基于宏基因組分析酸馬奶的微生物多樣性及功能基因

夏亞男， 劉 皓， 雙 全

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 呼和浩特010000）

傳統(tǒng)酸馬奶（Koumiss）制作和食用歷史悠久，是最受中亞和東歐地區(qū)人們喜愛的傳統(tǒng)發(fā)酵乳飲料，它不僅營(yíng)養(yǎng)豐富，而且對(duì)某些疾病有治療效果[1-2]。在我國(guó)，酸馬奶是一種具有民族特色的發(fā)酵乳飲料， 我國(guó)內(nèi)蒙古和新疆地區(qū)人民對(duì)其十分偏愛。新鮮的馬奶在乳酸菌、酵母菌和其它微生物的共同作用下，經(jīng)特定溫度和時(shí)間發(fā)酵形成酸馬奶。酸馬奶具有良好的、 特殊的風(fēng)味口感和一定的醫(yī)療保健作用，如有助于人體消化吸收、預(yù)防各種腸胃道疾病，還可以降低血脂和膽固醇[3-4]。

酸馬奶獨(dú)特風(fēng)味及功能特性的形成與其復(fù)雜的微生物群落密切相關(guān)。 微生物將鮮馬奶中的各類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪酸等）不斷分解、代謝，生成相應(yīng)的風(fēng)味物質(zhì)以及具有特定功能的生物活性成分。 近年來，采用16s rRNA 技術(shù)[5-6]檢測(cè)酸馬奶的微生物多樣性時(shí)發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)方法發(fā)酵得到的酸馬奶中， 乳酸菌和酵母菌占菌群的絕大部分，不同微生物之間存在相互作用，其微生物菌群體系與開菲爾非常相似[7-8]。采用16s rRNA技術(shù)檢測(cè)酸馬奶的微生物多樣性只能確定到屬水平，無法精確到種水平，對(duì)功能基因的挖掘存在一定的局限性。

宏基因組學(xué)（Metagenonics）是基于提取特定環(huán)境中全部微生物的DNA， 構(gòu)建宏基因組文庫(kù)，來探索微生物群落功能， 挖掘功能基因的一門技術(shù)[5-8]。傳統(tǒng)宏基因組學(xué)研究技術(shù)包括芯片、克隆測(cè)序、變性梯度凝膠電泳等，這些技術(shù)已在許多領(lǐng)域取得重大突破， 例如在土壤和海洋等環(huán)境樣品的研究中[9-11]。 Li 等[12]通過宏基因組學(xué)技術(shù)研究3 種牛乳（新鮮牛乳、含抗生素的牛乳以及經(jīng)巴氏殺菌且含有抗生素的牛乳） 對(duì)牛犢瘤胃中微生物的影響，結(jié)果表明，飲用含有抗生素的牛乳影響瘤胃中微生物群落結(jié)構(gòu)及豐度， 同時(shí)與細(xì)胞周期相關(guān)的酶的數(shù)量也發(fā)生變化。 通過對(duì)功能基因及關(guān)鍵酶的挖掘，揭示牛乳中抗生素殘留的安全問題。

目前，已有對(duì)酸馬奶微生物多樣性的研究，然而，微生物在種水平上尚不明確，功能基因也幾乎處于空白階段，需要開展深入研究。本試驗(yàn)利用宏基因組學(xué)和生物信息學(xué)分析手段， 在分類學(xué)地位“種”水平上對(duì)酸馬奶中核心微生物類群進(jìn)行甄別，分析酸馬奶的微生物多樣性，并挖掘群體微生物中的功能基因， 以期為我國(guó)酸馬奶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展及乳酸菌資源開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

