GA3處理對(duì)木薯類胡蘿卜素生物合成的影響

羅秀芹　薛晶晶　蔡杰　安飛飛　朱文麗　陳松筆

摘? 要：木薯（ Crantz）屬大戟科木薯屬熱帶作物，具有耐干旱貧瘠等特性，木薯葉片富含蛋白質(zhì)，塊根富含淀粉但是缺乏類胡蘿卜素，是熱帶低收入人口的主糧。國(guó)家木薯產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系“十三五”期間關(guān)于木薯產(chǎn)業(yè)問(wèn)題指出，類胡蘿卜素是糧飼化的重要指標(biāo)，類胡蘿卜素也是維生素A的前體物質(zhì)。本文在前期研究中篩選到與類胡蘿卜素生物合成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子MeGAMYB，MeGAMYB是一種受GA響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子。為了研究其如何介導(dǎo)GA促進(jìn)類胡蘿卜素生物合成的分子機(jī)制，明確其與類胡蘿卜素含量及其生物合成途徑基因的相關(guān)關(guān)系，本研究用50?mg/L濃度GA處理培養(yǎng)40?d的‘SC9’莖稈水培苗，在0、3、6、9、12?h取根、莖、葉和葉柄樣品檢測(cè)類胡蘿卜生物合成中相關(guān)基因的表達(dá)情況以及在0、1、2、3、4 d檢測(cè)類胡蘿卜素含量，平行對(duì)照用水處理，結(jié)果顯示：類胡蘿卜代謝途徑中相關(guān)基因以及類胡蘿卜素生物合成受GA誘導(dǎo)，其中葉片在處理4 d時(shí)α-胡蘿卜素含量最高達(dá)到0.19 μg/g，是對(duì)照的1.2倍;葉片中β-胡蘿卜素含量在GA處理3?d時(shí)最高達(dá)107.73?μg/g，是對(duì)照的1.25倍，葉黃素和玉米黃質(zhì)的含量在處理4?d內(nèi)都隨著GA處理時(shí)間延長(zhǎng)含量呈不斷增加的趨勢(shì)。而類胡蘿卜素生物合成相關(guān)基因如、、、、、、和等和轉(zhuǎn)錄因子MeGAMYB的表達(dá)量受GA均上調(diào)，其中、、、、和等基因的表達(dá)趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)趨勢(shì)一致。本研究可以看出，GA能促進(jìn)木薯類胡蘿卜素的合成，通過(guò)調(diào)控類胡蘿卜素生物合成相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)促進(jìn)類胡蘿卜素的積累，但是具體的調(diào)控機(jī)制還需要進(jìn)一步闡釋。本結(jié)果為研究木薯類胡蘿卜素代謝調(diào)控機(jī)制提供候選功能基因與轉(zhuǎn)錄因子，為闡述木薯類胡蘿卜素生物合成的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：木薯;類胡蘿卜素;生物合成;赤霉素

中圖分類號(hào)：S533??????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Effects of GA Treatment on Carotenoids Biosynthesis in Cassava

LUO Xiuqin XUE Jingjing ?CAI Jie ?AN Feifei ZHU Wenli CHEN Songbi

Tropical Crops Genetic Resources Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences （CATAS）， Haikou， Hainan 571101， China

Crantz （Cassava） is a tropical crop of euphorbiaceae， with the characteristics of drought resistance and infertility. Cassava leaves are rich in protein， and its roots are rich in starch， while poor in carotenoids. Cassava is the staple food of low-income populations in the tropics. The Chinese Cassava Agro-technology System proposed that the content of carotenoids is an important index of cassava diet and feeding during the 13th Five-Year Plan. And carotenoids are also the precursor of vitamin A. A transcription factor MeGAMYB associated with carotenoids biosynthesis was screened out in the previous study， which is a transcription factor responsive to GA. In order to research the molecular mechanism of how MeGAMYB mediateing GA to promote carotenoids biosynthesis in cassava， and to clarify its correlation with carotenoids content and biosynthesis pathway genes， we treated ‘SC9’ seedlings， which grew up in water culture 40 days with 50?mg/L GA in present study， and collected the root， stem， leaf， and petiole samples on 0， 3， 6， 9， 12 hour to detect the gene expression in the carotenoids biosynthesis pathway， and extracted and detected the content of carotenoids on 0， 1， 2， 3， 4 day. The genes involved in the carotenoids metabolic pathway and carotenoids content were both induced by GA. The maximum content of α-carotene in the leaf was 0.19?μg/g with four days treatment， which was1.2 times than that of the control. The maximum content of β-carotene in the leaf was 107.73?μg/g with 3 days GA treatment， which was 1.25 times higher than that of the control. The content of lutein and zeaxanthin in the leaf increased with the extension of GA treatment in four days. The expression level of the carotenoids biosynthesis related genes such as ， ， ， ， ， ， and etc. and transcription factor MeGAMYB were all up-regulated in 50?mg/g GAtreatment. The expression trend of ， ， ， ， and etc. genes was the same as that of . The? study reveals that GAcan promote? carotenoids biosynthesis in cassava， through regulating the gene expression in carotenoids biosynthesis to promote the accumulation of carotenoids content. While the specific regulatory mechanism needs further explanation. The results would provide candidate genes and transcription factors MeGAMYB for studying carotenoids metabolic regulation mechanisms in cassava. Our research would lay a foundation for elucidating the mechanism of carotenoids biosynthesis in cassava.

