尹令迪，王立友，張翠云，王永剛

（魯南制藥集團(tuán)股份有限公司中藥制藥共性技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 臨沂 276006）

腸易激綜合征是一種常見(jiàn)的慢性胃腸道疾病，雖不危及生命，但它嚴(yán)重影響生活質(zhì)量，分為腹瀉、便秘、混合、不定型等四種亞型[1]，發(fā)病機(jī)制包括腸動(dòng)力紊亂、內(nèi)臟超敏反應(yīng)、粘膜和免疫功能改變、腸道菌群改變和腦-腸軸改變[2]，多種發(fā)病機(jī)制往往引發(fā)其他非胃腸道疾病，大多數(shù)患者患有社會(huì)心理問(wèn)題，以焦慮抑郁為主[3]。抑郁癥，中醫(yī)學(xué)稱(chēng)之為“郁證”“臟躁”等，多因情緒刺激導(dǎo)致臟腑功能失調(diào)，脾胃失調(diào)。臨床抑郁癥患者除心情低落，情緒低迷等心理問(wèn)題，還常表現(xiàn)出胃腸道功能紊亂，腹痛、腹脹、腹瀉或便秘等癥狀。半夏瀉心湯源于《傷寒論》，是以治療腸胃寒熱錯(cuò)雜為主的名方，全方由半夏、干姜、黃芩、黃連、人參、甘草、大棗7 味藥物組成，辛開(kāi)苦降、平調(diào)寒熱、調(diào)理氣機(jī)、攻補(bǔ)兼施。近年來(lái)，隨著對(duì)半夏瀉心湯研究不斷深入，臨床應(yīng)用已不再局限于胃腸道疾病，在多種疾病的治療中均有確切療效。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究半夏瀉心湯“異病同治”腸易激綜合征和抑郁癥，闡明其在這兩個(gè)疾病領(lǐng)域的作用機(jī)制，為臨床系統(tǒng)發(fā)揮半夏瀉心湯的治療作用提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

TCMSP 數(shù) 據(jù) 庫(kù)[4]（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）；Uniprot 數(shù) 據(jù) 庫(kù)[5]（https://www.uniprot.org/）；OMIM 數(shù) 據(jù) 庫(kù)[6]（https://omim.org/）；DisGeNET 數(shù) 據(jù)庫(kù)[7]（https://www.disgenet.org/）； GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)[8]（https://www.genecards.org/）；GeneMap 數(shù) 據(jù) 庫(kù)[6]（https://omim.org/search/advanced/geneMap）；RCSBPDB 數(shù)據(jù)庫(kù)[9]（https://www.rcsb.org/）；String 數(shù)據(jù) 庫(kù)（https://cn.string-db.org/）；Metascape 數(shù) 據(jù) 庫(kù)（https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1）；Pubchem 數(shù) 據(jù) 庫(kù)[10]（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）；Cytoscape 3.8.2 軟 件；Autoduck 4.2.6 軟 件；Pymol 2.4.0 軟件；Autodock Tools 1.5.6 軟件。

1.2 方法

1.2.1 半夏瀉心湯活性成分及其潛在靶點(diǎn)預(yù)測(cè)與篩選 半夏瀉心湯由半夏、黃連、黃芩、人參、大棗、干姜、甘草七味藥組成，通過(guò)TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)分別查找七味中藥的化學(xué)成分，并以O(shè)B ≥30%，DL ≥0.18 為條件篩選出潛在的活性化學(xué)成分。再通過(guò)TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)篩選出的活性成分的潛在作用靶點(diǎn)蛋白，利用Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)，物種設(shè)置為Human，將靶點(diǎn)蛋白與基因信息進(jìn)行比對(duì)匹配，獲得潛在靶點(diǎn)的基因名。

1.2.2 腸易激綜合征及抑郁癥相關(guān)靶點(diǎn)篩選 以“irritable bowel syndrome”“depressive disorder”為關(guān)鍵詞，在OMIM、DisGeNET、Gene Cards 和GeneMap數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索與疾病相關(guān)的靶點(diǎn)，合并所有數(shù)據(jù)庫(kù)的靶點(diǎn)結(jié)果，刪除重復(fù)靶點(diǎn)，匯總腸易激綜合征及抑郁癥疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)。