酸馬奶于2019年6月采自于內(nèi)蒙古自治區(qū)錫林郭勒盟阿巴嘎旗。發(fā)酵方法：經(jīng)前處理后的新鮮馬奶倒入酸馬奶發(fā)酵桶中，按照6%的接種量添加酸馬奶自然發(fā)酵劑并在22～26 ℃進(jìn)行發(fā)酵，定時(shí)攪拌確?；旌暇鶆蚯铱焖侔l(fā)酵。 整個(gè)發(fā)酵過程持續(xù)30 h， 發(fā)酵結(jié)束后將酸馬奶樣品密封并在干冰中冷卻，轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室-80 ℃冷凍保存用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2 試劑與儀器

NanoDrop2000 超微量分光光度計(jì)， 美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司；DYY-6C電泳儀，北京市六一儀器廠；GeneAmp9700 型PCR 儀，美國(guó)ABI 公司；5424R 高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)， 美國(guó)Eppendorf 公司；Miseq PE300 測(cè)序儀， 美國(guó)Illumina 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品DNA 抽提 酸馬奶經(jīng)過離心處理后，采用E.Z.N.A土壤DNA 提取試劑盒提取酸馬奶中全部微生物的DNA， 再利用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)抽提微生物基因組的DNA。

1.3.2 宏基因組檢測(cè)

1） 構(gòu)建PE 文庫(kù) 連接“Y”字形接頭；通過磁珠篩選去除接頭自連片段；利用PCR 擴(kuò)增進(jìn)行文庫(kù)模板的富集；氫氧化鈉變性，產(chǎn)生單鏈DNA片段。

2） 橋式PCR 引物堿基與DNA 片段的一端互補(bǔ)， 固定在芯片上；DNA 片段的另一端隨機(jī)與附近的另外一個(gè)引物堿基互補(bǔ)， 也被固定在芯片上，形成“橋（Bridge）”；利用PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)生DNA簇；DNA 擴(kuò)增子線性化成為單鏈。

3） Illumina Hiseq 測(cè)序 加入改造過的DNA聚合酶和帶有4 種熒光標(biāo)記的dNTP，每次循環(huán)只合成一個(gè)堿基；用激光掃描反應(yīng)板表面，讀取每條模板序列第一輪反應(yīng)所聚合上去的核苷酸種類；將“熒光基團(tuán)”和“終止基團(tuán)”化學(xué)切割，恢復(fù)3' 端黏性，繼續(xù)聚合第二個(gè)核苷酸；統(tǒng)計(jì)每輪收集到的熒光信號(hào)結(jié)果，獲知模板DNA 片段的序列。

1.3.3 數(shù)據(jù)分析

1.3.3.1 基因序列拼接組裝及預(yù)測(cè) 使用Megahit拼接軟件對(duì)clean 序列進(jìn)行拼接組裝，根據(jù)不同的kmer 大小進(jìn)行組裝， 從中選擇最優(yōu)結(jié)果。 使用MetaGeneMark 對(duì)拼接結(jié)果中的conting 進(jìn)行基因預(yù)測(cè)，并將其翻譯為氨基酸序列。

1.3.3.2 物種注釋及豐度分析 通過使用Kraken軟件對(duì)測(cè)序酸馬奶數(shù)據(jù)進(jìn)行物種注釋， 獲得物種分類信息。

1.3.3.3 功能基因注釋分析

1） COG 注釋 通過與COG 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行blastp 比對(duì)， 酸馬奶基因可以獲得對(duì)應(yīng)的COG 注釋，再根據(jù)COG 的功能編號(hào)進(jìn)行分類；

2） KEGG 注釋 運(yùn)用FMAP 軟件對(duì)KEGG注釋和差異Module 分析；

3） CAZy 注釋 通過與CAZy 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析， 碳水化合物酶類的物種來源、 酶功能分類、基因序列、蛋白質(zhì)序列及其結(jié)構(gòu)等信息就可以清楚地展現(xiàn)出來。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸馬奶微生物多樣性分析

