產(chǎn)氫菌XY-18在低溫條件下的產(chǎn)氫性能研究

徐葉　姜霽珊　黃志雄　郭鐵蘭　 孫奧　秦智

摘? 要： 利用間歇實(shí)驗(yàn)對產(chǎn)氫菌XY-18和產(chǎn)氫菌XY-72進(jìn)行了產(chǎn)氫性能相關(guān)實(shí)驗(yàn)，比較了兩者的產(chǎn)氣量、產(chǎn)氫量、細(xì)胞干重、pH值和葡萄糖利用率等指標(biāo).研究結(jié)果表明：在溫度為20 ℃的條件下，產(chǎn)氫菌XY-18累計產(chǎn)氣量為4 333 mL?L，累計產(chǎn)氫量為3 946 mL?L，細(xì)胞干重為1.53 g?L，最佳產(chǎn)氫pH值范圍為4.5～4.9，葡萄糖利用率為96%. 結(jié)合對產(chǎn)氫量、細(xì)胞干重量和pH值等參數(shù)的綜合分析發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)氫菌XY-18是一株能夠在低溫條件下具有較好產(chǎn)氫能力的厭氧產(chǎn)氫菌.

關(guān)鍵詞： 生物制氫; 低溫產(chǎn)氫; 間歇實(shí)驗(yàn); 產(chǎn)氫性能

中圖分類號：? Q 939.9????? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A??? 文章編號： 1000-5137（2022）01-0064-06

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In this paper， the hydrogen-producing bacteria XY-18 and hydrogen-producing bacteria XY-72 were used to carry out hydrogen-producing experiments at the temperature of 20 ℃. The gas production， hydrogen production， cell dry weight， pH and glucose utilization rate of both were detected. The results showed that the total gas production of XY-18 was 4 333 mL?L， the total hydrogen production was 3 946 mL?L， the cell dry weight was 1.53 g?L， the optimal pH range was 4.5-4.9， and the glucose utilization rate was 96% at the temperature of 20 ℃. Combined comprehensive analysis of parameters including hydrogen production， cell dry weight and pH value showed that hydrogen-producing bacteria XY-18 is a low-temperature anaerobic hydrogen-producing bacteria that can produce hydrogen under at low temperature.

biological hydrogen production; low-temperature hydrogen production; batch experiment; hydrogen production performance

0? 引 言

氫氣是一種理想的清潔能源，氫氣的有效利用是解決能源短缺問題的方案之一.厭氧發(fā)酵微生物制氫技術(shù)可以有效地利用藻類生物質(zhì)、纖維素、葡萄糖、淀粉等多種原料，與化學(xué)和物理方法相比，具有成本低、易于實(shí)施、制氫速度較快等優(yōu)點(diǎn).厭氧發(fā)酵微生物制氫法通過生物轉(zhuǎn)化進(jìn)行生物制氫，是一種可用于工業(yè)化生產(chǎn)的制氫技術(shù)，近幾年成為最有效的制氫方法之一.

