孫 璐，張 靜，尹 苗,2，程耀蝶，代 錕，吳 倩,2，趙 洪,2，陳希文,2

(1.綿陽師范學(xué)院，動(dòng)物疫病防控與健康養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，綿陽 621000；2.四川生豬重大疫病監(jiān)測與防控工程研究中心，綿陽 621000)

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的以發(fā)熱、厭食、妊娠母豬出現(xiàn)流產(chǎn)、死胎等為主要癥狀的疫病。隨著養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，該病的患病幾率也日益增長，PRRS癥狀復(fù)雜，難以控制[1]，一旦感染了PRRSV，扁桃體、上呼吸道及肺臟的巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞等會(huì)被破壞，造成肺損傷和機(jī)體免疫抑制，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌等病菌入侵機(jī)體導(dǎo)致豬死亡的風(fēng)險(xiǎn)就會(huì)大大增加，給養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重危害。目前用于防制PRRSV的主要措施是接種疫苗，主要有滅活苗和弱毒苗兩種[2]，但兩種疫苗的臨床效果均不理想。因此，篩選有效的抗PRRSV和抑菌的藥物是控制PRRSV的重要途徑。

中草藥屬于純天然產(chǎn)物，可以在不傷害機(jī)體的前提下直接殺死細(xì)菌和抑制病毒，不易產(chǎn)生耐藥性，對機(jī)體毒副作用小[3]。大腸桿菌病、金黃色葡萄球菌病和PRRS均屬于外感溫?zé)岵》懂牐騽?dòng)物所患疾病通常是由細(xì)菌和病毒混合感染引起，所以中藥的聯(lián)合使用及使用復(fù)方成為了必然[4]。瀉心湯、黃連解毒湯、三黃虎杖湯及清瘟敗毒散在方劑中屬于清熱解毒類，現(xiàn)代的藥理學(xué)研究初步證明了清熱解毒復(fù)方中草藥具有多種作用，可以抗病毒、調(diào)節(jié)免疫功能及抗菌等[5-6]。本試驗(yàn)探究了4種清熱解毒復(fù)方中草藥抗PRRSV和體外抑菌活性，以期為臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 中草藥

黃芩(山西，批號(hào)：201004)、黃柏(四川，批號(hào)：20081405)、梔子(四川，批號(hào)：200708)、青黛(福建，批號(hào)：190102813)、荊芥(四川，批號(hào)：200701)、防風(fēng)(內(nèi)蒙古，批號(hào)：200222)、羌活(四川，批號(hào)：201201)、大黃(四川，批號(hào)：202008104)、黃連(四川，批號(hào)：202011076)、虎杖(湖北，批號(hào)：B806251-01)均購自綿陽高新區(qū)凱立大藥房。4種清熱解毒復(fù)方組分及比例見表1。

表1 4種清熱解毒復(fù)方組成

1.2 主要試劑及儀器

LB培養(yǎng)基、平板計(jì)數(shù)瓊脂(PCA)、0.25%胰蛋白酶、低血清培養(yǎng)基等均購自綿陽市匯億鑫科技有限公司；One Step PrimeScript Ⅲ RT-qPCR Mix、RNase-free ddH2O均購自寶生物工程(大連)有限公司。

CO2培養(yǎng)箱購自賽默飛世爾(蘇州)儀器有限公司；核酸提取儀購自濟(jì)凡生物科技(常州)有限公司；倒置顯微鏡(Nikon)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀均購自上海亞榮生化儀器廠；熒光定量PCR分析儀購自杭州博日科技股份有限公司；振蕩培養(yǎng)箱購自上海知楚儀器有限公司。

1.3 供試細(xì)菌和病毒

標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸桿菌ATCC 25922、金黃色葡萄球菌ATCC 25923、PRRSV均由綿陽師范學(xué)院動(dòng)物疫病防控與健康養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心保存。

1.4 中草藥提取

稱取干燥后的單味中草藥各50 g，加入500 mL蒸餾水，浸泡30 min后煎煮，沸騰后保持微沸狀態(tài)煎煮1 h[7]，8層醫(yī)用紗布過濾；濾渣中加入300 mL蒸餾水，煎煮至沸騰后再保持微沸30 min，合并2次水煎提取的濾液；將濾液蒸發(fā)濃縮直至成為浸膏，再將浸膏烘干、粉碎。按4種復(fù)方的配比配制成初始濃度為250 mg/mL的藥液，高壓蒸汽滅菌鍋121 ℃滅菌15 min[8]，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 體外抑菌試驗(yàn)

1.5.1 菌懸液制備 將保存的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌活化后，接種于LB肉湯培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)18～24 h[9]。用生理鹽水稀釋細(xì)菌濃度直至108CFU/mL，作為試驗(yàn)所需濃度。