經(jīng)檢測(cè)，酸馬奶一共鑒定到72 364 條組裝序列，總堿基（15 932 809 200）中堿基G 和C 的含量為45.29%， 堿基質(zhì)量大于或等于20 的堿基可達(dá)97.09%。 基于酸馬奶內(nèi)的物種系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系及相對(duì)信息， 使用KRONA 軟件對(duì)酸馬奶樣物種進(jìn)行標(biāo)注， 酸馬奶中微生物分類在門水平上有30 個(gè)，在科水平上有331 個(gè)，在屬水平上有913 個(gè)，在種水平有2 692 個(gè)。 其中，相對(duì)含量大于1%的優(yōu)勢(shì)菌群在門水平上有2 個(gè)，在科水平上有3 個(gè)，在屬水平上有6 個(gè)，在種水平有8 個(gè)（圖1）。

圖1 酸馬奶樣品微生物群落餅圖Fig.1 Pie chart of microbial community of koumiss

在門水平上，排名前6 位的分別是變形菌門、厚壁菌門、放線菌門、擬桿菌門、軟壁菌門和廣古菌門。優(yōu)勢(shì)菌群是變形菌門和厚壁菌門，相對(duì)含量分別為54.36%和44.55%，占據(jù)總含量的98.91%。在屬水平上，排名前5 位的優(yōu)勢(shì)菌屬是乳桿菌屬、檸檬酸桿菌屬、 腸桿菌屬、 拉烏爾菌屬和乳球菌屬， 相對(duì)含量分別為40.20%，27.71%，10.40%，9.22%和3.37%，占據(jù)總含量的90.90%。 此外，在酸馬奶中發(fā)現(xiàn)了埃希氏菌屬（0.46%）、克雷伯氏菌屬（1.63%）及微量的芽孢桿菌屬（0.01%）和支原菌屬（0.01%）。由于傳統(tǒng)酸馬奶的制作過程中缺少殺菌工藝， 這導(dǎo)致酸馬奶中微生物的群落信息復(fù)雜多樣，所以酸馬奶中除了有益菌乳酸菌等外，還存在著少量的腐敗菌和有害微生物。近些年來，大量文獻(xiàn)報(bào)道稱酸馬奶中發(fā)現(xiàn)較多的抑菌微生物，能產(chǎn)生抗菌肽等抗菌成分[13-15]，這也解釋了未經(jīng)殺菌操作的酸馬奶未產(chǎn)生安全問題的原因。盡管如此，在充分研究酸馬奶微生物及保健功能的基礎(chǔ)上，仍需要進(jìn)一步研究適合于鮮馬奶的殺菌技術(shù)，以保證酸馬奶穩(wěn)定的品質(zhì)及更加突出的保健功效。

在種水平上，相對(duì)含量大于2.0%的優(yōu)勢(shì)菌種主要包含馬乳酒樣乳桿菌、瑞士酸桿菌、弗氏檸檬酸桿菌、解鳥氨酸拉烏爾菌、檸檬酸桿菌和乳酸乳球菌， 其平均相對(duì)含量分別為18.76%，14.84%，13.05%，7.83%，6.22%和2.96%， 其余細(xì)菌相對(duì)含量較少。 其中，馬乳酒樣乳桿菌、瑞士乳桿菌和乳酸乳球菌為酸馬奶常見優(yōu)勢(shì)菌種，本試驗(yàn)中，弗氏檸檬酸桿菌、 解鳥氨酸拉烏爾菌和檸檬酸桿菌平均相對(duì)含量也較高， 且與文獻(xiàn)報(bào)道的酸馬奶中常見優(yōu)勢(shì)菌種含量相近[16-18]，由此可以判斷弗氏檸檬酸桿菌、 解鳥氨酸拉烏爾菌和檸檬酸桿菌也屬于酸馬奶的優(yōu)勢(shì)菌種。 由于研究酸馬奶微生物多樣性確定到細(xì)菌種水平的報(bào)道較少， 該結(jié)果豐富了酸馬奶微生物多樣性的具體類別信息。