M Crantz; carotenoids; biosynthesis; gibberellin （GA）

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.02.015

木薯是世界三大薯類作物之一，起源于熱帶美洲，是世界第六大糧食作物，因其適應(yīng)性強(qiáng)，耐旱、耐貧瘠等優(yōu)勢(shì)而被廣泛栽培于熱帶和部分亞熱帶地區(qū)，是熱帶濕地低收入農(nóng)戶的主要食糧，全世界約有8億人用木薯作食物。除作為糧食作物外，木薯在化工、醫(yī)藥、紡織等方面均有重要作用，在我國(guó)南方，木薯主要作為我國(guó)淀粉和生物質(zhì)能源的重要原料。木薯塊根中塊根富含淀粉，但是缺乏鐵、鋅、類胡蘿卜素等。近年來(lái)，隨著國(guó)家木薯產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系提出木薯糧飼化和特用化的產(chǎn)業(yè)需求，木薯多用途的潛在價(jià)值逐漸得到發(fā)揮，如木薯作豬、牛、羊和蠶飼料。前期研究表明，不同木薯種質(zhì)的塊根、根、莖、葉及葉柄中都含有類胡蘿卜素并且該性狀受多基因控制。

類胡蘿卜素是一種以異戊二烯為基礎(chǔ)單位聚合而成的萜類化合物，類胡蘿卜素種類有很多種，在高等植物中類胡蘿卜素的合成除受光、氧氣、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等外部條件影響外，也受其激素及內(nèi)在基因的調(diào)控。前期通過(guò)類胡蘿卜素群體關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)木薯轉(zhuǎn)錄因子GAMYB與其類胡蘿卜素合成相關(guān);激素是調(diào)控類胡蘿卜素合成的關(guān)鍵非生物因子，木薯類胡蘿卜素積累受激素調(diào)控，類胡蘿卜素作為ABA生物合成的前體，外源噴施ABA能讓木薯塊根類胡蘿卜素相關(guān)基因和蛋白表達(dá)增強(qiáng)，β-胡蘿卜素含量提高。據(jù)研究報(bào)道基因組成型過(guò)量表達(dá)，打亂了植株體內(nèi)激素代謝平衡，使得赤霉素GA和脫落酸ABA的合成量減少，引起植株生長(zhǎng)異常，反而最終抑制類胡蘿卜素合成，說(shuō)明類胡蘿卜素的合成受植物激素ABA和GA的影響。因此本文采用‘SC9’木薯莖稈水培苗為研究對(duì)象，用GA誘導(dǎo)木薯水培苗，對(duì)木薯葉片中4種類胡蘿卜素的積累均起到不同程度的促進(jìn)作用，分析GA對(duì)木薯根、莖、葉和葉柄中類胡蘿卜素生物合成相關(guān)基因及轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)情況和類胡蘿卜素的含量之間的關(guān)系，從而為闡釋木薯GAMYB轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)GA促進(jìn)木薯類胡蘿卜素生物合成的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

?材料與方法

? 材料

供試材料為‘SC9’成熟期木薯莖稈，‘SC9’為中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所國(guó)家審定品種，種植于儋州市國(guó)家木薯種質(zhì)資源圃。

? 方法

‘SC9’木薯莖稈用300?mL塑料杯自來(lái)水培養(yǎng)，每隔3?d換一次水，室外正常光照。40?d后，用50?mg/L GA水溶液替換自來(lái)水進(jìn)行處理，分別在0、3、6、9、12?h取根、莖、葉和葉柄樣品，用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)類胡蘿卜素生物合成途徑中相關(guān)基因及轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)情況和檢測(cè)0、1、2、3、4?d取根、莖、葉和葉柄樣品，用HPLC技術(shù)檢測(cè)類胡蘿卜素的含量。平行對(duì)照用自來(lái)水處理相同時(shí)間點(diǎn)取樣檢測(cè)。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2.1? RNA的提取與定量PCR? 保存的樣品用液氮研磨至粉碎，稱取約0.1?g粉末參照TIANGEN植物總RNA 提取試劑盒（多糖多酚類）提取根、莖、葉和葉柄的總RNA，用nanodrop和瓊脂糖凝膠電泳分別檢測(cè)RNA濃度以及完整度，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈參照TRANSGEN公司cDNA第一鏈合成試劑盒。