溫度是影響厭氧發(fā)酵微生物制氫速率的重要因素.根據(jù)不同厭氧菌的最適生長溫度，可將其分為超高溫產(chǎn)氫菌、嗜熱產(chǎn)氫菌、中溫產(chǎn)氫菌、低溫產(chǎn)氫菌等.目前，國內(nèi)外研究主要關(guān)注了高溫、中溫對厭氧產(chǎn)氫菌產(chǎn)氫性能的影響.1） 高溫產(chǎn)氫菌的產(chǎn)氫溫度范圍一般在40～65 ℃.例如，戊糖發(fā)酵產(chǎn)氫菌W16在溫度為55～60 ℃時具有較好的生長和產(chǎn)氫效果，并在溫度為60 ℃時，產(chǎn)氫量達(dá)到最大值2.0 mol H（每mol 木糖）;厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫菌 CBS-Z可生長的溫度為40～90 ℃，最適溫度為74 ℃.2） 中溫度產(chǎn)氫菌的產(chǎn)氫溫度范圍一般在25～40 ℃.例如，在培養(yǎng)溫度為40 ℃時，厭氧發(fā)酵木糖產(chǎn)氫菌FSC-15的產(chǎn)氫量最大;菌株Fanp3在溫度為15～35 ℃時，隨著溫度的升高，氫氣產(chǎn)量逐漸增加，最大產(chǎn)氫速率為39.0 mL?h （每g葡萄糖）;ECU-15在37 ℃時可獲得最佳產(chǎn)氫量2.07 mol H（每mol葡萄糖）;HE1在甘油質(zhì)量濃度為50 g?L，溫度為35 ℃時，可獲得最佳產(chǎn)氫量為0.345 mol H（每mol甘油）.3） 低溫菌研究主要集中在發(fā)酵飼料、乳類食品、環(huán)境污水處理、食物保藏等方面.然而，目前對低溫產(chǎn)氫菌的篩選、產(chǎn)氫條件以及產(chǎn)氫機(jī)理的研究較少.

我國東北地區(qū)常年低溫，利用中高溫發(fā)酵進(jìn)行生物制氫耗能巨大.因此，篩選在低溫條件下具有較高產(chǎn)氫能力的厭氧產(chǎn)氫菌，并將其應(yīng)用于生物制氫生產(chǎn)過程具有重要意義.本研究選取經(jīng)低溫馴化的產(chǎn)氫菌XY-18與常溫篩選的產(chǎn)氫菌XY-72的兩株菌株，通過間歇實(shí)驗(yàn)，在溫度為20 ℃的條件下，比較分析了兩者的產(chǎn)氫量、pH值、細(xì)胞干重和葡萄糖利用率等參數(shù)，確定了產(chǎn)氫菌XY-18在低溫條件下的產(chǎn)氫能力和低溫耐受性，為后續(xù)開展深入研究提供參考.

1? 材料與方法

菌種來源

在實(shí)驗(yàn)室厭氧發(fā)酵反應(yīng)器馴化活性污泥，當(dāng)其良好的產(chǎn)氫量達(dá)到穩(wěn)定時，收取活性污泥，放置于低溫條件下培養(yǎng)，經(jīng)過3～5代分離、純化、篩選，獲得低溫菌株XY-18，經(jīng)16SrDNA測序和數(shù)據(jù)庫比對，鑒定為.同時，用同樣的方法，在常溫條件下篩選獲得常溫菌株XY-72，并鑒定為.

厭氧培養(yǎng)方法

菌株培養(yǎng)中的全部實(shí)驗(yàn)操作基本采用了改進(jìn)的hungate厭氧技術(shù).

培養(yǎng)基

本實(shí)驗(yàn)采用LM-1培養(yǎng)基：葡萄糖20 g?L、牛肉膏2 g?L、胰蛋白胨4 g?L、酵母浸粉1 g?L、磷酸二氫鉀1.5 g?L、氯化鈉4 g?L、六水合氯化鎂0.1 g?L、七水合硫酸亞鐵0.1 g?L、L-半胱氨酸0.5 g?L、微量元素液10 mL?L、維生素液10 mL?L、刃天青0.000 2 g?L.將瓊脂粉15 g添加到1 L液體培養(yǎng)基中獲得固體培養(yǎng)基.將配制好的培養(yǎng)基放入滅菌鍋中，設(shè)置121 ℃，20 min滅菌.

實(shí)驗(yàn)裝置

本實(shí)驗(yàn)用間歇實(shí)驗(yàn)裝置進(jìn)行研究，間歇實(shí)驗(yàn)裝置如圖1所示.

