閆鑫，王鶴，黃國麗，王慧娜，韓淵懷，3，王海崗，郭龍，韓彥卿，3*

（1.山西農業(yè)大學 植物保護學院，山西 太谷 030801；2.山西農業(yè)大學 農學院，山西 太谷 030801；3.雜糧種質資源發(fā)掘與遺傳改良山西省重點實驗室；山西 太原 030031；4.山西省農業(yè)科學院 農作物品種資源研究所，山西 太原 030031；5.山西臨汾市浮山縣農業(yè)農村和水利局，山西 浮山 042600）

谷子是我國重要雜糧之一，在旱作生態(tài)農業(yè)、食物多樣性和“健康中國”工程中占有舉足輕重的地位［1］。近年來，隨著秸稈還田以及單一同質化谷子品種的廣泛種植，谷子多種病害發(fā)生且呈逐年加重趨勢，自2010 年以來，白發(fā)病已成為谷子生產(chǎn)上最嚴重的病害之一［2］，該病害頻繁嚴重發(fā)生對谷子的產(chǎn)量和品質都構成極大的威脅，培育抗病品種是最有效的防治方法［3］，而明確其侵染條件與接種方法是研究白發(fā)病的基礎，是培育抗病品種的前提。

目前，關于谷子白發(fā)病的研究主要集中在谷子抗病生理生化［4］以及抗病基因的挖掘［5］，對白發(fā)病菌的發(fā)病條件研究尚少，國內僅少數(shù)學者對白發(fā)病菌萌發(fā)及侵染進行了初步的研究。王珍海［6］認為卵孢子的適宜萌發(fā)溫度為8~20 ℃，相對濕度為20%~80%；劉學敏等［7］研究表明，辣椒疫霉菌侵染的最適土壤溫度為22 ℃，最適土壤含水量為40%左右；張則君等［8］等發(fā)現(xiàn)，溫濕度以及幼芽出土快慢會影響谷子白發(fā)病的發(fā)生，溫度低時，幼芽出土較慢，有利于白發(fā)病菌侵染幼芽，濕度大時，有利于孢子萌發(fā)侵染，低溫高濕有利于白發(fā)病的發(fā)生。2013 年榆林市［9］由于雨水頻繁，低溫高濕的氣候條件，為田間該病原菌的萌發(fā)和侵染提供了有利條件，使得白發(fā)病的發(fā)病率急劇上升，有的地塊甚至達到55.0%，嚴重制約了谷子產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

建立穩(wěn)定高發(fā)的接菌技術對研究白發(fā)病具有非常重要的意義。張秦風［10］采用白發(fā)病菌孢子囊懸浮液對分蘗幼芽、幼葉和幼苗等進行接菌，接菌的植株出現(xiàn)明顯發(fā)病癥狀；Paola 等［11］研究可可黑果病原菌棕櫚疫霉的接菌方法，對土壤接種、葉面噴灑以及瓊脂圓盤接種葉片3 種接菌方法比較，其研究發(fā)現(xiàn)，瓊脂圓盤法接種96 h 后植株葉片發(fā)病率為100%，而葉片噴灑法與土壤接菌法接種后10 d 未發(fā)現(xiàn)明顯的癥狀，表明瓊脂圓盤法更適合棕櫚疫霉的接種。

本研究擬采用卵孢子拌種的方法，通過不同溫度處理卵孢子，明確不同溫度處理對卵孢子侵染谷子的表型差異；探索卵孢子侵染感病谷子品種最適溫度和濕度環(huán)境條件。同時進行卵孢子拌菌接種，以及改進Paola 的土壤接菌法和瓊脂圓盤接菌法，用孢子囊懸浮液進行浸根，葉片噴灑以及離體葉片接菌，調查發(fā)病率，結合統(tǒng)計學分析，以期篩選出高效穩(wěn)定的接菌方法；為谷子抗性鑒定及白發(fā)病菌致病分子機制研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為高感品種晉谷21（JG21），由山西農業(yè)大學生物工程研究所種質資源庫提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 白發(fā)病菌的收集與培養(yǎng)