1.5.2 體外抑菌活性的測定 每15支EP管為一組。在2～14號(hào)管中各加入500 μL無菌LB肉湯，1號(hào)管中加入1 000 μL 250 mg/mL的藥液，取出500 μL加入2號(hào)管，吹打混勻，重復(fù)操作，直至12號(hào)，依次獲得62.50、31.25、15.63、7.81、3.90、1.95、0.98、0.49、0.24、0.12 mg/mL的藥液，在1～12號(hào)管中每管加入50 μL 108CFU/mL的菌懸液；13號(hào)管作為空白對照，14號(hào)管中加入50 μL菌懸液作為陽性對照，15號(hào)管中加入500 μL藥液和50 μL生理鹽水作為陰性對照，渦旋混勻，37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h后觀察混濁程度。將藥液和細(xì)菌的混合液每個(gè)濃度取2 μL點(diǎn)樣于LB平板上，每一組點(diǎn)樣3個(gè)平板作為對照，肉眼觀察LB平板是否有細(xì)菌生長，將無菌生長的最小濃度作為該中草藥的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)[10]。

選出無菌生長的濃度，吸取菌藥液100 μL涂布于平板計(jì)數(shù)瓊脂上，設(shè)置3個(gè)平行對照，37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h后對平板進(jìn)行計(jì)數(shù)[11]，3個(gè)平行對照取平均值，以菌落總數(shù)<5的最低濃度作為該中草藥的最小殺菌濃度(minimum bactericidal concentration，MBC)[12]。

1.6 體外抗PRRSV試驗(yàn)

1.6.1 復(fù)方中草藥對Marc-145細(xì)胞最大安全濃度的測定 用細(xì)胞維持液將復(fù)方中草藥從初始濃度250 mg/mL二倍倍比稀釋到2-10，依次加到長成單層Marc-145細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，每孔100 μL，各稀釋度均重復(fù)4孔，設(shè)置細(xì)胞對照[13]。在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，將96孔細(xì)胞板放在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞病變情況[14]，以4孔均不出現(xiàn)病變?yōu)樽畲蟀踩珴舛萚15]。

1.6.2 病毒半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量的測定 將待測病毒進(jìn)行10倍稀釋，直至10-6，加到長滿單層Marc-145細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，每孔100 μL，每個(gè)稀釋度重復(fù)8孔，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，通過Reed-Muench法計(jì)算病毒液的半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(median tissue culture infective dose,TCID50)[16]。

距離比例=(高于50%的病變率-50%)/(高于50%病變的病變率-低于50%的病變率)

TCID50=高于50%病變的病毒最高稀釋度的對數(shù)+距離比例

1.6.3 中草藥對病毒吸附細(xì)胞的阻斷作用 以復(fù)方最大安全濃度為初始濃度，用細(xì)胞維持液二倍倍比稀釋復(fù)方后，加在長滿單層細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL，每個(gè)稀釋濃度重復(fù)4孔，37 ℃培養(yǎng)4 h后棄去原液；每孔中再加入100 μL 100 TCID50的病毒液，培養(yǎng)2 h[17]，棄去液體；每孔加入100 μL維持液，培養(yǎng)72 h，設(shè)置病毒對照。

1.6.4 中草藥對病毒合成復(fù)制的抑制作用 在長成單層Marc-145細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入100 μL 100 TCID50病毒液，37 ℃吸附2 h；加入不同稀釋度的中草藥稀釋液，每孔100 μL，重復(fù)4孔，37 ℃培養(yǎng)4 h后[17]，棄去原液；加入100 μL維持液，培養(yǎng)72 h，設(shè)置病毒對照。

1.6.5 中草藥對病毒的直接殺滅作用 將不同稀釋度的中草藥與等體積的100 TCID50病毒液混合，加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，37 ℃作用4 h，棄去混合液；加100 μL維持液，培養(yǎng)72 h[18]，重復(fù)4孔，設(shè)置病毒對照。

1.6.6 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測 通過自動(dòng)核酸提取儀提取病毒RNA，參考路斌等[19]設(shè)計(jì)引物和探針，上游引物：5′-GCTAGGCCGCAAGT-ACATWC-3′；下游引物：5′-ATCATTTGCCGC-AATCG-3′；探針：5′-CCCCTGCCCACCACGTY-GECLIPSE-3′。引物及探針均由北京華大基因研究中心合成。