通過(guò)Phytozome 13網(wǎng)站查找到轉(zhuǎn)錄因子及木薯類胡蘿卜素生物合成相關(guān)基因的序列，并用Primier 5進(jìn)行定量引物設(shè)計(jì)，包括、、、、、、、、、和以及內(nèi)參基因?yàn)椋ū?）。利用合成的cDNA第一鏈稀釋5倍為模板，用諾唯贊生物技術(shù)有限公司的SYBR Premix Ex Taq II 進(jìn)行定量PCR。

1.2.2? 類胡蘿卜素的提取與測(cè)定? 保存的樣品用液氮研磨至粉碎，根、莖、葉和葉柄稱取約0.5?g粉末，加入5.0?mL的三氯乙烷∶無(wú)水乙醇（∶=1∶1）提取液，12?000?r/min離心5?min，取3.0?mL上清液用氮?dú)獯蹈?，加?.6?mL 20%氫氧化鉀-甲醇復(fù)溶，50℃水浴60?min，用0.22?μm的有機(jī)相濾膜過(guò)濾后待測(cè)備用。

吸取0.2?mL過(guò)濾樣品于內(nèi)襯管，放置液相樣品瓶中，HPLC測(cè)定類胡蘿卜素含量。測(cè)定條件：色譜柱agilentHC-C18（2）（250?mm×4.6 mm，5?μm）;流動(dòng)相：乙腈A、異丙醇B;洗脫程序：0～10?min，100%A，0～15 min，20%A，15～30 min，100%A;流速：1?mL/min;進(jìn)樣量：10?μL;柱溫為室溫;檢測(cè)波長(zhǎng)：450?nm。α-胡蘿卜素（純度>98%）、β-胡蘿卜（純度>98%）、葉黃素（純度>98%）、玉米黃質(zhì)（純度>98%）等標(biāo)準(zhǔn)品為Sigma公司，標(biāo)準(zhǔn)品均用甲醇溶解稀釋。

?? 數(shù)據(jù)處理

利用Excel軟件分析定量結(jié)果，采用2方法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果以平均值加標(biāo)準(zhǔn)差表示。

? 結(jié)果與分析

?GA處理對(duì)‘’木薯水培苗-胡蘿卜素含量的影響

從圖1可以看出，GA誘導(dǎo)能促進(jìn)木薯中α-胡蘿卜素的合成，其中α-胡蘿卜素含量在GA處理4?d時(shí)達(dá)到最高，為0.19?μg/g，而對(duì)照在相同時(shí)間點(diǎn)幾乎無(wú)明顯變化。

? GA處理對(duì)‘’木薯水培苗胡蘿卜素含量的影響

從圖2可以看出葉片中β-胡蘿卜素本底水平較高，GA誘導(dǎo)能促進(jìn)木薯中β-胡蘿卜素的合成，其含量在0、1、2、3、4?d均比對(duì)照高，其中β-胡蘿卜素在GA處理2?d時(shí)達(dá)到最高，為107.73?μg/g，隨后呈下降趨勢(shì);而對(duì)照在相同時(shí)間點(diǎn)幾乎無(wú)明顯變化。

? GA處理對(duì)‘’木薯水培苗葉黃素含量的影響

從圖3可以看出，GA誘導(dǎo)能促進(jìn)木薯中葉黃素的合成，其含量在0、1、2、3、4?d呈逐漸增加的趨勢(shì)，4?d內(nèi)達(dá)到0.31?μg/g，但未達(dá)峰值，還有上升空間;而對(duì)照在相同時(shí)間點(diǎn)幾乎無(wú)明顯變化。

? GA處理對(duì)‘’木薯水培苗玉米黃質(zhì)含量的影響

從圖4可以看出，GA誘導(dǎo)能促進(jìn)木薯中玉米黃質(zhì)的合成，玉米黃質(zhì)含量本底水平較高，GA處理后均比對(duì)照高，在3?d達(dá)到峰值;而對(duì)照在相同時(shí)間點(diǎn)幾乎無(wú)明顯變化。

? GA處理對(duì)‘’木薯水培苗不同組織中類胡蘿卜素生物合成相關(guān)基因的影響

從圖5可以看出，類胡蘿卜素生物合成相關(guān)