孢子囊懸浮液的制備。采集“灰背”癥狀的葉片，用無菌水輕輕沖洗，洗去葉片背面的霉層，在超凈工作臺中用75%乙醇，10% NaClO 進行表面消毒后，無菌水沖洗2~3 次，每次1 min，在無菌濾紙上晾干［12-13］，用鑷子將表面消毒后的“灰背”癥狀葉片置于含有1%水瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，在20 ℃條件下黑暗培養(yǎng)16 h，待葉片背面長出新鮮的霉層，隨后用滅菌刷將孢子囊刷入無菌水中，制成孢子囊懸浮液，用血球計數(shù)板［14］將孢子懸浮液的濃度調為105個·mL-1［15］，備用。

卵孢子的獲得。田間大量采集的谷子發(fā)病植株的“發(fā)絲”，晾干后，過篩［16］。為了避免卵孢子表面粘附雜菌，采用10% NaClO 消毒2 h，75%酒精消毒30 min，無菌水充分振蕩沖洗3~5 次，晾干，備用。

1.2.2 白發(fā)病菌的侵染條件

（1） 不同溫度處理卵孢子對谷子的侵染

稱取消毒處理后的卵孢子各0.1 g，分別放在-18、4、15、20、25 ℃的培養(yǎng)條件下處理36 h。將不同溫度處理后的卵孢子與谷粒拌種（卵孢子與谷粒混合比例為1∶10），播種于育苗盤中，每盤70穴，以無菌水拌種為對照組，待谷子長至兩葉一心期時，分別測定其發(fā)芽率，形態(tài)指標，發(fā)病率，隨后使用葉綠素儀測定谷子倒二葉的相對葉綠素含量。

（2） 不同溫度和濕度處理后谷子發(fā)病率調查

將谷粒與卵孢子拌種，卵孢子與谷?；旌媳壤秊?∶10（質量比），播種于育苗盤中，每盤70 穴，并設置無菌水拌種為對照組，光照培養(yǎng)箱溫度分別設置15、18、20、23、25 ℃五個梯度，濕度設置60%、70%、80%、90%、100% 五個梯度，6 d 后，測定苗期病株率。

1.2.3 白發(fā)病菌不同接種方法

離體葉片接菌法。室內離體葉片接菌法參照韋潔玲等［17］的方法，將兩葉一心期谷子葉片表面消毒，置于滅菌的濕潤濾紙上，用移液器接種5 μL孢子囊懸浮液于葉片背面，無菌水為對照，設置3個生物學重復，20 ℃黑暗培養(yǎng)12 h，隨后在溫度20 ℃下光照（16 h）和黑暗（8 h）條件下培養(yǎng)，6 d 后觀察其發(fā)病情況，并計算其病情指數(shù)，病情指數(shù)大于80，即為高感品種［18］。

幼苗噴霧法。待谷子長到兩葉一心期時，均勻噴灑0.1%的Tween-20［19］，再噴灑孢子囊懸浮液，每隔4 h 噴灑一次，連續(xù)噴灑3 次，以無菌水做對照，統(tǒng)計苗期發(fā)病率。

浸根法接種。選取谷子幼根長度基本一致的谷苗，將根部浸入孢子囊懸浮液中，以無菌水處理為對照，浸根時間設置為1、2、4、6 h 共4 個梯度，隨后移栽到滅菌后的土壤中，每組3 個生物學重復。定植6 d 后，調查統(tǒng)計總株數(shù)及存活率。

1.3 調查統(tǒng)計方法

參照本實驗室制定的病害分級標準，記錄發(fā)病葉片數(shù)及其病級情況。葉片基本無癥狀，0 級；病斑占葉片面積<5%，1 級；5%≤病斑占葉片面積<10%，3 級；10%≤病斑占葉片面積<25%，5級；25%≤病斑占葉片面積<50%，7 級；病斑占葉片面積≥50%，9 級。各個指標計算公式如下［20-22］。

