范韋華, 王重陽

（河南大學邁阿密學院， 河南 開封 475004）

0 引言

多環(huán)芳烴 （Polycyclic Aromatic Hydrocarbons,PAHs）是指分子中含有2 個或2 個以上并環(huán)苯環(huán)結(jié)構(gòu)的持久性有機污染物。由于其在環(huán)境中廣泛分布，難以降解，并具有致癌、致畸、致突變的“三致”特性，嚴重威脅著生態(tài)環(huán)境的穩(wěn)定性和人類的生命健康安全[1]，已引起各方面的廣泛關(guān)注。2005年4月至2013年12月《全國土壤污染狀況調(diào)查公報》數(shù)據(jù)表明，我國受PAHs 污染土壤的點位超標率為1.4%，PAHs污染廣泛分布于耕地、工業(yè)廢棄地、工業(yè)園區(qū)、采油區(qū)、采礦區(qū)、污水灌溉區(qū)、干線公路兩側(cè)等地。

目前對PAHs 的降解方法主要有化學氧化法、光催化氧化法、化學淋洗法、微生物修復技術(shù)、熱修復技術(shù)、電動修復技術(shù)、植物修復技術(shù)等[2]。由于微生物修復技術(shù)具有經(jīng)濟且環(huán)境友好等特點， 因此在處理有機污染物方面具有明顯的優(yōu)勢[3]。 然而，鹽環(huán)境自身具有以下的特殊性：①滲透壓增加,容易破壞細胞膜；②降低溶解氧含量；③鹽析作用使得PAHs 的溶解性降低，繼而進一步降低生物可利用性；④鹽析作用容易導致酶，尤其是胞外酶的變性[4]。 這些性質(zhì)使得具有良好PAHs 降解能力的普通微生物無法在鹽環(huán)境中發(fā)揮功能。 耐鹽/嗜鹽菌具有較好的鹽度耐受性，在鹽環(huán)境中可發(fā)揮良好的降解作用，從而達到去除PAHs 的目的，因此，對此類微生物資源的深入研究將為鹽環(huán)境中PAHs 的降解起到技術(shù)支撐。

1 嗜鹽PAHs 降解菌

近代工業(yè)的發(fā)展使石油得到了越來越廣泛的應(yīng)用，PAHs 是石油中重要的持久性有機污染物之一。 因此， 隨著石油的開采、運輸和使用，大量的PAHs 被排放進入環(huán)境中，造成了嚴重的危害[5]。 生物降解為去除環(huán)境中的PAHs 提供了一種重要的手段，早在1950年，有研究[6]發(fā)現(xiàn)菌屬Pseudomonas中的細菌可在好氧條件下降解PAHs。 1976年KIYOHARA H 等[7]在土壤中分離得到可降解菲的菌屬Aeromonas。 1989年HEITKAMP M A 等[8]在油田的巖石中分離出可降解芘的菌屬Mycobacterium。 截至2018年， 共發(fā)現(xiàn)了100 余屬的細菌具有降解PAHs 的功能， 其中最典型的為Pseudomonas,Mycobacterium,Rhodoccus 等[9]。絕大多數(shù)PAHs 降解菌均為普通菌，缺乏在鹽環(huán)境中降解PAHs 的能力。嗜鹽菌可耐受較為廣泛的鹽度變化， 且具有營養(yǎng)需求簡單、代謝能力強等特點,被認為是鹽環(huán)境中污染物修復的重要微生物資源。 但由于其篩選條件的苛刻，此類微生物資源一直較少。 近年來，隨著對各種PAHs 降解菌的深入研究，分離出的嗜鹽PAHs 降解菌株也越來越多。 如今分離篩選出可降解多環(huán)芳烴的嗜鹽菌主要來自于菌屬Cycloclasticus,Micrococcus,Pseudomonas putida,Alcaligenes,Haloarcula 等。典型的耐鹽/嗜鹽PAHs 降解菌見表1。

表1 典型的耐鹽/嗜鹽PAHs 降解菌

2 嗜鹽PAHs 降解菌的代謝途徑

目前， 對部分嗜鹽菌中PAHs 降解途徑的研究主要集中在真菌（Aspergillus,Penicillium 等）和細菌（Marinobacter,Cycloclasticus 等） 對PAHs 的好氧降解及少數(shù)嗜鹽菌對PAHs 的厭氧降解。

