振腹推拿手法對CUMS抑郁癥模型大鼠骨骼肌線粒體能量代謝障礙的干預(yù)作用機制

周可林 董碩 國生 魏培棟 付國兵 楊靖頤

抑郁癥具有高患病率、高復(fù)發(fā)率、高致殘率、高自殺傾向的特點，已成為嚴(yán)重影響人類身心健康的公共衛(wèi)生問題?！都膊『陀嘘P(guān)健康問題的國際統(tǒng)計分類》[1]將低動力與情緒低落、興趣/愉快感缺失作為抑郁癥的核心癥狀，因此有學(xué)者提出了抑郁癥的能量代謝假說，認為抑郁癥的低動力癥狀可能與線粒體能量代謝障礙相關(guān)[2-3]。前期研究[4]發(fā)現(xiàn)振腹推拿可以明顯改善抑郁癥患者的癥狀評分，對于患者的情緒低落、精力減退等癥狀有明顯的改善作用，因此本研究擬通過慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激方法(chronic unpredictable mild stress, CUMS)建立抑郁癥大鼠模型，探究振腹推拿手法對于抑郁癥模型大鼠骨骼肌腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)含量、活性氧(reactive oxygen species，ROS)含量、呼吸鏈Ⅰ～Ⅴ含量以及輔酶Q10、線粒體內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子A(mitochondrial transcription factor A, TFAM)以及 SQSTM1(sequestosome-1)蛋白含量的調(diào)節(jié)作用，分析振腹推拿改善抑郁癥能量代謝異常的干預(yù)作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性SD大鼠(SPF級)40只，體質(zhì)量為(330±20)g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[許可證號：SCXK(京)2012-0001]。所有大鼠在北京中醫(yī)藥大學(xué)動物房(SPF級)中飼養(yǎng)，室溫條件(21±2)℃，相對濕度保持在30～40%，光照保持正常晝夜節(jié)律，并且飼養(yǎng)環(huán)境保持安靜。常規(guī)飼料和常規(guī)飲用水飼養(yǎng)，大鼠健康狀況良好。本研究中所進行的所有動物操作行為和實驗方法均按照北京中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗倫理委員會頒布的實驗動物福利和倫理指南嚴(yán)格執(zhí)行，動物實驗過程由受過專業(yè)培訓(xùn)的研究生進行并盡量減少實驗動物的痛苦。

1.2 實驗試劑

ATP含量測定試劑盒(南京建成生物工程研究所，貨號：A095-1)；線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ試劑盒(南京建成生物工程研究所，貨號分別為：A089-1、A089-2、A089-3、A089-4、A089-5)；蛋白提取液、蛋白酶抑制劑、二抗(MDL，貨號分別為：MDL91201、MD912893、MD932477)；SQSTM1一抗、TFAM一抗(Affinit，貨號分別為：AF5384、DF3232)；輔酶Q10一抗(abcam，貨號：ab41997)。

1.3 實驗分組和干預(yù)方法

適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，從40只大鼠中隨機選取10只作為正常組，正常組正常飼養(yǎng)，不進行任何刺激，其余30只大鼠采用CUMS法建立抑郁癥大鼠模型。造模刺激包括束縛3小時、45℃熱烘5分鐘、孤籠飼養(yǎng)24小時、陌生物體刺激24小時、85 dB白噪音5小時、45°籠具傾斜24小時、夾尾1分鐘、禁食禁水24小時等。按照隨機數(shù)字表法分配，使大鼠不能預(yù)料刺激的發(fā)生，造模一共持續(xù)7周[5]。在造模第3周末將造模的30只大鼠隨機分為模型組、振腹組、氟西汀組3組，糖水偏好試驗和懸尾試驗之后開始進行手法和藥物干預(yù)，干預(yù)方式如下：正常組不進行CUMS造模刺激，按照1 mL/100 g體質(zhì)量灌胃去離子水，每日一次，共計4周；模型組采用CUMS造模刺激，按照1 mL/100 g體質(zhì)量灌胃去離子水，每日一次，共計4周；振腹組采用CUMS造模刺激，進行振腹推拿手法干預(yù)(振腹推拿操作方法：以神闕穴為中心，行三指振腹手法15分鐘，頻率300次/分鐘。神闕穴定位：參考《實驗針灸學(xué)》《實驗推拿學(xué)》及相關(guān)文獻，以劍突至恥骨聯(lián)合上緣上2/3與下1/3交界處為穴)，每日一次，共計4周；氟西汀組采用CUMS造模刺激，同時給予氟西汀懸濁液灌胃，根據(jù)成人每日服用20 mg氟西汀換算，給藥量為2.08 mg/100 g體質(zhì)量，灌胃總量為1 mL/100 g體質(zhì)量，每日一次，共計4周。在完成4周干預(yù)后，進行行為學(xué)檢測，之后處死各組大鼠取材。