基因在12?h內(nèi)根、莖、葉和葉柄中均受GA不同程度的誘導(dǎo)，其中、、、、和在葉片中誘導(dǎo)效果較明顯，而、和在根中誘導(dǎo)效果明顯。其中GA調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子在葉片中受GA誘導(dǎo)最明顯，而對(duì)照在相同時(shí)間點(diǎn)幾乎無(wú)明顯變化。

? GA處理類胡蘿卜素含量與生物合成相關(guān)基因的相關(guān)性分析

除番茄紅素在葉片中無(wú)法檢測(cè)到外，GA均能促進(jìn)葉片中α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素、葉黃素和玉米黃質(zhì)的積累。而葉片中β-胡蘿卜素和玉米黃質(zhì)含量占90%以上，轉(zhuǎn)錄因子及木薯類胡蘿卜素生物合成相關(guān)基因表達(dá)在根、莖、葉和葉柄等不同器官、組織中均受GA誘導(dǎo)調(diào)控，其中、、、、和在葉片中誘導(dǎo)效果較明顯，與GA調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)基本呈一致趨勢(shì)，初步可以篩選出受轉(zhuǎn)錄因子MeGAMYB調(diào)控的基因如、、、、和等。

? 討論

GA是一類重要的植物激素，其在延緩植物葉片衰老、抑制葉綠素的降解、植物開(kāi)花誘導(dǎo)和果實(shí)發(fā)育過(guò)程起著重要作用。是一個(gè)受GA調(diào)控的編碼一個(gè)R2R3-MYB DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的類轉(zhuǎn)錄因子，是GA信號(hào)應(yīng)答途徑中首個(gè)被鑒定出來(lái)的正向作用的因子，在擬南芥和水稻中，mir159調(diào)控的GAMYB-like家族轉(zhuǎn)錄因子主要在花發(fā)育和谷物糊粉層重點(diǎn)GA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。其中GID1（Gibberellin-Iinsensitivedwarf1）是GA

的受體，其能感知GA信號(hào)通過(guò)受體GID1蛋白傳給DELLA，DELLA蛋白屬于GA信號(hào)和植物生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵抑制因子，而GA促進(jìn)植物的生長(zhǎng)發(fā)育是通過(guò)降解DELLA蛋白來(lái)完成。GA跟GID1與DELLA蛋白的相互作用會(huì)引起一些轉(zhuǎn)錄因子如和等轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)量的上調(diào)但是對(duì)于在類胡蘿卜素代謝中的調(diào)控機(jī)理研究相對(duì)較少。

類胡蘿卜素是木薯糧飼化的重要指標(biāo)，木薯中類胡蘿卜素主要包括有α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素、玉米黃質(zhì)、葉黃素和番茄紅素等。據(jù)研究報(bào)道，木薯塊根中僅β-胡蘿卜素含量占總類胡蘿卜素含量的90%，而本研究以木薯葉片為研究對(duì)象，與塊根研究結(jié)果不同，木薯葉片中主要含有β-胡蘿卜素和玉米黃質(zhì)，二者含量占90%以上，而α-胡蘿卜素和葉黃素占極少的部分。本文在GA的作用下，木薯水培苗各個(gè)組織中類胡蘿卜素代謝途徑中的基因和都受到不同程度的調(diào)控，特別是葉片中的表達(dá)量出現(xiàn)了顯著上調(diào)，同時(shí)，相關(guān)基因如、等也出現(xiàn)了顯著上調(diào)?；诒疚难芯拷Y(jié)果可以推測(cè)，在GA信號(hào)條件下，GA信號(hào)分子與 GID受體蛋白結(jié)合從而導(dǎo)致植物生長(zhǎng)的抑制因子DELLA蛋白通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑被降解，與DELLA蛋白相互作用促進(jìn)了類胡蘿卜素生物合成途徑相關(guān)基因的表達(dá)，從而促進(jìn)了類胡蘿卜素的生物合成，但是具體的機(jī)理研究還需要進(jìn)一步探索。本結(jié)果為后續(xù)研究木薯類胡蘿卜素代謝提供了候選基因和相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，為進(jìn)一步研究木薯類胡蘿卜素合成的機(jī)理提供參考，也為提高木薯葉片和塊根中類胡蘿卜素含量的研究奠定了基礎(chǔ)。

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12. 收稿日期 2021-08-21;修回日期 2021-11-30

    基金項(xiàng)目 國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（No. 32101811）;海南省自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（No. 321QN321）;

    中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)-中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院院級(jí)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（No. 17CXTD-29）。

    作者簡(jiǎn)介 羅秀芹（1986—），女，碩士，助理研究員，研究方向：木薯遺傳育種。*通信作者（Corresponding author）：陳松

    筆（CHEN Songbi），E-mail：563962186@qq.com。