2.1 好氧代謝途徑

好氧降解指微生物在有氧條件下， 將氧氣作為最終電子受體對污染物進行降解。 在PAHs 降解過程中， 真菌一般通過木質(zhì)素酶系(木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶和漆酶)和細胞色素P450 酶系(細胞色素P450、細胞色素b5、NADPH- 細胞色素P450還原酶、NADH-細胞色素b5 還原酶和磷脂) 降解PAHs[10]。 田晶[11]研究發(fā)現(xiàn)中度嗜鹽菌Aspergillus flavus sp. AD-X-1 和Penicillium chrysogenum sp.APD-X-1 通過木質(zhì)素酶系降解PAHs， 木質(zhì)素酶系通過開環(huán)作用把PAHs 代謝成為水溶性較強的醌類中間產(chǎn)物后再由其進行后續(xù)降解。細胞色素P450 單加氧酶氧化PAHs 形成環(huán)氧化物后水解形成反式二氫二醇類衍生物參與接下來的降解反應(yīng)， 或形成中間體與其他物質(zhì)相結(jié)合，進行下一步的降解[12]。

由于降解PAHs 細菌種類更多， 故在降解多環(huán)芳烴的應(yīng)用比真菌更為廣泛。王重陽[9]研究發(fā)現(xiàn)嗜鹽菌Marinobacter sp.N4 和Halomonas sp.G29 通過水楊酸途徑實現(xiàn)對菲的聯(lián)合降解。 于瑤瑤等[13]通過萃取中度嗜鹽菌Demequina salsinemorus sp. BJ1 降解蒽的中間代謝產(chǎn)物進行質(zhì)譜分析， 發(fā)現(xiàn)主要產(chǎn)物為9,10-蒽醌和鄰苯二甲酸等, 說明其通過鄰苯二甲酸途徑降解蒽。 余志偉[14]采用Cycloclasticus sp.P1 通過2 次雙加氧和開環(huán)生成1-羥基-2-萘甲酸后，經(jīng)水楊酸途徑降解芘。 嗜鹽微生物對PAHs 的降解也可以同時存在水楊酸和鄰苯二甲酸途徑。周海燕[15]通過GC-MS 分析嗜鹽菌Halassospira sp.TSL5-1 對芘的降解過程中發(fā)現(xiàn)同時存在水楊酸途徑和鄰苯二甲酸代謝途徑。嗜鹽菌對菲的降解途徑及其中間產(chǎn)物，詳見圖1。

圖1 嗜鹽菌對菲的降解途徑及其中間產(chǎn)物

2.2 厭氧代謝途徑

大多數(shù)微生物需在有氧的條件下降解PAHs，但在江河湖泊的底泥和海底沉積物中， 研究發(fā)現(xiàn)了兼性厭氧PAHs 降解菌和嚴格的PAHs 降解菌。 如NADEZHDA F 等[16]從污水處理廠的污泥中分離出可在厭氧條件下降解PAHs 的菌屬Bacillus cereus，SELESI 等[17]從河道底泥中篩選分離出可降解2-甲基萘的厭氧菌群Desulfobacterium sp.N47。厭氧降解途徑主要利用無機分子作為最終電子受體降解轉(zhuǎn)化PAHs，其主要反應(yīng)涉及羥基化、甲基化、羧化反應(yīng)、延胡索酸鹽結(jié)合反應(yīng)等[18]。 孫明明等[19]研究發(fā)現(xiàn)硫酸鹽還原細菌降解菲的途徑是通過菲分解成對甲酚后進行甲基羥基化， 生成對羥基苯甲醇或?qū)αu基苯甲醛后再進一步轉(zhuǎn)化為對羥基苯甲酸和酚， 最后發(fā)生脫羧反應(yīng)后將菲徹底厭氧降解。

好氧降解不僅效率高而且速率快， 是高鹽環(huán)境下治理PAHs 污染最有效的途徑之一。 而厭氧降解因其中間代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)較為簡單、毒性較小,也逐漸成為多環(huán)芳烴污染治理的有效途徑之一。