1.4 模型評價指標(biāo)

1.4.1 宏觀表征 每天對各組大鼠的精神狀態(tài)、皮毛的光澤度、給予不同刺激時產(chǎn)生的反應(yīng)劇烈程度以及便質(zhì)等情況進行觀察，觀察各組大鼠這些表征是否隨著造模時間的推移發(fā)生了明顯的變化。

1.4.2 糖水偏好試驗 在造模及干預(yù)結(jié)束后，先對大鼠進行糖水訓(xùn)練，之后正式進行糖水偏好試驗。計算出試驗前后糖水瓶和去離子水瓶的重量變化，根據(jù)糖水消耗率公式計算糖水消耗率[6]：糖水消耗率=糖水消耗量/(糖水消耗量+去離子水消耗量)×100%，計算糖水消耗率。

1.4.3 懸尾試驗 在造模及干預(yù)結(jié)束后，將大鼠懸掛于懸尾箱內(nèi)，使其呈倒懸狀態(tài)，用秒表記錄大鼠停止掙扎不動或無任何活動的時間，記錄時間6分鐘，適應(yīng)2分鐘，記錄后4分鐘內(nèi)累計不動時間(秒)[7]。

1.4.4 曠場試驗 將大鼠放在曠場箱的正中格內(nèi)，觀察并記錄5分鐘內(nèi)大鼠活動情況。運用Etho Vision3.0行為學(xué)分析軟件對各組大鼠的運動情況進行分析，所統(tǒng)計觀察的內(nèi)容包括：總運動距離、中央?yún)^(qū)進入次數(shù)以及穿格次數(shù)[8]。

1.5 取材

于第7周末完成刺激、干預(yù)和行為學(xué)實驗結(jié)束后處死大鼠并進行組織取材。處死方法：給予3%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉后斷頭處死，剝離右下肢腓腸肌-80℃保存?zhèn)溆?。分別檢測ATP、ROS、呼吸鏈Ⅰ～Ⅴ的含量，輔酶Q10、TFAM的蛋白含量以及SQSTM1的蛋白、mRNA含量。

1.6 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測mRNA表達

逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以β-actin為內(nèi)參，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5分鐘，95℃變性10秒，58℃退火20秒，72℃延伸20秒，共40個循環(huán)。SQSTM1上游引物(5＇to 3＇)：TCTGTAGGAGCCTGGTGAG；SQSTM1下游引物(5＇to 3＇)：TGACGACTGGACGCATTT。采用相對表達量(relative quantity，RQ)表示各組大鼠mRNA含量，計算公式如下：

RQ=2-ΔCtq-ΔCtcb

ΔCtq=待測組目的基因平均Ct值-待測組內(nèi)參基因平均Ct值

ΔCtcb=對照組目的基因平均Ct值-對照組內(nèi)參基因平均Ct值

1.7 Western Blot法檢測蛋白表達

取組織裂解提取蛋白，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白定量試劑盒測定蛋白含量；取30 μL蛋白電泳分離，轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，脫脂奶粉封閉1小時；加入對應(yīng)一抗，4℃孵育過夜；加入二抗孵育1小時，TBST液清洗；電化學(xué)發(fā)光(electro-chemi-luminescence，ECL)顯影，以β-actin為內(nèi)參計算蛋白相對表達。

1.8 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 宏觀表現(xiàn)

本實驗對各組大鼠的一般狀態(tài)進行了觀察。造模開始前，所有大鼠均表現(xiàn)活躍，動作靈敏，精神狀況良好，毛發(fā)光澤整齊，大便形態(tài)正常、干濕適中。隨著每日造模的持續(xù)進行，相比于正常組大鼠，造模刺激后的大鼠對外界應(yīng)激的反應(yīng)度逐漸下降，對寒冷等外界刺激的抵抗能力下降，活躍程度明顯降低，精神萎靡，毛發(fā)雜亂，色澤暗淡無光澤，宏觀表現(xiàn)與正常組大鼠出現(xiàn)明顯差異，并且糞便外觀不成形；造模3周后開始對振腹組與氟西汀組大鼠進行干預(yù)直至第7周結(jié)束，經(jīng)過干預(yù)后的大鼠活躍程度逐漸恢復(fù)，在日常造模過程中對外界刺激的抵抗程度較模型組大鼠顯著增強，抵抗寒冷等外界刺激的抵抗力增強，并且振腹組大鼠的糞便質(zhì)地改善明顯。