2.2 常用數(shù)據(jù)庫(kù)注釋分析

2.2.1 COG 數(shù)據(jù)庫(kù)注釋分析 經(jīng)COG 注釋分析，酸馬奶的10 849 個(gè)基因根據(jù)其功能大致可分為23 類，其中，去除功能未知的R 和S 兩部分，其中功能基因數(shù)目在800 個(gè)以上， 主要有氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝類基因（1 208 個(gè)）、翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)及合成基因（1 207 個(gè)）、碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝類基因（947 個(gè)）、轉(zhuǎn)錄類基因（931 個(gè)）和復(fù)制、重組和修復(fù)類基因（807 個(gè)）；其它類的功能基因統(tǒng)計(jì)結(jié)果見圖2。

圖2 酸馬奶中COG 主要功能分類的基因數(shù)目Fig.2 The number of genes in COG primary functional classification in koumiss

2.2.2 KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)注釋分析 運(yùn)用FMAP 軟件對(duì)酸馬奶的214 338 個(gè)基因進(jìn)行KEGG 注釋和差異Module 分析，統(tǒng)計(jì)其可能參與或涉及的代謝途徑。 酸馬奶功能注釋基因主要可歸屬為6 大類的代謝通路， 主要功能基因二級(jí)代謝途徑有42 類。KEGG 注釋結(jié)果顯示， 酸馬奶功能基因主要位于細(xì)胞群體——原核生物、膜運(yùn)轉(zhuǎn)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、氨基酸代謝、碳水化合物代謝、輔酶因子和維生素的新陳代謝和核苷酸代謝等代謝途徑（圖3）。

圖3 酸馬奶中KEGG 主要功能分類的基因數(shù)目Fig.3 The number of genes in KEGG primary functional classification in koumiss

2.2.3 CAZy 數(shù)據(jù)庫(kù)注釋分析 將酸馬奶基因序列與CAZy 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，酸馬奶共鑒定出3 495 個(gè)碳水化合物活性酶， 其中糖基轉(zhuǎn)移酶（1 238 個(gè)）和糖苷水解酶（1 430 個(gè)）類最多，占據(jù)酸馬奶碳水化合物活性酶的76%， 其次是碳水化合物結(jié)合模塊 （235 個(gè)） 和碳水化合物酯酶（435個(gè)），而輔助活動(dòng)酶（109 個(gè)）和多糖裂合酶（48 個(gè)）類最少， 僅占據(jù)酸馬奶樣品檢測(cè)到酶總數(shù)的4.49%。

2.3 蛋白質(zhì)水解系統(tǒng)基因分析

2.3.1 蛋白酶 在乳制品研究中，芳香族氨基酸、支鏈氧基酸以及含硫氨基酸被認(rèn)為是奶酪風(fēng)味形成的主要前體物質(zhì)， 乳中酪蛋白被細(xì)胞壁黏附蛋白水解為寡肽， 主要控制基因?yàn)镃EPs 族基因prtB， prtP， prtR 等。 馬奶與牛奶在蛋白質(zhì)組成上有較大差別，經(jīng)分析，酸馬奶中未發(fā)現(xiàn)與奶酪風(fēng)味形成相關(guān)的CEPs 族基因，可見酸馬奶與常見奶酪在風(fēng)味形成中的蛋白酶種類也有一定差異。 經(jīng)檢索，酸馬奶中發(fā)現(xiàn)3 種RRT12 蛋白酶[EC：3.4.21.-]和2 種serralysin 金屬蛋白酶基因。RRT12 蛋白酶與枯草溶菌素的形成有關(guān)，而serralysin 金屬蛋白酶的活性依賴于二價(jià)金屬離子鋅同HEXXH 組件的結(jié)合水平（表1）。 盡管檢索到的蛋白酶并不豐富， 但在酸馬奶中發(fā)現(xiàn)第六型蛋白分泌系統(tǒng)（T6SS）基因較豐富，分屬于21 種類型。 第六型蛋白分泌系統(tǒng)（T6SS）是一種廣泛分布于革蘭氏陰性細(xì)菌中、 既能作用于真核細(xì)胞也能作用于細(xì)菌細(xì)胞的蛋白分泌系統(tǒng)， 它通過細(xì)胞間直接接觸和物理性穿透轉(zhuǎn)運(yùn)有細(xì)胞毒性或抗菌的分泌蛋白[19-20]。然而，其分泌蛋白的機(jī)理尚不清楚。此一系列基因的發(fā)現(xiàn)將有助于馬奶樣品中蛋白分解及分泌蛋白的深入解析。