3 耐鹽/嗜鹽PAHs 降解菌的降解機制

3.1 耐鹽/嗜鹽PAHs 降解菌降解機制

目前研究發(fā)現(xiàn)降解PAHs 的功能基因簇包括nah，phd，nag，phn，nar，nid 等6 類[20]，大部分可降解多環(huán)芳烴的微生物均含有與它們具有很高同源性的基因簇，而在高鹽環(huán)境下，部分基因簇控制的酶系活性較低，對于嗜鹽菌而言，其降解PAHs 的功能基因簇主要為nah 基因簇和其他基因簇， 嗜鹽PAHs 降解菌nah 降解基因簇排列順序，見圖2。

圖2 嗜鹽PAHs 降解菌nah 降解基因簇排列順序

nah 基因簇是一大類降解基因簇, 目前可分離培養(yǎng)的降解菌株主要以nah 基因簇或經(jīng)典的“nahlike”基因簇為主，如dox，pah，pdo 等。 nah/nah-like基因簇排列順序為nahAaAbAcAdBFCQED, 大部分能降解PAHs 的基因排列順序與組成與其相似。nah降解基因一般由3 個操縱子組成,nah1 編碼的酶將萘轉(zhuǎn)化成水楊酸，nah2 編碼的酶通過間位裂解將水楊酸降解為中間代謝產(chǎn)物進入TCA 循環(huán)， 在nah1和nah2 之間，還存在一個調(diào)節(jié)基因nah3，該基因表達后的蛋白會促進nah1 和nah2 的表達。 如嗜鹽菌群Sphingomonas CHY-1 中基因簇nahAaAbAcAdBFCED 將菲降解成為1,2-二羥基萘，再由基因簇nahGTHINLOMKJ 進一步進行降解，同時在nahR 調(diào)控基因下，菲完全降解[21]。 何芬等[22]通過分析嗜鹽PAHs 降解菌群的6 種萘雙加氧酶（ndo）基因型,發(fā)現(xiàn)其中3 種主要基因型（占總克隆子92.7%）與經(jīng)典nah-like 基因的相似度為89%。 張心平等[23]通過對Pseudomonas sp. ND6 的降解質(zhì)粒pND6 進行DNA雜交實驗， 發(fā)現(xiàn)pND6 質(zhì)粒含有與Pseudomonas sp.G7 菌株NAH7 質(zhì)粒同源基因nahY。 王重陽對嗜鹽菌Marinobacter sp. N4 中PAHs 上游降解基因簇Hpah1 的排列方式與Pseudomonas sp. G7 中PAHs降解基因簇nah1 進行相似性分析， 相似性達80%，其推測認為Marinobacter sp.N4 中的Hpah 與Burkholderiales 中的nag 降解基因可能存在水平轉(zhuǎn)移，并由nag 降解基因在海洋鹽環(huán)境中進化為耐鹽的Hpah 降解基因簇[9]。

目前， 雖然對嗜鹽PAHs 降解基因簇大部分由普通PAHs 降解基因進化而來， 但還存在其他降解基因簇與其差異性較大。 如Rhodococcus sp.OA1 降解基因簇pcaJIGHBARC，與傳統(tǒng)基因簇調(diào)控的鄰苯二酚和水楊酸降解途徑不同， 其可通過原兒茶酸途徑降解PAHs[24]。 耐鹽菌Cycloclasticus sp.A5 功能基因簇phnA1bA1aA2CA4A3D 與普通PAHs 降解菌Burkholderia sp. RP007 中基因簇排列順序phnRSFECDAcAdB 完全不同[25]。據(jù)此推測，嗜鹽菌或具有與普通環(huán)境中PAHs 降解菌類似的降解基因簇，也可能具有與普通降解菌差異較大的基因簇，關(guān)于嗜鹽PAHs 降解菌中的降解基因及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，有待進一步研究。