2.2 糖水偏好試驗

第0周(即應(yīng)激前)末，各組大鼠的糖水偏好率無顯著差異(P>0.05)；第3周(即應(yīng)激3周)末，模型組、振腹組和氟西汀組大鼠的糖水偏好率與正常組相比顯著降低(P<0.01)，模型組、振腹組和氟西汀組3組之間的糖水偏好率無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，說明經(jīng)過3周的CUMS造模刺激，模型組、振腹組和氟西汀組3組均已造模成功，且3組之間造模程度相似；第7周(即干預(yù)4周)末，模型組大鼠的糖水偏好率與正常組相比顯著降低(P<0.01)，與模型組大鼠比較，振腹組、氟西汀組大鼠的糖水偏好率顯著升高(P<0.01)。見表1。

表1 各組CUMS抑郁癥模型大鼠糖水偏好率比較

2.3 懸尾試驗

第0周(即應(yīng)激前)末，各組大鼠的絕望時間無顯著差異(P>0.05)；第3周(即應(yīng)激3周)末，模型組、振腹組和氟西汀組大鼠的絕望時間與正常組相比顯著增加(P<0.01)，模型組、振腹組和氟西汀組3組之間的絕望時間均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，說明經(jīng)過3周的CUMS造模刺激，模型組、振腹組和氟西汀組3組均已造模成功，且3組之間造模程度相似；第7周(即干預(yù)4周)末，模型組大鼠的絕望時間與正常組相比顯著增加(P<0.01)，與模型組大鼠比較，振腹組、氟西汀組大鼠的絕望時間顯著降低(P<0.01)。見表2。

表2 各組CUMS抑郁癥模型大鼠絕望時間比較秒)

2.4 曠場試驗

經(jīng)過7周的造模刺激，模型組大鼠的總移動距離、中央進入次數(shù)和穿格次數(shù)與正常組相比均顯著降低(P<0.01)；經(jīng)過4周的干預(yù)，與模型組大鼠比較，振腹組、氟西汀組大鼠的總移動距離、穿格次數(shù)顯著升高(P<0.01)，氟西汀組的中央進入次數(shù)與模型組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，振腹組的中央進入次數(shù)與模型組相比有上升趨勢。見表3。

表3 各組大鼠CUMS抑郁癥模型大鼠曠場試驗結(jié)果比較

2.5 ATP和ROS含量

經(jīng)過7周的造模刺激，模型組大鼠的ATP含量與正常組相比顯著降低(P<0.01)，ROS含量與正常組相比顯著升高(P<0.01)；經(jīng)過4周的干預(yù)，與模型組大鼠比較，振腹組大鼠的ATP含量顯著升高(P<0.01)，ROS含量顯著降低(P<0.01)，氟西汀組大鼠的ATP含量升高(P<0.05)，ROS含量顯著降低(P<0.01)。見表4。

表4 各組CUMS抑郁癥模型大鼠骨骼肌ATP和ROS含量比較

2.6 呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ含量

經(jīng)過7周的造模刺激，模型組大鼠的呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ含量與正常組相比均顯著降低(P<0.01)；經(jīng)過4周的干預(yù)，與模型組大鼠相比，振腹組大鼠的呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ含量顯著升高(P<0.01)，呼吸鏈復(fù)合體Ⅳ含量升高(P<0.05)；經(jīng)過4周的干預(yù)，與模型組大鼠相比，氟西汀組大鼠的呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ含量顯著升高(P<0.01)。見表5。

2.7 輔酶Q10、SQSTM1、TFAM含量

經(jīng)過7周的造模刺激，模型組大鼠的輔酶Q10蛋白含量與正常組相比顯著降低(P<0.01)；經(jīng)過4周的干預(yù)，與模型組大鼠相比，振腹組大鼠的輔酶Q10蛋白含量升高(P<0.05)，氟西汀組大鼠的輔酶Q10蛋白含量顯著升高(P<0.01)。見圖1、表6。

