田夢悅，賈 麗，梁艷艷，李 可，侯銘源，馬玉忠 (河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071001)

奶牛蹄葉炎是目前牧場最為棘手的常發(fā)病之一，可導(dǎo)致奶牛跛行、產(chǎn)奶量下降等，增加奶牛淘汰風(fēng)險，造成巨大的經(jīng)濟損失[1]，而目前尚未找到有效防治蹄葉炎方法。在我國，應(yīng)用中草藥來治療動物疾病的歷史已達(dá)數(shù)千年之久，中草藥資源豐富，且具有耐藥性低及副作用小的優(yōu)點，因此，篩選合適的中藥用于治療蹄葉炎，具有十分重要的意義

甘草是豆科植物甘草屬，藥用部位為干燥根和根莖，是臨床常用藥，有補中益氣、清熱解毒、調(diào)理陰陽等功效。甘草查爾酮A是從甘草中分離出的主要黃酮類化合物之一，具有抗炎、抗氧化、抗癌、抗菌、抗寄生蟲等多種功效[2-3]。然而，甘草查爾酮A對于奶牛蹄真皮炎性細(xì)胞的作用尚未見報道。本研究通過探討甘草查爾酮A對于脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的奶牛蹄真皮炎性細(xì)胞的影響，為奶牛蹄葉炎的臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；胎牛血清購自杭州四季青有限公司；LPS購自Sigma公司；CCK-8試劑盒、RIPA高效裂解液購自Solarbio公司；牛TNF-ɑ、IL-1β、IL-6 ELISA試劑盒購自北京冬歌博業(yè)生物科技公司；SOD、MDA試劑盒購自南京建成試劑公司；p65 NF-κB、p-p65 NF-κB，IκB、p-IκB、ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、p38、p-p38抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 奶牛蹄真皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)無菌條件下取奶牛蹄部皮膚組織，將其修剪成約1 cm3小塊，浸泡于0.25%胰酶溶液中，4℃孵育過夜。取出組織塊，PBS沖洗3次后，將真皮組織修剪成約0.5 cm3小塊，鋪至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，緩慢加入約500 μL 含15%血清的DMEM培養(yǎng)基，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～24 h。次日，每孔加入2 mL 含15%血清的DMEM培養(yǎng)基。每周換液2次。當(dāng)細(xì)胞約有50%融合時，將組織塊取出。

1.3 細(xì)胞活力檢測將奶牛蹄真皮細(xì)胞以1.0×105個/孔的密度接種于96孔板中，37℃ 5% CO2條件下培養(yǎng)過夜。將細(xì)胞分為6組，用0，1，5，10，50，100 mg/L 甘草查爾酮A處理后，37℃ 5% CO2條件下培養(yǎng)24,48 h，每孔加入10 μL CCK-8溶液。37℃孵育1 h后，測定各孔D450值，計算細(xì)胞活力。

1.4 細(xì)胞分組處理將奶牛蹄真皮細(xì)胞分為5組，對照組：DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)；模型組：10 mg/L LPS處理；藥物處理組：10 mg/L LPS處理24 h后，10，50，100 mg/L甘草查爾酮A處理24 h。

1.5 TNF-ɑ、IL-1β、IL-6、SOD、MDA水平檢測按照ELISA試劑盒說明書要求，檢測各組細(xì)胞上清液中TNF-ɑ、IL-1β、IL-6含量；按照說明書操作檢測細(xì)胞上清液中SOD、MDA含量。

1.6 Western blot法檢測MAPK和NF-κB信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。蛋白變性后，12%SDS-PAGE電泳，半干法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂乳封閉1 h，一抗4℃過夜，TBST洗膜，二抗孵育1 h，TBST洗膜，NBT/BCIP顯色。

2 結(jié)果

2.1 甘草查爾酮A對奶牛蹄真皮細(xì)胞活力的影響結(jié)果顯示，1，5，10，50，100 mg/L甘草查爾酮A處理24，48 h 對蹄真皮細(xì)胞活力均無顯著性影響(P>0.05)(圖1)。

圖1 甘草查爾酮A對奶牛蹄真皮細(xì)胞活力的影響

2.2 甘草查爾酮A對奶牛蹄真皮炎性細(xì)胞TNF-ɑ、IL-1β、IL-6含量的影響ELISA結(jié)果表明，與對照組相比，10 mg/L LPS處理后，TNF-ɑ、IL-1β、IL-6含量均極顯著升高(P<0.01)。而用10，50，100 mg/L 甘草查爾酮A處理后，與LPS模型組相比，均可極顯著降低TNF-ɑ、IL-1β、IL-6含量(P<0.01)(圖2)。

注：##.與對照組比差異極顯著(P<0.01)；**.與對照組比差異極顯著(P<0.01)。下同

2.3 甘草查爾酮A對奶牛蹄真皮炎性細(xì)胞SOD、MDA含量的影響與對照組相比，10 mg/L LPS處理后，極顯著降低SOD活力(P<0.01)，提高MDA含量(P<0.01)。與LPS模型組相比，10，50，100 mg/L甘草查爾酮A處理后，極顯著提高SOD活力(P<0.01)，降低MDA含量(P<0.01)，且呈現(xiàn)一定的質(zhì)量濃度依賴性(圖3)。

圖3 甘草查爾酮A對奶牛蹄真皮細(xì)胞SOD、MDA含量的影響

2.4 甘草查爾酮A對奶牛蹄真皮炎性細(xì)胞MAPKs和NF-κB信號通路的影響與對照組相比，10 mg/L LPS極顯著地提高了ERK、JNK、p38、IκBα、p65蛋白的磷酸化水平(P<0.01)。與LPS模型組相比，10，50，100 mg/L甘草查爾酮A均可極顯著降低ERK、JNK、p38蛋白的磷酸化水平(P<0.01)，甘草查爾酮A可顯著(10 mg/L，P<0.05)或極顯著(50，100 mg/L，P<0.01)降低IκBα蛋白的磷酸化水平，甘草查爾酮A可顯著(100 mg/L，P<0.05)或極顯著(50 mg/L，P<0.01)降低p65蛋白的磷酸化水平。

