耿晶晶，楊藝萌，尹添，趙增旗，2，徐玉梅*

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護學(xué)院，山西 太谷 030801；2.新西蘭皇家研究院 土地環(huán)境研究所，新西蘭 奧克蘭 1142）

綠豆（Vigna radiata）隸屬于豆科，是我國重要的雜糧作物。中國是綠豆的原產(chǎn)國，主要種植區(qū)在黃淮河流域和東北，包括內(nèi)蒙古、吉林、山西、河南和安徽等地［1］。2019 年我國綠豆產(chǎn)量為57.30 萬t，占全球總產(chǎn)量的2.1%，居世界前列［2］。

孢囊線蟲（Cyst nematodes）指在根際部形成的孢囊狀線蟲，主要包括孢囊屬（Heterodera）、球形孢囊屬（Globodera）和仙人掌孢囊屬（Cactodera），其中具有重要經(jīng)濟價值的種類有大豆孢囊線蟲（H.glycines）、小麥孢囊線蟲（H.avenae和H.filipjevi）、甜菜孢囊線蟲（H.schachtii）以及馬鈴薯孢囊線蟲（G.rostochiensis和G.pallida）等，孢囊線蟲可引起植物病害，帶來嚴重的經(jīng)濟損失［3-6］。Epps 等［7］首次在室內(nèi)接種證明綠豆是大豆孢囊線蟲的新寄主，后相繼在綠豆上報道的孢囊線蟲有木豆孢囊線蟲（H.cajani）［8-9］和野生豆孢囊線蟲（H.sojae）［10］。

本研究為明確山西省晉中東陽縣綠豆上孢囊線蟲的病原種類，采用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)結(jié)合的方法，對其進行種類鑒定和致病性測定，為進一步制定相應(yīng)防控對策提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 線蟲的采集、分離和標本制作

1.1.1 采集

2020 年6 月在山西省晉中市東陽縣（37°32′15′′N，112°40′02′′E，802 m）綠豆育種田中采集發(fā)病植株及其根際土壤樣本，記錄采集相關(guān)信息，帶回實驗室冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 分離

根際孢囊采用直接挑取法分離，土壤中孢囊采用漂浮法分離［11］。分離的孢囊一部分用于孵化二齡幼蟲，另一部分用于致病性測定。

1.1.3 標本制作

將二齡幼蟲用4%福爾馬林熱殺死固定［12］，然后用Seinhorst 法進行脫水［13］，蠟圈法制成永久玻片以備形態(tài)測量。參照段玉璽［11］的方法制作陰門錐并觀察測量。

1.2 孢囊線蟲的形態(tài)學(xué)觀察

1.2.1 光學(xué)顯微鏡的形態(tài)觀察和測量

將上述制作好的永久玻片置于尼康顯微鏡下進行觀察，用軟件NIS Elements version 4.10 進行測量和拍照，記錄相關(guān)測量數(shù)據(jù)，并計算a、b、c 和c′等de Man 數(shù)值。

1.2.2 掃描電鏡樣品的制備及觀察

挑取完整孢囊和二齡幼蟲放入2.5%戊二醛溶液中固定14 d，用滅菌dd H2O 清洗3 次，依次用30%、70%、80%、90%、95% 乙 醇 洗 脫10 min，100%乙醇處理2 次，每次15~20 min，用叔丁醇置換無水乙醇2 次，每次10 min，將干燥后的線蟲樣本置于冷凍干燥機（JEOL JFD-320）中過夜，隨后進行粘樣，噴金鍍膜。將制作好的樣品置于掃描電鏡（JEOL JSM-6490LV）下觀察并拍照。

1.3 分子序列分析

1.3.1 DNA 的提取

采用蛋白酶K 法進行DNA 提?。?4-15］。

1.3.2 PCR 的擴增

采用通用引物對孢囊線蟲的28S、ITS 和COI基 因 進 行PCR 擴 增。28S 引 物：D2A（5’-ACA AGT ACC GTG AGG GAA AGT TG-3’）和D3B（5’-TCG GAA GGA ACC AGC TAC TA-3’）［16］。ITS 引物：TW81（5’-GTT TCC GTA GGT GAA CCT GC-3’）和AB28（5’-ATA TGC TTA AGT TCA GCG GGT-3’）［17］。COI 引物：JB3（5’-TTT TTT GGG CAT CCT GAG GTT TAT-3’）和JB4.5（5’-TAA AGA AAG AAC ATA ATG AAA ATG-3’）［18］。擴增程序為：95 ℃2 min，95 ℃10 s，53 ℃30 s，72 ℃60 s，40 次循環(huán)，72 ℃7 min，用1%的核酸凝膠電泳檢測。將PCR 擴增產(chǎn)物直接送至生工生物公司（上海）股份有限公司進行測序。

1.3.3 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將測序結(jié)果用Sequencher 5.2.2 整理編輯，從NCBI 下載孢囊屬Heterodera類群，用Cryphodera brinkmani做外群，用Geneious Prime 2019［19］分別構(gòu)建ITS+28S 聯(lián)合基因系統(tǒng)發(fā)育樹和COI 基因系統(tǒng)發(fā)育樹，用FigTreeV 1.4.3 查看系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 致病性測定