分析方法

1.5.1 產(chǎn)氣量和產(chǎn)氫量的測定

使用間歇實(shí)驗(yàn)裝置（圖1）測量厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫菌的產(chǎn)氣量.將產(chǎn)氫菌XY-18和產(chǎn)氫菌XY-72按1%的接種量接入100 mL培養(yǎng)基中，置于恒溫振蕩培養(yǎng)器中，20 ℃，120 r?min振蕩培養(yǎng)，每1 h測定產(chǎn)氣量.測定過程中，水準(zhǔn)瓶液面與氣體計量管液面持平，以保證測定數(shù)值的準(zhǔn)確性.氫氣量測量采用氣相色譜法.

1.5.2 pH值和細(xì)胞生物量的測定

從間歇實(shí)驗(yàn)裝置的取樣口取出5 mL發(fā)酵液，使用pH計測定其pH值.將5 mL發(fā)酵液在12 000 r?min條件下離心5 min，棄上清液，用生理鹽水洗2次，105 ℃烘干至恒重，用分析天平稱量其質(zhì)量，即為細(xì)胞干重.

1.5.3 葡萄糖含量的測定

采用北京盒子生工科技有限公司生產(chǎn)的葡萄糖含量檢測試劑盒（GOPOD Format）測定.葡萄糖氧化酶（GOD）催化葡萄糖氧化為葡萄糖酸，并釋放出HO.過氧化物酶（POD）催化HO氧化4-氨基安替比林偶聯(lián)酚，生成紅色醌類化合物.實(shí)驗(yàn)過程中，通過測定產(chǎn)物在505 nm的吸光度變化，定量葡萄糖含量.

2? 結(jié)果和分析

隨培養(yǎng)時間變化的累計產(chǎn)氣量

低溫產(chǎn)氫菌XY-18和常溫產(chǎn)氫菌XY-72在溫度20 ℃條件下的產(chǎn)氣量隨培養(yǎng)時間的延長逐漸上升（圖2）.產(chǎn)氫菌XY-18在培養(yǎng)13 h后開始產(chǎn)氣，13～72 h內(nèi)產(chǎn)氣量明顯增加，72 h后產(chǎn)氣量趨于穩(wěn)定，96 h內(nèi)累計產(chǎn)氣量達(dá)到4 333 mL?L;而產(chǎn)氫菌XY-72在培養(yǎng)17 h后開始產(chǎn)氣，隨后各相同時間段的產(chǎn)氣量均低于XY-18（圖2）.在培養(yǎng)60 h后，產(chǎn)氫菌XY-18累計產(chǎn)氣量比XY-72高252.3%，甚至產(chǎn)氫菌XY-18在培養(yǎng)60 h后的累計產(chǎn)氣量比產(chǎn)氫菌XY-72在培養(yǎng)96 h后累計產(chǎn)氣量高496 mL?L;在培養(yǎng)96 h后，產(chǎn)氫菌XY-18的累計產(chǎn)氣量比產(chǎn)氫菌XY-72的累計產(chǎn)氣量高1 873 mL?L（圖2）.由此可知，產(chǎn)氫菌XY-18更適合應(yīng)用于低溫條件下的厭氧發(fā)酵.

隨培養(yǎng)時間變化的累計產(chǎn)氫量和產(chǎn)氫效率

圖3（a）為低溫產(chǎn)氫菌XY-18和常溫產(chǎn)氫菌XY-72隨培養(yǎng)時間的累計產(chǎn)氫量情況.產(chǎn)氫菌XY-18在培養(yǎng)20 h后進(jìn)入產(chǎn)氫階段，在24 h內(nèi)累計產(chǎn)氫量只有46 mL?L;24～72 h內(nèi)累計產(chǎn)氫量為2 564 mL?L;72～96 h內(nèi)產(chǎn)氫較緩慢，累計產(chǎn)氫量為285 mL?L.產(chǎn)氫菌XY-72在培養(yǎng)24 h后開始產(chǎn)氫，同時間段其累計產(chǎn)氫量均低于產(chǎn)氫菌XY-18，如圖3（a）所示.產(chǎn)氫菌XY-18在44 h內(nèi)的累計產(chǎn)氫量比產(chǎn)氫菌XY-72在76 h內(nèi)的累計產(chǎn)氫量高60 mL?L;產(chǎn)氫菌XY-18在64 h內(nèi)的累計產(chǎn)氫量比XY-72培養(yǎng)96 h時的累計產(chǎn)氫量高126 mL?L;在72 h時，產(chǎn)氫菌XY-18累計產(chǎn)氫量比產(chǎn)氫菌XY-72高1 675 mL?L，如圖3（a）所示.