表1 酸馬奶蛋白酶基因分析Table 1 Gene analysis of protease in koumiss

2.3.2 肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng) 蛋白質(zhì)水解系統(tǒng)的第2 階段為胞外蛋白降解形成的短肽及寡肽通過不同的肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)。目前，已知乳酸菌的3 個(gè)肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)為寡肽Opp 系統(tǒng)、二/三肽Dpp 系統(tǒng)和DtpT 系統(tǒng)。 如表2 所示，酸馬奶中存在豐富寡肽Opp 系統(tǒng)（158 個(gè)）和二/三肽Dpp 系統(tǒng)（74 個(gè)）基因， 具有非常強(qiáng)的肽轉(zhuǎn)運(yùn)能力。 在寡肽Opp 系統(tǒng)中， 寡肽Opp 系統(tǒng)寡肽連接蛋白基因數(shù)有75 個(gè)；在二/三肽Dpp 系統(tǒng)中，DppA/P 二/三肽寡肽聯(lián)合蛋白透性酶基因數(shù)有41 個(gè)，表明酸馬奶在寡肽連接、寡肽聯(lián)合蛋白通透性方面具有較好的潛力，而具體功效需進(jìn)一步轉(zhuǎn)錄表達(dá)驗(yàn)證。另外，酸馬奶中不含有DtpT 基因，因此不能對(duì)連接有離子的二肽或三肽進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)。

2.3.3 肽酶 肽酶是蛋白質(zhì)水解系統(tǒng)中至關(guān)重要的組成部分， 不僅可以產(chǎn)生大量維持乳酸菌生長(zhǎng)所必需的氨基酸， 同時(shí)還可以降低乳制品的不良風(fēng)味，如干酪的苦味。 α-酪蛋白和β-酪蛋白水解產(chǎn)生的肽是干酪苦味的主要來源， 利用肽鏈內(nèi)切酶對(duì)其苦味肽進(jìn)行水解已成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。 如表2 所示，酸馬奶中含有17 個(gè)pepO、19 個(gè)pepF 和11 個(gè)PepE 肽鏈內(nèi)切酶的控制基因，說明在發(fā)酵過程中具有潛在的降低苦味肽的能力。 同時(shí)， 酸馬奶中發(fā)現(xiàn)含有PepB （18 個(gè)）、pepN（28個(gè)）、PepM（2 個(gè)）和PepA（9 個(gè)）的編碼基因，這些氨肽酶與抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶活性的ACE 抑制肽的形成有關(guān)[21-22]，表明酸馬奶具有潛在的降血壓功能。 另外，酸馬奶中還具有豐富的二/三肽酶（67 個(gè)）和脯氨酸肽酶（60 個(gè)）。 由此可見，酸馬奶中可能蘊(yùn)含著豐富的風(fēng)味肽及功能肽， 有待后續(xù)進(jìn)一步純化鑒定。

表2 酸馬奶肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)及肽酶基因分析Table 2 Peptide transport system and gene analysis of peptidase in koumiss

2.4 氨基酸風(fēng)味形成途徑

氨基酸風(fēng)味形成途徑是指氨基酸經(jīng)轉(zhuǎn)氨酶作用，轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的酮酸，酮酸較不穩(wěn)定，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的醛類、醇類和酯類，這些都是食品中重要的風(fēng)味成分。