1.4.1 綠豆植株準備

綠豆品種“并綠9 號”由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院小雜糧研究中心提供。將綠豆種子用次氯酸鈉溶液消毒后，播種在裝有經(jīng)高壓滅菌（150 ℃，烘干1.5 h）的肥沃土壤與育苗基質(zhì)1∶1 混合的花盆中，每盆播種3 株，共播種20 盆。

1.4.2 致病性的測定

待綠豆出苗后至兩葉一心期進行間苗，每盆留有1 株。接種1.1.2 分離得到的孢囊，每盆接種12個孢囊，共接種10 盆，其余10 盆作為空白對照。采用常規(guī)管理，40 d 和46 d 后拔出綠豆植株觀察是否有孢囊形成，并采用次氯酸鈉-酸性品紅染色觀察孢囊線蟲在根際部的分布［20］。

2 結(jié)果與分析

2.1 癥狀觀察

孢囊線蟲侵染綠豆的田間癥狀表現(xiàn)：植株發(fā)育不良，秧苗矮小，子葉和真葉變黃，逐漸干枯（圖1A、圖1B）。病株根部根系不發(fā)達，側(cè)根減少，須根增多，根瘤減少（圖1D），且根上有許多淡黃色小顆粒（圖1C），即為孢囊線蟲的雌蟲（圖1E）。在發(fā)病田綠豆根際土壤中采集的種群密度為每100 g 濕土70個孢囊。

圖1 孢囊線蟲侵染綠豆的田間癥狀Fig.1 Symptoms of mung bean infected by cyst nematodes in the field

2.2 形態(tài)學(xué)鑒定

2.2.1 特征描述

孢囊：檸檬形（圖2A），初期白色，后期為褐色或黃褐色，長412~571 μm，寬223~284 μm。陰門錐明顯（圖2B），陰門膜孔為雙半膜孔型（圖2C），陰門裂35.9~48.7 μm，膜孔長39.7~42.4 μm，膜孔寬28.0~36.3 μm，下橋長89.2~97.8 μm（圖2E），泡狀突較多（圖2D），排列不規(guī)則。

卵：長橢圓形，長97.4~103 μm，寬44.0~46.8 μm，卵殼透明光滑，內(nèi)有折疊的一齡幼蟲（圖2F）。

二齡幼蟲：蟲體呈蠕蟲形，體長401~456 μm。唇區(qū)縊縮（圖2G），口針細長，長21.5~25.0 μm，口針基部球明顯。中食道球圓形，長12.3~20.0 μm，寬8.9~11.9 μm。排泄孔明顯，位于半月體后端，距離體前端88.4~108 μm。側(cè)線4 條（圖2I）。尾圓錐形，透明尾明顯，長19.2~31.1 μm（圖2H）。

圖2 孢囊和二齡幼蟲形態(tài)特征Fig.2 Micrographs of the cyst and J2 of cyst nematode

雄蟲：未發(fā)現(xiàn)。

2.2.2 形態(tài)測計值

測量結(jié)果見表1。

2.3 分子生物學(xué)鑒定

測序結(jié)果表明，綠豆根際孢囊線蟲的28S 的擴增 片 段 長 度 為 710 bp（GenBank 登 錄 號OK012079），將其與GenBank 中已知序列進行對比，與大豆孢囊線蟲（H.glycines）（KX017535）和苜蓿孢囊線蟲（H.medicaginis）（MH793872）的序列相似度均為100%。ITS 區(qū)域序列（OK001855）長度 為934 bp，與 大 豆 孢 囊 線 蟲（MT254745，MG845112，MG845079 和MG845051）的序列相似度達100%，與苜蓿孢囊線蟲（AF274391）的序列相似率達99%。COI 基因擴增片段的長度為395 bp（GenBank 登錄號OK001854），與大豆孢囊線蟲（MT644158，MK188448 和KC172914）的序列相似度 為 99%，與 苜 蓿 孢 囊 線 蟲（MK093162 和MK093166）的序列相似率為96%。

以布林克曼隱皮孢囊線蟲（Cryphodera brink?mani）為外群，構(gòu)建ITS+28S 聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育樹顯示（圖3），本試驗種群與大豆孢囊線蟲和苜蓿孢囊線蟲位于同一分支上，置信度達100%；COI 系統(tǒng)發(fā)育樹顯示（圖4），本試驗種群與大豆孢囊線蟲（MK093154，MK093153，KY775596，MN720172）位于同一個分支上，置信度達100%，而苜蓿孢囊線蟲則單獨位于另一分支上。

圖3 基于大豆孢囊線蟲ITS+28S 基因聯(lián)合構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹（置信度>50%注在相應(yīng)的節(jié)點處）Fig.3 Phylogenetic tree of Heterodera glycines inferred from ITS and 28S rRNA gene sequences（posterior probability values exceed?ing 50% are given on appropriate clade）