產(chǎn)氫菌XY-18和產(chǎn)氫菌XY-72的產(chǎn)氫效率隨著時間先上升，然后達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，如圖3（b）所示.產(chǎn)氫菌XY-18在20 h內(nèi)的產(chǎn)氫效率為0.03 mol H/mol葡萄糖，而產(chǎn)氫菌XY-72在20 h內(nèi)不產(chǎn)氫;產(chǎn)氫菌XY-18在48 h內(nèi)的產(chǎn)氫效率達(dá)到最高（0.69 mol H/mol葡萄糖），比產(chǎn)氫菌XY-72產(chǎn)氫效率高0.07 mol H/mol葡萄糖;在20～72 h內(nèi)產(chǎn)氫菌XY-72的產(chǎn)氫效率均低于產(chǎn)氫菌XY-18，如圖3（b）所示.由此可見，在溫度20 ℃下，產(chǎn)氫菌XY-18比產(chǎn)氫菌XY-72產(chǎn)氫能力強(qiáng).產(chǎn)氫菌XY-18在溫度為20 ℃時的產(chǎn)氫時間更長，產(chǎn)氫量更高，產(chǎn)氫效果更好.

隨培養(yǎng)時間的生物量變化

產(chǎn)氫菌XY-18和產(chǎn)氫菌XY-72在溫度20 ℃下的生物量隨培養(yǎng)時間發(fā)生變化，如圖4所示.產(chǎn)氫菌XY-18在培養(yǎng)12 h后細(xì)胞干重增加量為0.42 g?L;在12～44 h內(nèi)細(xì)胞干重明顯增加，從0.42 g?L上升到1.44 g?L，這段時間包括對數(shù)期和穩(wěn)定期的初期，說明此時間段菌體生長較快，菌量迅速增加;在44～72 h內(nèi)，細(xì)胞干重在1.44～1.53 g?L范圍內(nèi)波動;在培養(yǎng)了72 h后，XY-18的細(xì)胞干重達(dá)到了最大值1.53 g?L;而在72～96 h內(nèi)，細(xì)胞干重從1.53 g·L降至1.02 g·L.產(chǎn)氫菌XY-18比產(chǎn)氫菌XY-72更早進(jìn)入產(chǎn)氫階段，產(chǎn)氫菌XY-72在相同時間段的細(xì)胞干重均低于產(chǎn)氫菌XY-18，產(chǎn)氫菌XY-18培養(yǎng)35 h后的細(xì)胞干重比產(chǎn)氫菌XY-72培養(yǎng)72 h后大0.16 g·L，如圖4所示.因此，從生物量變化看，產(chǎn)氫菌XY-18更適合在低溫條件下生長.

發(fā)酵過程中的值變化

在溫度為20 ℃時，產(chǎn)氫菌XY-18和XY-72的pH值會隨培養(yǎng)時間發(fā)生變化（圖5）.在相同初始pH值和溫度的培養(yǎng)條件下，產(chǎn)氫菌XY-18的pH值隨著培養(yǎng)時間增加，先減小后增大，而產(chǎn)氫菌XY-72的pH值變化趨勢則是逐漸減?。▓D5）.產(chǎn)氫菌XY-18在培養(yǎng)后pH值開始減小，19 h時，降至5.0，這比產(chǎn)氫菌XY-72提早很多;在19～52 h pH值為4.5;在培養(yǎng)52 h后，pH值突然上升，在72 h時，pH值為4.9;在發(fā)酵終止時，pH值為4.8（圖5）.通常情況下，產(chǎn)氫菌發(fā)酵過程中培養(yǎng)基的pH值過低，這不利于菌體的生長和產(chǎn)氫.因此，及時調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值，有利于確保菌體的生長和產(chǎn)氫.當(dāng)pH值穩(wěn)定在4.5～4.9時，此時產(chǎn)氫菌XY-18的產(chǎn)氫效果比XY-72的產(chǎn)氫效果好.這表明，產(chǎn)氫菌XY-18生長和發(fā)酵產(chǎn)氫的最適pH范圍是4.5～4.9.