圖4 甘草查爾酮A對奶牛蹄真皮細(xì)胞MAPK、NF-κB信號通路的影響

3 討論

目前，奶牛蹄葉炎的治療措施主要為對癥治療，減輕患部疼痛，但缺點在于治標(biāo)不治本。另外，地塞米松以及許多抗生素可用于緩解全身炎癥，莫能菌素、泰樂菌素等瘤胃改良劑可以用于減輕蹄葉炎的嚴(yán)重程度并延緩其發(fā)病[4-5]，但存在抗生素濫用的現(xiàn)象，容易引發(fā)食品安全問題，導(dǎo)致耐藥菌株出現(xiàn)。而中藥由于耐藥性低、副作用小，已成為各種疾病的飼料補充劑或替代藥物的潛在來源[6]。所以，研究中草藥對奶牛蹄葉炎的治療作用具有十分重要的意義。

本實驗室前期試驗顯示，10 mg/L LPS作用24 h 可降低奶牛蹄真皮細(xì)胞活力，提高TNF-ɑ、IL-1β含量，成功建立奶牛蹄真皮炎性細(xì)胞模型[7]。細(xì)胞因子的過度產(chǎn)生與炎癥損傷密切相關(guān)[8]。TNF-α、IL-1β和IL-6是典型的促炎細(xì)胞因子，在炎癥反應(yīng)的發(fā)病過程中發(fā)揮著極為關(guān)鍵的作用[9]。炎性因子的減少可以作為炎癥減輕的重要信號。本試驗中，甘草查爾酮A處理后，可顯著降低TNF-ɑ、IL-1β、IL-6含量，表明甘草查爾酮A對于LPS誘導(dǎo)的奶牛蹄真皮細(xì)胞炎性反應(yīng)具有一定的抑制作用。

炎癥和氧化應(yīng)激是兩個密切相關(guān)的病理過程，一方面，炎癥細(xì)胞可產(chǎn)生多種可溶性介質(zhì)并激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)，從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激加劇[10]。另外，氧化應(yīng)激可通過激活信號通路的啟動而引起生物大分子損傷，并可引起炎癥反應(yīng)[11]。丙二醛(malondialdehyde,MDA)的含量是檢測脂質(zhì)過氧化和細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的重要指標(biāo)[12]。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)是機體重要的抗氧化酶，檢測SOD的活力可用于反映機體自身清除自由基的能力大小[13]。本試驗中，甘草查爾酮A可提高SOD活性并降低MDA含量，表明甘草查爾酮A可緩解LPS誘導(dǎo)的奶牛蹄真皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。

MAPK(mitogen-activated protein kinases)是將細(xì)胞表面的刺激信號傳遞入細(xì)胞核內(nèi)的重要蛋白激酶，是多條信號通路的交匯中心，在早期炎癥反應(yīng)和NF-κB通路的激活中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用[14]。MAPK家族包括ERK、JNK、p38三大類亞族[15]。其中，ERK的活化是刺激信號進入細(xì)胞核的關(guān)鍵步驟之一，可導(dǎo)致TNF-α、IL-1、IL-6等炎癥因子的分泌，以及iNOS表達(dá)上調(diào)[16]。JNK家族是誘導(dǎo)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵分子，可結(jié)合c-Jun的氨基末端，促使轉(zhuǎn)錄因子AP-1的磷酸化，參與免疫調(diào)控，調(diào)節(jié)炎癥因子的分泌[17]。p38參與細(xì)胞凋亡、應(yīng)激反應(yīng)等生理病理過程，另外，p38還可被LPS等多種因素激活，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，參與調(diào)控TNF-α、IL-1、IL-6、TGF-β1等炎癥細(xì)胞因子的生成與活化，因此，p38也成為了抗炎藥物開發(fā)的關(guān)鍵靶點之一[18]。本試驗中，甘草查爾酮A處理細(xì)胞后，ERK、JNK、p38蛋白磷酸化程度受到抑制，表明甘草查爾酮A對于LPS誘導(dǎo)的奶牛蹄真皮細(xì)胞炎性損傷的抑制作用可能與MAPK信號通路有關(guān)。

核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)，是一種核轉(zhuǎn)錄因子，異二聚體p50-p65是其在機體內(nèi)常見的存在形式[19]。NF-κB廣泛存在于多種細(xì)胞中，是體內(nèi)多條信號通路的交匯中心，參與細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)，包括細(xì)胞增殖、凋亡、應(yīng)激反應(yīng)等，在促炎基因的調(diào)節(jié)方面起著至關(guān)重要的作用[20]。在非刺激狀態(tài)下，NF-κB位于細(xì)胞質(zhì)中，由于與抑制蛋白IκB結(jié)合，NF-κB處于沉默狀態(tài)。LPS等刺激物可以誘導(dǎo)IκBα磷酸化、泛素化以及蛋白酶體降解，從而導(dǎo)致NF-κB/IκB復(fù)合物解離。被釋放的NF-κB二聚體經(jīng)過磷酸化后，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，并參與炎癥細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)[21]。本試驗中，甘草查爾酮A處理細(xì)胞后，IκBα、p65蛋白磷酸化受到抑制，表明甘草查爾酮A對于LPS誘導(dǎo)的奶牛蹄真皮細(xì)胞炎性損傷的抑制作用可能與NF-κB信號通路有關(guān)。