參 考Stewart 等［23］和Abramoff 等［24］的 方 法 使用Image 拍 照，使 用IBM SPSS Statistics22 進 行 統(tǒng)計學分析，使用新復極差法進行顯著性分析。

“芽死”率的測定方法。未出苗的種子挖出，將種子置于體式顯微鏡下觀察，區(qū)分“芽死”與不發(fā)芽的種子，分別記錄。“芽死率”按照“芽死數(shù)”占總播種種子數(shù)（剔除掉未萌發(fā)的種子）的百分比。

2 結果與分析

2.1 不同溫度處理卵孢子對JG21 發(fā)芽率的影響

5 個不同溫度處理組的谷子發(fā)芽率均顯著低于不接菌的對照組（圖1）。未接菌組發(fā)芽率均達到90%以上，處理組中?18 ℃處理卵孢子后谷子發(fā)芽率最高，可達84.67%，隨著溫度的升高，其出苗率呈現(xiàn)下降的趨勢，20 ℃處理下發(fā)芽率最低，僅達到30%，25 ℃時，其出苗率又呈現(xiàn)上升的趨勢；對“芽死”發(fā)生率統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，未處理組“芽死”發(fā)生率普遍低于3%，5 個不同溫度處理組的“芽死”發(fā)生率均顯著高于對照組，?18 ℃處理下的“芽死”發(fā)生率均低于其它4 個處理組，隨著溫度升高，其“芽死”發(fā)生率呈現(xiàn)上升的趨勢，20 ℃處理的“芽死”率最高，達到67.94%，25 ℃出現(xiàn)下降的趨勢。綜上，20 ℃處理卵孢子拌種的JG21 發(fā)芽率最低。

圖1 不同溫度處理卵孢子拌種JG21 出苗率Fig.1 Effect of oospores treated at different temperature on germi?nation rate of JG21

2.2 不同溫度處理卵孢子對JG21形態(tài)指標的影響

通過不同溫度處理的卵孢子接種感病品種JG21 后測定處理組和對照組谷子植株的株高，莖粗，以及倒二葉的葉寬，葉長等形態(tài)指標，結果表明，處理組的數(shù)據(jù)均顯著低于對照組（圖2），其中20 ℃處理的株高，葉長，葉寬與莖粗均為最低，分別為8.80、4.40、0.21、0.77 mm，與對照組28.43、24.58、0.86、2.23 cm 相比均顯著的下降，各個形態(tài)指標表現(xiàn)出從?18 ℃到20 ℃基本呈現(xiàn)先下降，后上升的趨勢。結果表明20 ℃處理卵孢子后谷子的株高，莖粗，以及倒二葉的葉寬，葉長等形態(tài)指標均低于正常植株，說明20 ℃處理的卵孢子對JG21 形態(tài)指標的影響最大。

圖2 不同溫度處理卵孢子侵染JG21 后形態(tài)指標差異Fig.2 Differences in morphological indexes of oospores infected with JG21 at different temperature

2.3 不同溫度處理卵孢子JG21 相對葉綠素含量

卵孢子侵染谷子后發(fā)病葉片會褪綠變黃或者黃綠相間的條紋癥狀，為明確卵孢子侵染對葉綠素含量的影響，使用SPAD 儀測定不同處理組與對照組葉片的相對葉綠素含量。測定結果表明（圖3），接菌的處理組的葉片SPAD 值均顯著低于不接菌的對照組，未接菌組的SPAD 值均高于23，20 ℃處理溫度下，所測得的SPAD 值最低，為12.36，?18 ℃處 理 條 件 下，SPAD 值 最 高 為17.12。綜合分析，5 個不同溫度處理組的卵孢子均可萌發(fā)且侵染植株，造成葉片出現(xiàn)“褪綠”現(xiàn)象，但是20 ℃處理下，葉綠素相對含量最低，“褪綠”現(xiàn)象最明顯。

圖3 不同溫度處理卵孢子對JG21 相對葉綠素含量的影響Fig.3 Effects of oospores treated at different temperature on JG21 on chlorophyll content