經(jīng)過7周的造模刺激，模型組大鼠SQSTM1的蛋白含量、mRNA含量與正常組相比均顯著降低(P<0.01)；經(jīng)過4周的干預(yù)，與模型組大鼠相比，振腹組大鼠SQSTM1的蛋白含量升高(P<0.05)，mRNA含量顯著升高(P<0.01)，氟西汀組大鼠SQSTM1的蛋白、mRNA含量顯著均升高(P<0.01)。見圖1、表6。

圖1 各組CUMS抑郁癥模型大鼠骨骼肌輔酶Q10、

表5 各組CUMS抑郁癥模型大鼠骨骼肌呼吸鏈復(fù)合物含量比較

表6 各組CUMS抑郁癥模型大鼠骨骼肌輔酶Q10、SQSTM1、TFAM含量比較

經(jīng)過7周的造模刺激，模型組大鼠的TFAM蛋白含量與正常組相比顯著降低(P<0.01)；經(jīng)過4周的干預(yù)，與模型組大鼠相比，振腹組大鼠的TFAM蛋白含量顯著升高(P<0.01)，氟西汀組大鼠的TFAM蛋白含量顯著升高(P<0.01)。見圖1、表6。

3 討論

關(guān)于抑郁癥的可能發(fā)生機制，目前比較公認的有單胺類神經(jīng)遞質(zhì)假說及受體假說、細胞分子機制假說等大量的假說，但是這些假說都沒有很好地解釋抑郁癥所引發(fā)的低動力癥狀。近年來有學(xué)者認為抑郁癥的產(chǎn)生與線粒體異常密切相關(guān)，并提出了能量代謝假說，認為抑郁癥肌肉組織中的ATP含量減少與抑郁癥低動力癥狀密切相關(guān)。郭蓉娟等[9-10]發(fā)現(xiàn)CUMS誘導(dǎo)的抑郁癥大鼠模型的骨骼肌、腓腸肌均出現(xiàn)線粒體數(shù)目減少和能量代謝異常的現(xiàn)象，明確提出了CUMS誘導(dǎo)的抑郁癥大鼠模型與骨骼肌線粒體能量代謝異常密切相關(guān)，并且提出了中醫(yī)干預(yù)方法可能通過調(diào)節(jié)線粒體異常改善抑郁癥。線粒體是機體內(nèi)能量代謝的主要場所，研究發(fā)現(xiàn)[11]線粒體呼吸鏈的含量與線粒體能量代謝功能的強弱成正比，線粒體在進行能量代謝的過程中，需要通過復(fù)合物Ⅰ(NADH脫氫酶)、復(fù)合物Ⅱ(琥珀酸脫氫酶)、復(fù)合物Ⅲ(細胞色素c還原酶)和復(fù)合物Ⅳ(細胞色素c氧化酶)完成氧化還原反應(yīng)的過程[12]，進行一系列的遞氫反應(yīng)和遞電子反應(yīng)，將電子傳遞至輔酶Q10[13]，輔酶Q10將質(zhì)子釋放至線粒體基質(zhì)內(nèi)，將電子傳遞給細胞色素，通過這一過程促進氧化磷酸化及電子的主動轉(zhuǎn)移，之后由呼吸鏈復(fù)合體V(ATP合成酶)合成ATP，為組織供給能量需要[14]。ROS是線粒體損傷的重要因素，ROS可以損傷線粒體DNA以及線粒體內(nèi)多種代謝蛋白的活性，導(dǎo)致線粒體能量代謝異常[15-16]。

SQSTM1能穿過線粒體膜影響TFAM的含量，線粒體中TFAM的量減少，就會減少線粒體DNA的含量，從而抑制線粒體的代謝功能。研究發(fā)現(xiàn)[9]，在小鼠胚胎成纖維細胞中過表達SQSTM1，可使線粒體細胞內(nèi)線粒體DNA水平升高；進一步研究發(fā)現(xiàn)敲除小鼠的SQSTM1基因后小鼠會出現(xiàn)海馬依賴性認知減退，表現(xiàn)為明顯的抑郁樣行為；若提高SQSTM1表達可顯著改善抑郁癥相關(guān)的線粒體功能。有研究認為，SQSTM1過度表達可以增強線粒體的功能，從而改善抑郁癥小鼠的癥狀，并認為SQSTM1可能是治療抑郁癥線粒體能量代謝異常的一個潛在的治療靶點[17]。