PCR反應(yīng)體系15 μL：One Step PrimeScript Ⅲ RT-qPCR Mix 7.5 μL，上、下游引物及探針各0.5 μL，RNase-free ddH2O 4 μL，RNA模板2 μL。PCR擴(kuò)增程序：52 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。檢測結(jié)果成立的標(biāo)準(zhǔn)是陽性對照FAM熒光Ct值<38，陰性對照無信號(hào)。若中草藥復(fù)方對病毒無抑制作用，則樣品中會(huì)含有病毒核酸，導(dǎo)致出現(xiàn)Ct值和特異的擴(kuò)增曲線；若中草藥復(fù)方對病毒有抑制作用，則樣品中無病毒核酸，不會(huì)出現(xiàn)Ct值和特異擴(kuò)增曲線，從而得出中草藥抗病毒效果。

2 結(jié) 果

2.1 4種復(fù)方中草藥的體外抑菌活性

由表2可知，4種復(fù)方中草藥的體外抑菌活性差異較大，其中瀉心湯對大腸桿菌的抑菌活性最強(qiáng)，MIC和MBC均為7.81 mg/mL；其次是黃連解毒湯和三黃虎杖湯，黃連解毒湯MIC為31.25 mg/mL，MBC為62.50 mg/mL，三黃虎杖湯MIC為62.5 mg/mL，MBC為125 mg/mL；清瘟敗毒散對大腸桿菌沒有明顯的抑制效果。 瀉心湯、黃連解毒湯和三黃虎杖湯對金黃色葡萄球菌的體外抑菌活性較好，瀉心湯和三黃虎杖湯的MIC均為0.24 mg/mL，MBC均為0.49 mg/mL；黃連解毒湯的MIC為0.49 mg/mL，MBC為0.98 mg/mL；清瘟敗毒散的體外抑菌活性較差，MIC和MBC均為125 mg/mL。

表2 4種復(fù)方中草藥對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的體外抑菌活性

2.2 4種復(fù)方中草藥在Marc-145細(xì)胞上的最大安全濃度

觀察細(xì)胞病變情況，結(jié)果表明，黃連解毒湯對細(xì)胞的毒害性最小，最大安全濃度為3.90 mg/mL，其次為清瘟敗毒散(表3)。

表3 4種復(fù)方中草藥在細(xì)胞上的最大安全濃度

2.3 PRRSV的TCID50

經(jīng)過5 d的培養(yǎng)，稀釋度在10-3至10-4時(shí)，50%的細(xì)胞孔出現(xiàn)了病變；當(dāng)稀釋度為10-1和10-2時(shí)，全部的細(xì)胞孔均出現(xiàn)病變；當(dāng)稀釋度為10-3時(shí)，8個(gè)細(xì)胞孔中有5個(gè)細(xì)胞孔發(fā)生了細(xì)胞病變，當(dāng)稀釋度10-4時(shí)，8個(gè)細(xì)胞孔中只有3個(gè)細(xì)胞孔發(fā)生病變，利用Reed-Muench法計(jì)算出PRRSV的TCID50為10-3.6(表4)。

表4 PRRSV的TCID50

2.4 4種復(fù)方中草藥的抗病毒試驗(yàn)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，陽性對照的Ct值為32.18，3種作用下不同復(fù)方中草藥抗病毒結(jié)果見表5。由表5可知，阻斷作用中，瀉心湯在1/4和1/8最大安全濃度都出現(xiàn)了病毒Ct值，分別為36.80和35.02，而在最大安全濃度和1/2最大安全濃度下無Ct值，說明在1/2最大安全濃度(0.24 mg/mL)下，瀉心湯對PRRSV有阻斷作用，三黃虎杖湯在0.12 mg/mL有阻斷效果，黃連解毒湯和清瘟敗毒散均在0.98 mg/mL對PRRSV有較好的阻斷作用；4種復(fù)方中草藥對病毒的抑制作用和直接殺滅作用都未出現(xiàn)Ct值，說明4種復(fù)方中草藥對PRRSV的抑制作用和直接殺滅作用較好。

表5 4種復(fù)方中草藥抗病毒作用

3 討 論

大腸桿菌病、金黃色葡萄球菌病和PRRS是養(yǎng)殖中常見的疾病，都屬于外感溫?zé)岵》懂?，治療則以清熱解毒中草藥為主。瀉心湯具有瀉火解毒、燥濕泄熱的作用[20-21]；黃連解毒湯主治火熱實(shí)證[22]，主要用于清熱解毒[23]；三黃虎杖湯主要具有清熱解毒、活血化瘀的功能，清瘟敗毒散能清熱解毒、瀉火通便[24]，所以本試驗(yàn)選取了這4種組方較為簡單的復(fù)方中草藥進(jìn)行體外的抑菌抗病毒研究。