3.2 耐鹽/嗜鹽PAHs 降解菌的耐鹽機制

嗜鹽菌的耐鹽機制主要有3 個方面： ①吸鉀排鈉；②胞內(nèi)積累小分子相容性溶質(zhì)；③嗜鹽酶的氨基酸組成特性[26]，這3 個機制確保了嗜鹽PAHs 降解菌在高鹽環(huán)境有較好的鹽度耐受性， 可高效降解PAHs。 其中吸鉀排鈉機制主要由nha H 基因、trk 類基因和Kdp 類基因調(diào)控。nha H 基因通過增強Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白的活性而減少嗜鹽菌細胞體內(nèi)的Na+濃度，trk 類基因和kdp 類基因通過調(diào)節(jié)K+/Cl-單向轉(zhuǎn)運蛋白來提高細胞內(nèi)K+濃度，從而維持在高鹽環(huán)境下細胞內(nèi)外的滲透壓平衡。 高鹽壓力下嗜鹽菌在胞內(nèi)會積累小分子相容性溶質(zhì)如糖類、氨基酸等，這些小分子物質(zhì)既不影響細胞代謝還可提高胞內(nèi)水活度，從而使內(nèi)外滲透壓達到平衡。 同時，嗜鹽菌的蛋白質(zhì)肽鏈發(fā)生折疊,形成獨特的功能結(jié)構(gòu)，保證酶活性正常發(fā)揮[27]。

從分子水平來探索其降解途徑和降解機制, 分析菌株在高鹽環(huán)境下對PAHs 的降解特性， 深入研究各類相關(guān)功能基因， 對于研究微生物高效處理高鹽環(huán)境中有機污染物方面具有一定的指導意義，可極大促進對PAHs 污染修復機理的了解， 更好地解釋環(huán)境中PAHs 的去除過程。 同時可結(jié)合已獲得PAHs 降解基因簇以及與耐高鹽相關(guān)基因，探究兩者的協(xié)同作用， 利用調(diào)控基因和嗜鹽酶的氨基酸組成特點等將傳統(tǒng)的PAHs 降解菌改造為耐鹽/嗜鹽PAHs 降解高效基因工程菌，可更好地將其應(yīng)用于微生物修復。 但目前對于耐鹽/嗜鹽菌的研究還不夠深入，何芬等[22]的研究發(fā)現(xiàn)，ndo 基因的相對表達量在鹽度為10%下較在鹽度為20%下高, 證明了鹽度可抑制嗜鹽菌群功能基因的表達， 從而影響其降解速率。 但確切的鹽度對PAHs 生物降解的影響機制仍有待深入研究。

4 結(jié)論

多環(huán)芳烴的生物降解是目前國內(nèi)外研究的一大熱點，無論是降解特性、降解途徑、降解機制還是實際應(yīng)用等均有深入的研究。 但是如今對于一些極端條件下，PAHs 降解菌屬不夠豐富，對其降解機理的認知仍然不足。 隨著高鹽環(huán)境中的多環(huán)芳烴污染日益嚴重， 嗜鹽微生物的篩選和分子機制等方面的研究仍將是今后研究的熱點。 目前嗜鹽PAHs 的降解菌屬約有100 多種， 根據(jù)對PAHs 的降解途徑一般分為好氧降解和厭氧降解。 好氧降解主要通過鄰苯二甲酸和水楊酸代謝途徑降解， 厭氧降解中間代謝產(chǎn)物簡單，主要涉及羥基化、甲基化、羧化反應(yīng)、延胡索酸鹽結(jié)合反應(yīng)等。 嗜鹽菌降解PAHs 的功能基因簇主要來源于普通的PAHs 降解基因簇的進化或其他差異較大的基因簇。 嗜鹽菌的耐鹽機制包括吸鉀排鈉、 積累小分子相容性溶質(zhì)和嗜鹽酶的氨基酸組成特性3 方面。 關(guān)于嗜鹽PAHs 降解菌的研究可為在高鹽堿環(huán)境下多環(huán)芳烴污染修復工程的實際應(yīng)用提供科學依據(jù)。 如可利用微生物技術(shù)去富集篩選降解PAHs 的嗜鹽菌純菌或核心小菌群并對其降解途徑和降解特性進行研究， 對相關(guān)功能基因進行篩選擴增,通過基因重組、原生質(zhì)體融合等各種構(gòu)建技術(shù)等分子生物學手段去構(gòu)建高效基因工程菌以達到高效的生物修復。