振腹推拿是由北京中醫(yī)藥大學(xué)臧?？平淌谠谏鲜兰o(jì)90年代初創(chuàng)立，經(jīng)歷了三代人20多年的共同努力，逐漸發(fā)展成具有獨特理論、獨特手法、獨特取穴治療方式，理、法、方、技完備的治療體系，在推拿界獨樹一幟，成為臟腑推拿領(lǐng)域一個獨特的流派，已廣泛運用于婦科、兒科、消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等多系統(tǒng)、多臟腑相關(guān)疾病的臨床治療中。前期研究發(fā)現(xiàn)，振腹推拿可以明顯改善抑郁癥患者的癥狀積分，從而發(fā)現(xiàn)振腹推拿具有調(diào)節(jié)抑郁癥的治療作用[4]。本項研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過4周的振腹推拿治療可以明顯改善CUMS誘導(dǎo)的抑郁癥模型大鼠對外界刺激的反應(yīng)、糞便質(zhì)地以及糖水偏好率、絕望時間和曠場試驗的總移動距離、穿格次數(shù)，說明振腹推拿可以改善抑郁癥模型大鼠的抑郁癥狀，與之前的研究結(jié)果相同。研究發(fā)現(xiàn)，振腹推拿可以增加抑郁癥模型大鼠骨骼肌ATP含量、呼吸鏈Ⅰ～Ⅴ的含量，減少ROS的含量，說明振腹推拿可以改善抑郁癥模型大鼠線粒體能量代謝的功能；同時，振腹推拿可以增加抑郁癥模型大鼠骨骼肌輔酶Q10、TFAM以及SQSTM1的含量。

抑郁癥屬于中醫(yī)“郁病”范疇，中醫(yī)認為其發(fā)病機制與思慮過度導(dǎo)致的肝失疏泄、脾失健運、心失所養(yǎng)、臟腑氣血陰陽虧虛密切相關(guān)?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》重視陽氣，強調(diào)陽氣在人體生命活動中的主導(dǎo)作用[18]，陽氣不足就會氣化無力、氣行不暢，導(dǎo)致氣機郁結(jié)、情志不舒。《靈樞·本神》記載：“愁憂者，氣閉塞而不行”，指出氣機閉塞不通就會出現(xiàn)郁郁寡歡、愁思擔(dān)憂。陽氣散布于人體各臟腑，陽氣的充足和運行順暢有利于陽氣發(fā)揮其功能，也有利于人體各臟腑功能的正常，機體的陽氣不足可導(dǎo)致機體功能降低，出現(xiàn)抑郁癥的低動力癥狀，所以有研究認為恢復(fù)陽氣的功能是從根本上調(diào)節(jié)臟腑功能、改善抑郁癥低動力癥狀的關(guān)鍵[19]。振腹推拿理論認為，元陽是人體的根本，所以補益機體的陽氣必須激發(fā)臍下丹田之中的命門元陽，并依據(jù)此提出了“命門—丹田—臍軸”理論[20]。振腹推拿主要施術(shù)部位在以神闕穴為中心的腹部，通過振法刺激神闕穴激發(fā)臍下元陽，調(diào)整元氣的生成、充養(yǎng)、輸布三大環(huán)節(jié)，調(diào)理元氣的生發(fā)和運行，從而促使元氣溫養(yǎng)經(jīng)筋。此外，振腹推拿以“補養(yǎng)并調(diào)和元氣運動”為綱，采用振腹手法調(diào)節(jié)周身陽氣的升降出入次序，“補其不足，損其有余，郁者散之，散者收之，上者降之，下者升之”的方法，使陽氣升降出入失調(diào)歸于相對平衡協(xié)調(diào)的正常狀態(tài)[21]，從而實現(xiàn)改善抑郁癥低動力癥狀的療效。

綜上所述，振腹推拿手法可以改善抑郁癥模型大鼠的癥狀，增強其自主探索能力，減少其絕望時間，而這一手法效應(yīng)可能是通過增加骨骼肌SQSTM1蛋白的轉(zhuǎn)錄和表達，從而增加TFAM的含量，改善線粒體的功能，增加呼吸鏈Ⅰ～Ⅴ的含量、減少ROS的含量，從而增強線粒體能量代謝的能力，緩解線粒體損傷，增加ATP含量實現(xiàn)。