1.2.3 藥物-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)及共有靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 將半夏瀉心湯藥物活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)基因與腸易激綜合征和抑郁癥相關(guān)疾病靶點(diǎn)基因進(jìn)行交集匹配，通過(guò)InteractiVenn 平臺(tái)繪制韋恩圖，獲得三者共同靶點(diǎn)，即半夏瀉心湯治療腸易激綜合征和抑郁癥的相關(guān)靶點(diǎn)基因，再通過(guò)Cytoscape 3.8.2 軟件構(gòu)建“半夏瀉心湯-活性成分-交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。

將共同靶點(diǎn)基因?qū)隨tring 數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建共有靶點(diǎn)蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)，再通過(guò)Cytoscape 3.8.2 軟件對(duì)PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觥?/p>

1.2.4 GO 功能分析及KEGG 通路富集分析 將半夏瀉心湯與腸易激綜合征及抑郁癥的共同靶點(diǎn)基因?qū)隡etascape 數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)這些靶點(diǎn)進(jìn)行GO 功能富集分析及KEGG 通路富集分析，并進(jìn)行可視化。

對(duì)相關(guān)KEGG 通路涉及基因進(jìn)行分析，同時(shí)構(gòu)建共同基因關(guān)鍵網(wǎng)絡(luò)模塊，篩選半夏瀉心湯治療腸易激綜合征和抑郁癥的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.2.5 構(gòu)建靶點(diǎn)的組織分布及亞細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)圖 將半夏瀉心湯治療疾病的關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入BioGPS 平臺(tái)獲取靶點(diǎn)組織分布信息，將基因表達(dá)量排序前5 的組織導(dǎo)入Cystocape 繪制關(guān)鍵靶點(diǎn)組織分布網(wǎng)絡(luò)圖；將半夏瀉心湯治療疾病的關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)以獲取各關(guān)鍵靶點(diǎn)的亞細(xì)胞分布數(shù)據(jù)，將每個(gè)基因表達(dá)量排序前五的亞細(xì)胞分布表導(dǎo)入Cytoscape 軟件繪制關(guān)鍵靶點(diǎn)亞細(xì)胞分布圖。

1.2.6 分子對(duì)接驗(yàn)證 采用Autoduck4.2.6 軟件和Pymol 軟件將關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白與半夏瀉心湯中的潛在活性成分進(jìn)行分子對(duì)接，比較活性成分與疾病靶點(diǎn)之間的結(jié)合活性。具體方法為：通過(guò)RCSBPDB 數(shù)據(jù)庫(kù)[9]（https://www.rcsb.org/）、Pubchem 數(shù) 據(jù) 庫(kù)[10]（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）及TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)下載靶點(diǎn)蛋白的三維晶體結(jié)構(gòu)及半夏瀉心湯關(guān)鍵成分的分子結(jié)構(gòu)；使用Pymol、AutoDock Vina 進(jìn)行分子對(duì)接，分析蛋白和成分之間結(jié)合能最低的組合并可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 半夏瀉心湯活性成分及其潛在靶點(diǎn)篩選

以半夏瀉心湯七味中藥名為關(guān)鍵詞在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索其化學(xué)成分，通過(guò)篩選后共獲得192 個(gè)活性成分，其中半夏13 個(gè)、黃芩36 個(gè)、黃連14 個(gè)、人參15 個(gè)、干姜5 個(gè)、大棗15 個(gè)、甘草94 個(gè)。利用Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)將靶點(diǎn)蛋白與轉(zhuǎn)換為基因名，去重后，共獲得潛在靶點(diǎn)的基因215 個(gè)，即半夏瀉心湯可通過(guò)該215 個(gè)基因靶點(diǎn)發(fā)揮作用。