2.4.1 轉(zhuǎn)氨酶 支鏈氨基酸、 芳香族氨基酸以及甲硫氨酸的轉(zhuǎn)氨作用可以通過不同的轉(zhuǎn)氨酶進(jìn)行催化。 在乳酸菌菌株中，支鏈轉(zhuǎn)氨酶（BcAT）顯示了對(duì)支鏈氨基酸和蛋氨酸的催化活力， 而芳香轉(zhuǎn)氨酶（ArAT）對(duì)芳香族氨基酸、亮氨酸和蛋氨酸具有催化活力。 如表3 所示，酸馬奶中編碼了26 個(gè)ArAT 基因，包括ARO8、tyrB、ybdl 3 類，未發(fā)現(xiàn)支鏈轉(zhuǎn)氨酶（BcAT）基因，說明酸馬奶發(fā)酵過程中可對(duì)芳香族氨基酸、 亮氨酸和蛋氨酸進(jìn)行催化。 例如， 亮氨酸可以通過轉(zhuǎn)氨酶轉(zhuǎn)化為α-酮異己酸，有報(bào)道稱α-酮異己酸是發(fā)酵香腸中的主要風(fēng)味物質(zhì)[23]。

2.4.2 酮酸轉(zhuǎn)化酶 酮酸以3 種途徑進(jìn)行進(jìn)一步轉(zhuǎn)化： 第1 種途徑是酮酸經(jīng)過氧化脫羧反應(yīng)可被直接的轉(zhuǎn)化成羧酸。 在這個(gè)途徑中， 酮酸脫氫酶（KaDH）、磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶（PTA）和酰基激酶（ACK）對(duì)支鏈氨基酸的基質(zhì)表現(xiàn)出活性。如表3 所示，酸馬奶基因組存在編碼PTA（8 個(gè)）和ACK（32 個(gè)）的基因。 酸馬奶發(fā)酵過程中可能會(huì)通過該途徑將上述氨基酸的酮酸轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的羧酸類物質(zhì)。 第2 種途徑是酮酸經(jīng)羧酸脫氫酶（HycDH）分解為羧酸。 HycDH 有D-羧酸脫氫酶（D-HycDH）和L-羧酸脫氫酶（L-HycDH）兩種立體專一性酶。目前，雖然并不能證明此途徑可以直接導(dǎo)致風(fēng)味物質(zhì)的形成， 但是卻可以通過將所形成的風(fēng)味物質(zhì)前體分流到非風(fēng)味產(chǎn)品內(nèi)造成風(fēng)味物質(zhì)合成的減少。 酸馬奶基因組中未發(fā)現(xiàn)這2 種羧酸脫氫酶， 不會(huì)因?yàn)橐陨贤緩皆斐烧w風(fēng)味的減少。 第3 種途徑是α-酮酸經(jīng)α-酮酸脫羧酶（KdcA）的催化轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的醛類。截至目前，乳制品微生物組中并未發(fā)現(xiàn)KdcA 活性，這與乳制品發(fā)酵中只有很少暈的氨基酸轉(zhuǎn)化為醛類的觀察結(jié)果相一致。 酸馬奶基因中也未發(fā)現(xiàn)編碼α-酮酸脫羧酶（KdcA）的基因，表明酸馬奶發(fā)酵中不會(huì)通過此途徑對(duì)支鏈氨基酸酮酸進(jìn)行脫羧反應(yīng)，生成相應(yīng)的醛類物質(zhì)。

表3 酸馬奶氨基酸風(fēng)味形成相關(guān)基因分析Table 3 Analysis of amino acid flavor formation gene in koumiss

