枯病病菌孢子萌發(fā)的抑制測(cè)定 孢子懸浮液的制備：取培養(yǎng)5～7 d的蘋果炭疽葉枯病病菌，加入10 mL無(wú)菌水，用滅菌玻璃涂菌環(huán)輕輕地將病原菌的孢子刮到無(wú)菌水中，用濾紙過(guò)濾搖勻，在10×10倍的顯微鏡下觀察孢子數(shù)量，每個(gè)視野約有50～60個(gè)孢子為宜，備用。

抑菌圈法測(cè)定病原菌孢子萌發(fā)：用移液槍吸取200 μL孢子懸浮液加到凝固的PDA平板上，用玻璃涂菌環(huán)涂抹均勻，晾干，用直徑為6 mm打孔器分別打取細(xì)菌菌落，將菌塊倒扣接種到PDA平板中央。置于28 ℃恒溫生化箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)48 h開(kāi)始測(cè)量記錄數(shù)據(jù)，每隔24 h記錄1次，培養(yǎng)至5 d，用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑。

1.3 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用Excel 2010軟件處理數(shù)據(jù)，用SPSS 16.0軟件進(jìn)行方差分析，差異顯著性水平為5%(<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 6種細(xì)菌對(duì)蘋果炭疽葉枯病病菌菌絲生長(zhǎng)的影響

如圖1所示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，作為對(duì)照的蘋果炭疽葉枯病病菌菌落直徑逐漸增加，6種細(xì)菌對(duì)病原菌的菌絲生長(zhǎng)均表現(xiàn)出了不同程度的抑制作用，均產(chǎn)生抑菌帶且抑菌帶寬度不等。T4處理產(chǎn)生的抑菌帶寬度最小，相對(duì)抑制效果最好，其次是T7、P2、ZJ01、J6，效果相對(duì)較差的細(xì)菌是J4。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，菌落直徑有所增加，但增長(zhǎng)幅度較小。

2.2 6種細(xì)菌對(duì)蘋果炭疽葉枯病病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

6種細(xì)菌對(duì)蘋果炭疽葉枯病病菌均有抑制作用，產(chǎn)生了明顯的抑菌帶，抑菌帶寬度不同抑制率也有所不同(圖2)。由表1可見(jiàn)，6種細(xì)菌對(duì)蘋果炭疽葉枯病病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制效果不同，與對(duì)照之間均有顯著性差異。其中T4的抑制效果最好，抑菌率高達(dá)64.10%， 除與T7差異不顯著外， 與其他幾種細(xì)菌之間都有顯著差異；T7、 P2、ZJ01、J6抑制效果次之，抑菌率分別為61.54%、60.64%、60.26%、59.83%，它們之間無(wú)顯著性差異；J4抑制效果相對(duì)較差，但抑菌率也達(dá)到了58.59%，與T4和T7抑菌率差異顯著，與其他細(xì)菌之間無(wú)顯著性差異。

表1 6種細(xì)菌對(duì)蘋果炭疽葉枯病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率

2.3 6種細(xì)菌對(duì)蘋果炭疽葉枯病病菌孢子萌發(fā)的影響

如圖3所示，6種細(xì)菌對(duì)病原菌的孢子萌發(fā)表現(xiàn)出了不同的作用，對(duì)照長(zhǎng)滿培養(yǎng)基表面，6種細(xì)菌處理下均有抑菌圈產(chǎn)生，但直徑大小不同。ZJ01抑菌圈直徑最大，T7、T4、J4、P2稍差，J6直徑最小。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，J4處理下抑菌圈直徑幾乎無(wú)變化，P2直徑先增大后減小，其他幾種細(xì)菌處理下抑菌圈直徑有增長(zhǎng)的趨勢(shì)，但增長(zhǎng)緩慢，說(shuō)明6種細(xì)菌對(duì)病原菌孢子萌發(fā)能產(chǎn)生抑制作用，且能保持抑制性。