在抑菌方面，中藥的一些成分能直接破壞細(xì)菌最外面的細(xì)胞膜和細(xì)胞壁，導(dǎo)致細(xì)菌自身的代謝出現(xiàn)紊亂，達(dá)到在體外抑制致病菌的效果[25]。王鈺雄等[26]研究中瀉心湯對普通耐藥金黃色葡萄球菌的MIC為0.3125 mg/mL，與本試驗(yàn)中瀉心湯對金黃色葡萄球菌的結(jié)果相近，可能是因?yàn)榇簏S、黃連、黃芩3種中草藥都有一定的抑菌效果[27]，大黃中含有的大黃酸、黃芩中含有的黃芩素均能夠使細(xì)胞通透性增大，造成細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)容物流出，最終導(dǎo)致致病菌死亡[28]。本試驗(yàn)中黃連解毒湯對大腸桿菌抑菌活性MIC和MBC分別為31.25和62.5 mg/mL，與呂顏枝等[29]研究黃連解毒湯對雞大腸桿菌的MIC為250 mg/mL結(jié)果相近。耿梅英等[30]研究發(fā)現(xiàn)，清瘟敗毒散提取液對金黃色葡萄球菌ATCC 25923的MIC為8 mg/mL，抑菌效果較好，其所用的清瘟敗毒散主要藥物為黃連、金銀花、連翹、甘草、丹皮，而本研究中的清瘟敗毒散組方與之不同，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抑制效果較差?？赡苁且?yàn)楸驹囼?yàn)采用的是最為傳統(tǒng)的水煎法，但是有些中藥成分是不溶于水的，熱穩(wěn)定性也不好，所以提取出的有效成分有限，而這些有效成分之間產(chǎn)生了頡頏作用，導(dǎo)致其抑菌效果較差。

在抗病毒方面，4種復(fù)方中草藥主要成分為黃連和黃芩，黃連主要成分為生物堿，具有清熱解毒、抗菌、抗病毒等作用；黃芩有效成分為黃芩苷、黃芩素等黃酮類物質(zhì)，具有除熱、抗炎及抗菌等功效[31]。4種復(fù)方中草藥對病毒均有阻斷作用，可能是因?yàn)槠渲械亩嗵?、三萜類等生物活性成分干擾病毒蛋白和RNA的合成或與病毒直接結(jié)合，抑制病毒復(fù)制或破壞其結(jié)構(gòu)有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，大黃、黃柏等單味中藥可以直接抗病毒[32]；黃芩具有抗PRRSV的作用[33]；黃連的提取液可以抑制RNA聚合酶發(fā)揮抗病毒的作用[34]，均與本研究結(jié)果相近。4種復(fù)方中草藥的抑制作用和直接殺滅均較好，可能是因?yàn)閱挝吨兴幹g產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，復(fù)方可以通過抑制病毒的黏附、合成等機(jī)制發(fā)揮抗病毒作用[35]。但是4種復(fù)方中草藥的組分均非單一活性成分，起關(guān)鍵作用的是哪一成分或是多靶點(diǎn)協(xié)同的抗病毒作用有待進(jìn)一步研究[36]。冼瓊珍等[37]研究發(fā)現(xiàn)，黃芩、黃連及黃柏對PRRSV有較好的阻斷作用，其中黃芩和黃連的抑制作用比阻斷作用好，但是黃柏和黃連幾乎對PRRSV沒有直接滅活的作用。唐耀平等[38]研究發(fā)現(xiàn)，清瘟敗毒散對高致病性PRRSV的預(yù)防和治療的有效率達(dá)75%。本試驗(yàn)結(jié)果表明，4種復(fù)方中草藥在體外的抗病毒效果均較好，但中藥中能夠抗病毒的成分很少[39]，所以還需要進(jìn)行更深入的研究。

本研究采用傳統(tǒng)方法提取4種清熱解毒復(fù)方中草藥活性成分，以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和PRRSV作為病原體在體外進(jìn)行了抑菌抗病毒試驗(yàn)并取得了良好效果，但由于中草藥成分復(fù)雜，相關(guān)作用機(jī)制研究有限，且進(jìn)入機(jī)體內(nèi)后還會(huì)受到溫度、pH、作用部位及宿主健康狀況等多種因素影響，因此若要實(shí)現(xiàn)中藥普及應(yīng)用于獸醫(yī)臨床還需要進(jìn)一步深入的研究。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，4種清熱解毒復(fù)方中草藥中瀉心湯體外抑菌及抗PRRSV的效果最好，其次是三黃虎杖湯、黃連解毒湯和清瘟敗毒散，4種清熱解毒復(fù)方均有一定的體外抑菌和抗病毒活性，該研究結(jié)果可為豬場臨床用藥提供一定參考。