圖4 基于大豆孢囊線蟲COI 基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹（置信度>50%注在相應(yīng)的節(jié)點處）Fig.4 Phylogenetic tree of Heterodera glycines inferred from COI rRNA gene sequences（posterior probability values exceeding 50% are giv?en on appropriate clades）

2.4 致病性測定

在接種40 d 后，在綠豆根部未觀察到孢囊，對其根部染色后，觀察到線形J2（圖5A、圖5B）和臘腸狀的J3 蟲態(tài)（圖5B），以J2 居多。接種46 d 后，根部觀察到少數(shù)孢囊（圖5D），染色后根部可觀察到J2、J3 和J4 蟲 態(tài)，以J3 居 多，J2 較 少，僅 觀 察 到1 個J4（圖5C），此結(jié)果說明孢囊線蟲回接到健康綠豆上可引起植株發(fā)病，形成孢囊（表2）。

圖5 綠豆致病性測定的根部染色結(jié)果圖Fig.5 The staining results of the mung bean roots inoculated with cyst nematodes

表2 健康綠豆接種大豆孢囊線蟲后不同時期體內(nèi)蟲態(tài)及數(shù)量統(tǒng)計Table 2 The stage and number of cyst nematodes in the healthy mungbean after inoculation

3 討論

大豆孢囊線蟲是大豆生產(chǎn)上的毀滅性病害之一，在世界大豆產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生。在中國1899 年首次在東北地區(qū)發(fā)現(xiàn)，目前在黑龍江、遼寧、吉林、內(nèi)蒙古、河北、河南、山東、山西、陜西、安徽、北京、浙江、江蘇等22 省大豆產(chǎn)區(qū)發(fā)生，發(fā)生面積200 多萬hm2，以東北和黃淮海大豆產(chǎn)區(qū)發(fā)生最嚴重，每年造成高達1.2 億美元的損失［10，21］。主要寄主有大豆、菜豆、紅小豆、豌豆和食用豆等豆科植物［10，22］。

本試驗種群的陰門錐與Mulvey［23］的報道一致。孢囊及二齡幼蟲數(shù)據(jù)與Ichinohe［24］的原始描述基本吻 合，除 孢 囊 體 較 窄（223~284 μmvs350~670 μm）。此外，在分子序列特征上來看，大豆孢囊線蟲和苜蓿孢囊線蟲兩者的ITS（99%）和28S（100%）序列均相近，用單獨序列相似度和系統(tǒng)發(fā)育樹無法將兩者分開，本試驗構(gòu)建的ITS+28S 聯(lián)合序列發(fā)育樹也無法將兩者區(qū)分。但是COI 系統(tǒng)發(fā)育樹則可以很好地將兩個序列相近種區(qū)分開來，本試驗結(jié)果與Powers 等［25］結(jié)果一致。

Epps 等［7］首次在室內(nèi)接種證明大豆孢囊線蟲可侵染綠豆；李秀花等［26］采用田間盆栽的試驗方法，將大豆孢囊線蟲3 號生理小種接種到綠豆上，38 d 后在土壤中可觀察到1 個孢囊；本論文首次報道了大豆孢囊線蟲在田間侵染綠豆發(fā)病，致病性接種后可以侵染綠豆，并能完成其生活史形成孢囊。而甄浩洋等［27］采用人工接種野生豆孢囊線蟲可侵染綠豆，但不能完成生活史。

種植抗病品種是孢囊線蟲病最經(jīng)濟有效的防治措施，而大豆孢囊線蟲生理小種的鑒定是抗性品種培育、鑒定、推廣的前提和依據(jù)。目前大豆孢囊線蟲多數(shù)生理小種已在全球報道，美國報道有13 個生理小種［28］。在我國也有生理小種的相關(guān)報道［29-30］，現(xiàn)報道的生理小種有11 個，其中1 號、3 號和4 號在全國范圍內(nèi)面積最大、分布最廣，3 號小種致病力最弱、4 號最強，3 號是東北地區(qū)的優(yōu)勢小種，而1 號和4 號是黃淮海地區(qū)的優(yōu)勢小種［31］。已有研究表明中國黃淮海和美國密蘇里州大豆產(chǎn)區(qū)的優(yōu)勢小種均由1 號小種演變?yōu)橹虏⌒愿鼜姷? 號小種［32-35］。山西省是國內(nèi)大豆孢囊線蟲感染最嚴重的地區(qū)，優(yōu)勢小種是致病力較強的4 號和12 號小種［32，36］。本研究只對綠豆上的孢囊線蟲進行了種類鑒定和致病性測定，具體的生理小種類型還有待于進一步鑒定。

4 結(jié)論

本試驗運用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合，將綠豆病田中采集到的孢囊線蟲種類鑒定為大豆孢囊線蟲。將大豆孢囊線蟲回接到健康綠豆上，40 d 后根部觀察到J2 和J3，46 d 后觀察到J4 和孢囊形成。首次在中國發(fā)現(xiàn)大豆孢囊線蟲在田間侵染綠豆，在綠豆產(chǎn)區(qū)要及時監(jiān)測，并采取輪作措施或殺線蟲劑等進行合理防控。