葡萄糖利用率

產(chǎn)氫菌XY-18和產(chǎn)氫菌XY-72在20 ℃下的葡萄糖利用率情況如圖6所示.在發(fā)酵產(chǎn)氫過程中，培養(yǎng)基的初始葡萄糖質(zhì)量濃度為10 g?L.在培養(yǎng)96 h后，產(chǎn)氫菌XY-18發(fā)酵液的葡萄糖質(zhì)量濃度降至0.04 g?L，產(chǎn)氫菌XY-72發(fā)酵液的葡萄糖濃度降至0.09 g?L.產(chǎn)氫菌XY-18的葡萄糖利用率為96%，比產(chǎn)氫菌XY-72的高5%.由此可見，產(chǎn)氫菌XY-18比產(chǎn)氫菌XY-72更適合在20 ℃下產(chǎn)氫發(fā)酵.

3? 結(jié) 論

本研究在不同溫度條件下通過分離純化獲得了不同的產(chǎn)氫菌，并對其產(chǎn)氫性能進(jìn)行對比研究.研究發(fā)現(xiàn)：在以葡萄糖為底物，溫度為20 ℃，初始pH值為6.7和厭氧的條件下，產(chǎn)氫菌XY-18最終累計產(chǎn)氫量比XY-72高1 386 mL·L culture，產(chǎn)氫菌XY-18連續(xù)培養(yǎng)72 h獲得最大生物量1.53 g?L;不同菌株的產(chǎn)氫對pH值的要求不同，產(chǎn)氫菌XY-18最佳產(chǎn)氫pH值范圍在4.5～4.9，XY-72最佳產(chǎn)氫pH值為5.3～5.5.通過分析產(chǎn)氫量、pH值、生物量等指標(biāo)得出，產(chǎn)氫菌XY-18具有以下優(yōu)點(diǎn)：1） 可以在較低的溫度生長產(chǎn)氫;2） 有效利用葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)氫.綜合分析得出，產(chǎn)氫菌的產(chǎn)氣量與其生物量有關(guān)，還受到發(fā)酵環(huán)境的制約.產(chǎn)氫菌XY-18在低溫條件下的產(chǎn)氫性能較好，為后續(xù)開展低溫條件的發(fā)酵產(chǎn)氫研究提供了理論依據(jù)，為將來應(yīng)用于低溫處理有機(jī)廢水提供了可能性.

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（責(zé)任編輯：顧浩然，郁慧）

收稿日期： 2021-11-11

基金項(xiàng)目： 上海植物種質(zhì)資源工程技術(shù)研究中心項(xiàng)目（17DZ2252700）;上海市協(xié)同創(chuàng)新中心項(xiàng)目 （ZF1205）

作者簡介： 徐 葉（1994—），女，碩士研究生，主要從事環(huán)境微生物方面的研究. E-mail： 1548271452@qq.com

* 通信作者： 秦 智（1974—），女，教授，主要從事環(huán)境微生物技術(shù)方面的研究. E-mail： qinzhi@shnu.edu.cn

引用格式： 徐葉， 姜霽珊， 黃志雄， 等. 產(chǎn)氫菌XY-18在低溫條件下的產(chǎn)氫性能研究 [J]. 上海師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2022，51（1）：64-69.

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