2.4.3 醇和醛脫氫酶 醛脫氫酶（AldDH）和醇脫氫酶（AlcDH）可以分別催化醛（醇）類物質(zhì)轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的醇類和羧酸類物質(zhì)， 控制基因主要是AlcDH 總科和1 個(gè)雙官能團(tuán)的AlcDH/AldDH 總科。酸馬奶基因中發(fā)現(xiàn)51 個(gè)編碼醇脫氫酶（AlcDH）和68 個(gè)編碼醛脫氫酶（AldDH）的基因，醇脫氫酶（AlcDH）包括Adh1、Adh2、adhP、AKR1A1、yjgB 和yghD 6 類，醛脫氫酶（AldDH）包括adhE、aldB、aldh、mhpF、aldA 和feaB 6 類。 因此酸馬奶發(fā)酵時(shí)具有催化醛類物質(zhì)轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的醇類和羧酸類物質(zhì)的潛能。如可以催化異戊醛、活性戊醛和異丁醛等生成相應(yīng)的異戊醇、活性戊醇和異丁醇，并進(jìn)一步生成相應(yīng)的羧酸類物質(zhì)（如具有甜味和奶酪味的二甲基丁酸，具有汗味的2-異戊酸以及酸甜味的異丁酸）。

2.4.4 乙酰酯酶 帶有短鏈脂肪酸的酯類物質(zhì)大多具有水果風(fēng)味，對(duì)特色乳制品的開發(fā)非常重要。酸馬奶基因中編碼了34 個(gè)可以催化乙酸酯類合成的乙酰酯酶的基因（aes），可以合成具有水果香味的乙酸乙酯、乙酸異丁酯、乙酸正丁酯、乙酸異丁酯等， 為酸馬奶系列產(chǎn)品的風(fēng)味提升及品質(zhì)優(yōu)化提供了思路。

3 結(jié)論

酸馬奶獨(dú)特的風(fēng)味及功能特性的形成與其復(fù)雜的微生物菌群結(jié)構(gòu)密不可分。 本試驗(yàn)基于宏基因組技術(shù)分析酸馬奶的微生物多樣性， 挖掘蛋白質(zhì)分解系統(tǒng)及氨基酸風(fēng)味形成系統(tǒng)的功能基因。酸馬奶中鑒定出微生物30 個(gè)門，331 個(gè)科，913 個(gè)屬，2 692 個(gè)種。 其中，相對(duì)含量大于1%的優(yōu)勢(shì)菌群在門、科、屬、種水平上分別有2，3，6，8 個(gè)。優(yōu)勢(shì)菌種為乳酒樣乳桿菌、瑞士乳桿菌、弗氏檸檬酸桿菌、解鳥氨酸拉烏爾菌、檸檬酸桿菌屬和乳酸乳球菌。 COG、KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)分別注釋到10 849 和214 338 個(gè)基因。 代謝通路中，碳水化合物代謝和氨基酸代謝功能突出， 其次為輔酶因子和維生素的新陳代謝和核苷酸代謝等代謝活動(dòng)。 經(jīng)CAZy數(shù)據(jù)庫(kù)注釋分析，糖基轉(zhuǎn)移酶（1 238 個(gè)）和糖苷水解酶（1 430 個(gè)）的數(shù)量最多，占據(jù)酸馬奶碳水化合物活性酶的76%。 同時(shí)，在蛋白質(zhì)分解系統(tǒng)中，酸馬奶基因中發(fā)現(xiàn)3 種RRT12 蛋白酶、2 種serralysin 金屬蛋白酶、 第六型蛋白分泌系統(tǒng)（T6SS）基因、232 個(gè)肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)及231 個(gè)肽酶控制基因，表明其具有較強(qiáng)的蛋白質(zhì)分解轉(zhuǎn)運(yùn)潛力。 酸馬奶中編碼了26 個(gè)（ArAT）基因、40 個(gè)酮酸轉(zhuǎn)化酶、51個(gè)編碼醇脫氫酶 （AlcDH）、68 個(gè)編碼醛脫氫酶（AldDH）基因和34 個(gè)乙酰酯酶（aes）基因，說明酸馬奶發(fā)酵時(shí)具有從氨基酸形成濃郁風(fēng)味物質(zhì)的基因基礎(chǔ)， 本試驗(yàn)結(jié)果可為酸馬奶品質(zhì)的提升及乳酸菌功能基因庫(kù)的挖掘提供理論依據(jù)。