2.2 藥物-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過(guò)OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)、DisGeNET 數(shù)據(jù)庫(kù)、Gene Cards 數(shù)據(jù)庫(kù)和GeneMap 數(shù)據(jù)庫(kù)，檢索腸易激綜合征和抑郁癥，得到腸易激綜合征靶點(diǎn)基因1 493 個(gè)，抑郁癥靶點(diǎn)基因1 892 個(gè)。通過(guò)InteractiVenn 平臺(tái)繪制韋恩圖，見(jiàn)圖1，獲得半夏瀉心湯與疾病共同靶點(diǎn)60個(gè)。將藥物與疾病共同靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 中進(jìn)行可視化操作，其結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖1 半夏瀉心湯對(duì)腸易激綜合征和抑郁癥的藥物-疾病交集靶點(diǎn)韋恩圖Fig. 1 Venn diagram of the drug-disease intersection target of Banxia Xiexin decoction on irritable bowel syndrome and depressive disorder

圖2 半夏瀉心湯-活性成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig. 2 Banxia Xiexin decoction -active ingredient-intersection target network diagram

2.3 共有靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

將60 個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫(kù)，限定物種為人，對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行分析，獲得半夏瀉心湯治療腸易激綜合征及抑郁癥的相關(guān)靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖3A，該網(wǎng)絡(luò)中有60 個(gè)節(jié)點(diǎn)，567 條邊，平均節(jié)點(diǎn)度是18.9，平均局部聚類(lèi)系數(shù)是0.655。利用Cytoscape中Network Analyzer 工具分析網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)的度值（Degree），構(gòu)建PPI 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖3B。

圖3 PPI蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖（A）和PPI蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析網(wǎng)絡(luò)（B）Fig. 3 PPI protein interaction network diagram (A) and PPI protein interaction network topology analysis network(B)

2.4 GO 功能分析結(jié)果

將60 個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO功能富集分析,主要包含分子功能（MF），生物過(guò)程（BP）和細(xì)胞組成（CC）三個(gè)部分的分析。將GO數(shù)據(jù)進(jìn)行整理作圖，見(jiàn)圖4，其中分子功能主要涉及神經(jīng)遞質(zhì)受體活性，兒茶酚胺結(jié)合，蛋白偶聯(lián)受體活性及乙酰膽堿結(jié)合活性等過(guò)程；生物過(guò)程主要涉及蛋白磷酸化，氧化代謝，化學(xué)突觸傳遞，對(duì)外源性物質(zhì)刺激的反應(yīng)以及對(duì)脂多糖的調(diào)節(jié)反應(yīng)等過(guò)程；細(xì)胞過(guò)程涉及突觸后膜，細(xì)胞受體及內(nèi)吞小泡等過(guò)程。

圖4 半夏瀉心湯對(duì)腸易激綜合征和抑郁癥共同作用靶點(diǎn)的GO 功能分析Fig. 4 GO function analysis of the target of the combined effect of Banxia Xiexin decoction on irritable bowel syndrome and depression

2.5 KEGG 通路分析

利用Metascape 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)60 個(gè)交集靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 通路富集分析，選擇P＜0.01 的前20 KEGG通路進(jìn)行分析篩選，結(jié)果見(jiàn)圖5，半夏瀉心湯主要通過(guò)HIF-1 信號(hào)通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、NF-κB 信號(hào)通路、T 細(xì)胞受體信號(hào)通路、5-羥色胺突觸、多巴胺突觸、突觸囊泡周期以及VEGF 信號(hào)通路發(fā)揮作用。

圖5 半夏瀉心湯對(duì)腸易激綜合征和抑郁癥共同作用靶點(diǎn)的KEGG 通路富集分析Fig. 5 KEGG pathway enrichment analysis of the combined effect of Banxia Xiexin decoction on the combined effects of irritable bowel syndrome and depression

將KEGG富集分析所得通路及靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape中，構(gòu)建KEGG 靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖6，由圖可知各通路與各自靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系。

圖6 KEGG 通路作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig. 6 KEGG pathway target network diagram