2.4 不同溫度處理卵孢子對JG21 發(fā)病率的影響

由圖4 可見，?18 ℃處理的植株發(fā)病率最低，為1.51%，其余4 個處理組植株發(fā)病率明顯高于不接菌的對照組（11.83%），其中20 ℃處理卵孢子后，植株發(fā)病率最高，可達86.67%；而4、15、25 ℃溫度處理下植株發(fā)病率在22.60%~64.30% 之間。結果表明，經(jīng)20 ℃處理后的卵孢子對植株的侵染最嚴重，發(fā)病率最高。

圖4 不同溫度處理卵孢子對JG21 發(fā)病率的影響Fig.4 The effect of different temperature treatment of oospores on the incidence of JG21

2.5 谷子苗期白發(fā)病高發(fā)的最適溫濕度條件

通過卵孢子拌菌法，明確谷子苗期最適發(fā)病溫濕度。采用設置不同溫度和濕度處理（圖5），對照組發(fā)病率均低于5%，處理組隨著溫度的逐漸遞增，病株率逐漸升高，23~25 ℃時病株率最高，可達85%以上。溫度低于20 ℃時，苗期病株發(fā)生率明顯呈現(xiàn)下降趨勢；谷子苗期設置相對濕度80%及以上時，未拌菌組發(fā)病率普遍低于5%，處理組苗期病株發(fā)生率顯著提高，相對濕度100%時，苗期病株發(fā)生率可高達到97%。由此可知，采用卵孢子拌菌法接菌時，苗期發(fā)病的最適溫度為23℃~25℃，最適濕度為80%以上。

圖5 不同溫濕度下苗期發(fā)病率差異Fig.5 Differences in incidence rates under different temperature and humidity

2.6 不同接菌方法比較

為探索谷子白發(fā)病最佳接菌方法，本研究采用卵孢子拌種，孢子囊懸浮液離體葉片接菌、噴霧接菌和幼苗浸根等4 種接種方法進行比較，摸索穩(wěn)定高效的接菌技術。結果表明，采用卵孢子拌種法，相對濕度為80%~100%，溫度為23~25 ℃時，其發(fā)病率可高達98.5%（圖6A），表明卵孢子拌種法是非常有效、可靠的接菌方法。孢子囊懸浮液離體葉片接菌，計算葉片背面的病斑面積以及占葉片總面積的比例，并進行統(tǒng)計學分析，病情指數(shù)為84.4（圖6B）。谷子兩葉一心期，用孢子囊懸浮液浸根法進行接種（圖6C），處理時間1~4 h 之間，植株的存活率呈現(xiàn)出下降的趨勢，浸根4 h 時存活率最低，為3%，且處理組植株的存活率（3%）顯著低于對照組（83.57%）。隨著時間的延長，6 h 時，植株的存活率出現(xiàn)了上升趨勢，其存活率達到20%，但處理組植株的存活率（20%）同樣顯著低于對照組（87%），表明孢子囊懸浮液浸根4 h 時，是浸根法最佳的接菌時間點。幼苗在兩葉一心時，孢子囊懸浮液噴灑葉片接菌，8 d 后，處理組谷子幼苗的發(fā)病率達到70%（圖6D），且發(fā)病率明顯高于未接菌植株的發(fā)病率（2.5%，1.25%，5%）。綜上所述，卵孢子拌種的接菌方法明顯優(yōu)于其它3種接菌方法，為最高效的接菌方法。采用孢子囊懸浮液接菌時，其中，葉片噴灑法的發(fā)病率最高，離體葉片接法次之。噴灑法和離體葉片接菌可作為室內高效的接菌方法。

圖6 卵孢子拌種、孢子囊懸浮液離體葉片接種、噴霧法和幼苗浸根法接種后發(fā)病率比較Fig.6 Comparison of incidence of seed dressing with oospores，in vitro inoculation