2.4 6種細(xì)菌對(duì)蘋果炭疽葉枯病病菌孢子萌發(fā)的抑制作用

6種細(xì)菌對(duì)蘋果炭疽葉枯病病菌均產(chǎn)生了抑制作用，有抑菌圈產(chǎn)生(圖4)，其中ZJ01、T7、T4、J4和P2抑菌圈透明，邊緣清晰，J6抑菌圈邊緣模糊，抑菌圈不明顯。

對(duì)培養(yǎng)至5 d的抑菌圈直徑進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表2。對(duì)照長(zhǎng)滿了菌落，ZJ01、T7、T4、J4、P2對(duì)蘋果炭疽葉枯病病菌孢子萌發(fā)均有較好的抑制作用，抑菌圈直徑分別為為2.58、2.42、2.37、2.32、2.30 cm，它們之間無(wú)顯著性差異，與J6和對(duì)照之間差異顯著。J6抑制效果較差，抑菌圈直徑僅為 1.20 cm，與其他菌株和對(duì)照均有顯著性差異。

表2 6種細(xì)菌對(duì)蘋果炭疽葉枯病病菌的抑菌圈直徑

3 結(jié)論與討論

在綠色防控理念的指導(dǎo)下，安全、高效、無(wú)殘留毒性的生物防治成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)，認(rèn)知真菌的傳播規(guī)律，積極采取以預(yù)防為主的措施可以切斷病原快速傳播的途徑。蘋果炭疽葉枯病是一種新興病害，對(duì)此病菌生物防治的研究現(xiàn)在尚處于起步階段。本研究測(cè)定了6種生防細(xì)菌對(duì)蘋果炭疽葉枯病病菌的抑制作用，得出T4、T7、P2、ZJ01、J6、J4對(duì)蘋果炭疽葉枯病病菌菌絲生長(zhǎng)抑制效果較好，尤其是T4和T7，抑制率分別高達(dá)64.10%和61.54%；而ZJ01、T7、T4、J4、P2對(duì)孢子萌發(fā)具有較好的抑制作用，其中ZJ01、T7、T4抑制圈平均直徑分別為2.58、2.42、2.37 cm。且這6個(gè)菌株對(duì)病原菌的抑制作用持續(xù)性較強(qiáng)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制效果并未減弱。綜合分析顯示，T4和T7對(duì)菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)均表現(xiàn)出了較好的抑制效果，這2個(gè)菌株均是從健康蘋果園土壤中分離得到的，這與前人一些研究結(jié)果類似。韓雨桐等從小麥根際土壤中分離獲得一株拮抗細(xì)菌Sc2，對(duì)稻瘟病病菌抑菌率達(dá)73.44%。劉力偉等發(fā)現(xiàn)熒光假單胞菌SS101菌株對(duì)不同蘋果產(chǎn)區(qū)9株病原菌的菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)具有顯著的抑制作用，在田間對(duì)再植病害也有良好的防控效果。

近年來(lái)國(guó)內(nèi)外廣泛利用拮抗微生物及其代謝產(chǎn)物來(lái)抑制病原菌的生存和活動(dòng)，其中拮抗細(xì)菌因其自身種類和數(shù)量多、對(duì)病原菌作用方式廣、繁殖速度快等特點(diǎn)在植物病害防治中起到非常重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌對(duì)蘋果輪紋病、桃和油桃褐腐病、西瓜枯萎病等都有明顯的抑制效果。下一步會(huì)利用菌體形態(tài)和菌落特征觀察、生理生化試驗(yàn)和16S rDNA序列同源性分析，對(duì)T4和T7菌株進(jìn)行分類鑒定，同時(shí)對(duì)這2個(gè)菌株進(jìn)行發(fā)酵條件的優(yōu)化，研究代謝產(chǎn)物對(duì)病害的生防效果，為后續(xù)T4和T7菌株的工業(yè)化開(kāi)發(fā)及田間應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。