2.6 關(guān)鍵靶點(diǎn)的組織分布

將關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入BioGPS 平臺(tái)來(lái)獲取組織分布信息，將每個(gè)基因表達(dá)量排序前5 的組織導(dǎo)入Cystocape 繪制關(guān)鍵靶點(diǎn)組織分布網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖7，其中，杏仁核、結(jié)腸、小腸、扣帶皮質(zhì)、前額葉皮質(zhì)、枕葉、丘腦下核在半夏瀉心湯治療腸易激綜合征和抑郁癥過(guò)程中發(fā)揮著極為重要的作用，同時(shí)也可以看出，CD33+、CD44+、淋巴母細(xì)胞等炎性細(xì)胞也發(fā)揮著不可忽視的作用。

圖7 核心靶點(diǎn)的組織分布網(wǎng)絡(luò)圖Fig. 7 Tissue distribution network diagram

2.7 分子對(duì)接

通過(guò)Autoduck4.2.6 軟件和Pymol 軟件對(duì)篩選出的疾病相關(guān)靶點(diǎn)與藥物潛在活性成分進(jìn)行分子對(duì)接，記錄靶點(diǎn)和成分的對(duì)接結(jié)合能，對(duì)接結(jié)果以熱圖形式展示，見(jiàn)圖8，紅色越淺，結(jié)合能越低，意味著藥物分子與靶點(diǎn)結(jié)合所需能量越少，預(yù)測(cè)其在體內(nèi)結(jié)合產(chǎn)生作用的可能性更大。

圖8 半夏瀉心湯活性成分與核心靶點(diǎn)蛋白分子對(duì)接結(jié)合能熱圖Fig. 8 Heat map of the binding energy of the active ingredient of Banxia Xiexin decoction with the core target protein molecule

部分分子對(duì)接結(jié)合方式見(jiàn)圖9，活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白的氨基酸殘基主要通過(guò)氫鍵和范德華力結(jié)合，分子對(duì)接結(jié)果顯示半夏瀉心湯活性成分與通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出的關(guān)鍵蛋白靶點(diǎn)對(duì)接結(jié)果較好。

圖9 部分分子對(duì)接示意圖Fig. 9 Schematic diagram of partial molecular docking

3 討論

半夏瀉心湯源于東漢張仲景所著《傷寒論》，主要由七味中藥構(gòu)成，半夏、干姜辛溫通陽(yáng)開(kāi)痞，黃連、黃芩寒苦降泄邪熱，人參、甘草、大棗甘溫扶中。歷代醫(yī)家對(duì)半夏瀉心湯的主治病癥記載絕大多數(shù)為心下痞證， 如仲景《傷寒論》中對(duì)該方的記述“若心下滿(mǎn)而硬痛者，此為結(jié)胸也，大陷胸湯主之。但滿(mǎn)而不痛者，此為痞，柴胡不中與之，宜半夏瀉心湯”。劉爽等[11]認(rèn)為半夏瀉心湯中半夏開(kāi)郁散結(jié)而助氣之出，黃芩清泄半里而助氣之入，人參、甘草、大棗益氣，氣足則清氣自升，黃連通泄三焦，助氣之降，干姜為佐，一則制半夏之毒，一則制芩連之寒，諸藥協(xié)同，發(fā)揮療效。因此，半夏瀉心湯以調(diào)節(jié)胃腸道功能為主，同時(shí)可調(diào)節(jié)氣機(jī)升降出入，緩解失眠[12]和抑郁[13]，其治療范圍遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了張仲景的“心下痞”的病癥。因此本文欲通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接探究半夏瀉心湯“異病同治”腸易激綜合征和抑郁癥的機(jī)制。

半夏瀉心湯七味中藥所含化學(xué)成分較多，篩選出具有臨床意義的活性化學(xué)成分192 個(gè)，其中能作用于腸易激綜合征和抑郁癥疾病靶點(diǎn)的成分有60 個(gè)，對(duì)多重靶點(diǎn)發(fā)揮作用的成分有6 個(gè)，分別是槲皮素、山柰酚、黃芩素、β-谷甾醇、豆甾醇、小檗堿。