3 討論

分析和明確病原物侵染植株的各個影響因子，對研究植物病害以及對其的預防具有重要意義［25-26］。谷子白發(fā)病的侵染機制尚不明確，侵染影響因素及接種方法的研究國內外鮮有報道。本研究使用卵孢子拌種的方法，明確了20 ℃處理的卵孢子對谷子的侵染最嚴重，說明溫度對卵孢子的萌發(fā)率可能存在一定的影響。通過設置不同梯度溫度和濕度條件，研究發(fā)現(xiàn)相對濕度為80%~100%，溫度為23~25 ℃時，白發(fā)病的發(fā)生率最高。劉若妍等［21］對葡萄葉片進行離體接菌，明確了葡萄霜霉病在環(huán)境濕度為75%，保濕3 h 后便會出現(xiàn)發(fā)病癥狀；Koopman 等［27］研究表明，葡萄霜霉病菌的孢子囊產(chǎn)生的最適條件為濕度95%以上，溫度在20~25 ℃之間；這些與本研究結果相一致，但康立功等［28］通過對番茄芝麻斑病菌侵染條件的研究，結果表明25~30 ℃是病原菌侵染的最佳溫度；此結果與本研究結果不符，可能是因為番茄芝麻斑病菌為半知菌亞門，與白發(fā)病菌表現(xiàn)出不同的生物學特性。同時，2017 年建平縣白發(fā)病發(fā)生嚴重，研究學者經(jīng)分析推測該地區(qū)連續(xù)降雨量較多，為病原菌的侵染提供了良好的濕度和溫度條件所致［29］。2001 年太原由于降雨偏多，導致白發(fā)病發(fā)生嚴重，與本研究的結果表現(xiàn)出一致性［8］。

本研究通過有性卵孢子和無性的游動孢子進行白發(fā)病菌的接種方法比較，研究發(fā)現(xiàn)卵孢子拌種的發(fā)病率最高，可作為穩(wěn)定的接種方法。張海旺［30］認為離體葉片劃傷接種法為最穩(wěn)定的檢測方法，而活體噴霧接種、葉片無劃傷接種會出現(xiàn)假抗性且不同葉齡期的反應型會出現(xiàn)不一致性；劉森、袁慶華［31-32］等均采用人工離體接種法進行接菌，表現(xiàn)出良好的重復性。本研究采用離體葉片接菌法，病情指數(shù)可達84.4%，該方法不僅操作簡便，而且結果可靠，適合谷子種質資源對白發(fā)病抗性的快速鑒定。史文琦等［33］建立的小麥白粉菌分生孢子懸浮液噴霧接種方法，通過控制懸浮液中孢子濃度，有效的控制接種量，避免人為的誤差；本研究采用的孢子囊懸浮液噴灑接菌，發(fā)病率較高，可達73%，也可作為一種可靠、高效的苗期接種方法。此外，本研究還建立了卵孢子拌種以及孢子囊懸浮液浸根兩種白發(fā)病菌的接菌技術，孢子囊懸浮液浸根法可使幼根直接接觸病原菌，且避免了采用孢子囊懸浮液浸入土壤接菌導致孢子囊分布不均引起的誤差；在本研究中，采用粘附劑進行卵孢子拌種，一方面保證卵孢子與谷粒充分粘附，另一方面可以保證其發(fā)病所需的濕度，更有利于白發(fā)病菌的侵染和發(fā)生。

4 結論

本試驗中，20 ℃處理的卵孢子對谷子的侵染最嚴重；濕度是谷子白發(fā)病菌侵染的必要條件，在相對濕度為80%~100%，溫度為23~25 ℃時，白發(fā)病的發(fā)生率最高。因此，可以通過控制溫濕度降低該病害的發(fā)生。本研究建立的卵孢子拌種法，成功率高達95%以上，可以作為一種穩(wěn)定高發(fā)的接菌方法；孢子囊懸浮液接菌，可精準的控制接種量，減少誤差；離體葉片接菌法具有良好的重復性，可為谷子種質資源的抗病性鑒定提供可靠的結果。