研究報(bào)道槲皮素可以促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖，又能抑制T 細(xì)胞和B 細(xì)胞的增殖，抑制機(jī)體TNF-α、IL-6等炎癥因子的表達(dá)[14]；LIN R 等[15]研究表明槲皮素通過(guò)減少氧化應(yīng)激因子的表達(dá)發(fā)揮抗炎作用，維持相對(duì)有效的針對(duì)大腸癌的抗腫瘤活性； SADIGHPARVAR S 等[16]實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)槲皮素可以通過(guò)抑制炎癥上調(diào)前額葉皮質(zhì)中的BDNF（腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子） /TRKβ（酪氨酸受體激酶B）/β-Catenin（β-連環(huán)蛋白），發(fā)揮有效的抗腫瘤和抗抑郁作用。小檗堿以及其它化合物都被證明有抗炎及抗抑郁的作用[17]。

腸易激綜合征作為一種多因素導(dǎo)致的胃腸道功能紊亂性疾病，與腸道感染、腸道炎癥、胃腸動(dòng)力異常、腸道菌群紊亂及精神心理障礙等因素有關(guān)[2]。抑郁癥的社會(huì)轉(zhuǎn)導(dǎo)理論認(rèn)為社會(huì)環(huán)境逆境會(huì)作用于機(jī)體心理及激素水平，上調(diào)炎癥過(guò)程，不僅會(huì)誘發(fā)抑郁癥狀，同時(shí)會(huì)伴有焦慮癥、哮喘、胃腸炎疾病以及心血管病等疾病[18]。因此，可將腸易激綜合征和抑郁癥協(xié)同治療，異病同治，提高臨床患者依從性。本研究對(duì)半夏瀉心湯與腸易激綜合征及抑郁癥的共同作用靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 通路富集分析，主要涉及HIF-1 信號(hào)通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、NF-κB 信號(hào)通路、T 細(xì)胞受體信號(hào)通路、5-羥色胺突觸、多巴胺突觸、突觸囊泡周期以及VEGF 信號(hào)通路有關(guān)，這些通路皆與炎癥和信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)，尤其5-羥色胺作為一類(lèi)抗抑郁成分，促進(jìn)機(jī)體大腦產(chǎn)生愉悅感，緩解抑郁情緒[19]。關(guān)鍵靶點(diǎn)以分布在杏仁核、結(jié)腸、小腸、扣帶皮質(zhì)、前額葉皮質(zhì)、枕葉、丘腦下核等部位為主，意味著半夏瀉心湯通過(guò)對(duì)大腦部分部位及腸道部位的靶點(diǎn)發(fā)揮抗炎及興奮刺激的功能，從而“異病同治”腸易激綜合征和抑郁癥。

對(duì)疾病相關(guān)通路對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)進(jìn)行分析，篩選得到10 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，對(duì)關(guān)鍵活性成分及靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行分子對(duì)接，對(duì)接結(jié)果預(yù)測(cè)該化合物成分在機(jī)體內(nèi)的結(jié)合作用方式用分子對(duì)接熱圖顯示，6 個(gè)活性化學(xué)成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)結(jié)合能力較好，推斷其能夠在機(jī)體內(nèi)作用于關(guān)鍵靶點(diǎn)發(fā)揮抗炎或抗抑郁的作用。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接，預(yù)測(cè)半夏瀉心湯“異病同治”腸易激綜合征及抑郁癥的作用及機(jī)制通路，以整體化思路探究方劑組合通過(guò)多靶點(diǎn)、多通路、多效應(yīng)所發(fā)揮的作用，恰與疾病發(fā)病機(jī)制的多環(huán)節(jié)、多因素契合。將中醫(yī)“異病同治”傳統(tǒng)理念與現(xiàn)代網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)相融合，以現(xiàn)代理論技術(shù)傳承中醫(yī)經(jīng)典名方與系統(tǒng)性整體性分析古方藥效發(fā)揮治療作用的通路機(jī)制，為探索中醫(yī)藥經(jīng)典名方治療不同疾病時(shí)所發(fā)揮協(xié)同作用的藥理學(xué)機(jī)制提供新的研究思路。