晉秀娟，孫麗麗，趙 鍇，ISLAM Md Ashraful ，盧 娟，王曙光，孫黛珍*

（1. 山西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，太谷 030801；2. 省部共建有機旱作農(nóng)業(yè)國家重點實驗室（籌），太原 030031）

葉綠素（chlorophyll，Chl）是植物進行光合作用的重要色素，其合成與降解在植株整個生育期內(nèi)是一個動態(tài)過程。據(jù)報道，全球每年約有1012kg葉綠素在植物體內(nèi)被降解［1］，其中水分虧缺［2］、溫度降低［3］、病蟲害侵襲［4］等都會加速葉綠素降解。葉綠素降解是一個多種酶共同參與調(diào)節(jié)的代謝過程，主要包括葉綠素酶（chlorophyllase，CLH）、脫鎂葉綠素酶（pheophytin pheophorbide hydrolyase，PPH）、脫鎂螯合酶（stay-green，SGR）、脫鎂葉綠酸a氧化酶（pheide a oxidase，PAO）和葉綠素紅色降解物還原酶（red chlorophyll catabolite reductase，RCCR）等［5-6］。其中CLH是葉綠素降解過程中的關鍵限速酶，能將葉綠素水解成羧酸的脫植基葉綠素和植醇［7］。

不同植物的CLH在生長發(fā)育過程中扮演的角色有明顯差異。研究發(fā)現(xiàn)，菜豆（Phaseolus vulgaris）中的CLH活性在新鮮葉片中最高，而在衰老的過程中其活性不斷下降［8］。在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中發(fā)現(xiàn)2個AtCLHs在幼葉中的基因表達和酶活均遠遠高于成熟和衰老期的葉片［9］，且敲除這2個AtCLHs后并不會影響衰老過程中葉綠素的正常降解［10］，表明CLH主要在生長發(fā)育前期起作用。然而也有大量的研究表明，CLH參與了衰老過程中的葉綠素降解。例如：在婁葉（Piper betle）衰老的過程中，葉片葉綠素含量降低，CLH活性升高，說明婁葉的CLH參與了葉綠素降解［11］；在青花菜（Brassica oleracea）采后衰老的過程中，葉綠素降解速率增快的同時BoCLH2表達量快速升高，葉綠素降解速率減慢的同時BoCLH2的表達量也會變低，表明BoCLH2在儲藏過程中的葉綠素降解途徑中起重要作用［12］；張?zhí)m等［13］分析了不同時期草地早熟禾（Poa pratensis）葉片中CLH基因的表達，發(fā)現(xiàn)衰老葉中PpCLH1的表達量是幼嫩葉片的27.80倍，表明CLH在衰老過程中發(fā)揮了關鍵作用。此外，前人在柑橘（Citrus reticulataBlanco）［5］、萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）［14］、銀杏（Ginkgo biloba）［15］和藜（Chenopodium album）［16］等植物中相繼分離到CLH基因，并對其進行了初步研究，發(fā)現(xiàn)不同物種的CLH基因在植物生長發(fā)育過程中具有不同的表達模式和功能。

小麥（Triticum aestivum）是世界上分布最為廣泛的禾本科作物之一，其高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)對于國家的糧食安全具有重要意義。小麥高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的實現(xiàn)需要從源頭抓起，即提高光合作用能力，確?！霸础贝?、“流”暢、“庫”足。葉綠素是小麥進行光合作用的主要色素，葉綠素降解的加快會使葉片發(fā)黃、灌漿時間縮短、籽粒不飽滿，最終導致小麥減產(chǎn)［17］。迄今為止，小麥CLH基因家族成員尚未被鑒定，而且CLH家族成員如何在小麥的葉綠素降解過程中發(fā)揮作用有待進一步研究。

鑒于此，本研究利用生物信息學分析方法明確小麥CLH基因家族成員，并對其進行染色體定位、理化性質(zhì)、保守基序（motif）、基因結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)以及啟動子順式作用元件分析，然后根據(jù)CLH基因家族成員在不同組織和不同脅迫處理下的表達模式，初步鑒定TaCLHs在葉綠素降解過程中發(fā)揮的作用，為后續(xù)基因功能鑒定奠定試驗基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 自然衰老材料

試驗所用的花后自然衰老的冬小麥品種為煙農(nóng)19，于2019年種植在山西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)作站基地（北緯37°25′，東經(jīng)112°25′），次年記錄開花期。隨機選取長勢一致的植株，分別取花后0、7、10、16、19、22、25和30 d的小麥植株旗葉用于時空表達模式分析。

1.1.2 脅迫處理材料

經(jīng)次氯酸鈉（2.6%）消毒的小麥種子在蒸餾水中浸泡12 h至露白后放置在光照培養(yǎng)箱內(nèi)水培，待小麥幼苗長至兩葉一心期進行非生物脅迫處理。

黑暗脅迫：分別置于光強為0 Lux的光照培養(yǎng)箱中處理0、6、12、24、48和72 h。

激素脅迫：分別置于添加了50 μmol/L脫落酸（abscisic acid，ABA）、50 μmol/L茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）的溶液中處理0、6、12、24、48和72 h。

取各個時間點的小麥葉片迅速保存于-80℃冰箱，用于后續(xù)表達驗證試驗。

1.2 試驗方法

試驗所需小麥全基因組序列、蛋白序列和GTF文件等均從Ensembl Plants數(shù)據(jù)庫（https://plants.ensembl.org/info/data/ftp/index.html）中下載。

1.2.1 小麥CLH基因家族成員的鑒定

從Pfam數(shù)據(jù)庫（http://pfam.xfam.org/）中下載CLH基因家族的隱馬爾可夫模型（Hidden Markov Model，HMM）文件（PF07224），利用TBtools軟件［18］的Simple HMM Seach功能檢索小麥蛋白序列，將獲得的蛋白作為CLH基因家族的候選成員。然后，將候選成員上傳至Pfam數(shù)據(jù)庫進行二次篩選，剔除掉不含有CLH結(jié)構(gòu)域的蛋白序列，剩余蛋白即為小麥CLH基因家族的成員。

1.2.2 小麥CLH基因家族的系統(tǒng)進化分析

從Ensembl Plants數(shù)據(jù)庫中下載小麥、藜麥、谷子、玉米和擬南芥的蛋白質(zhì)序列，使用同1.2.1的方法確定各作物CLH基因家族成員。利用MEGA-X軟件中的鄰接法（neighbor-joining， NJ）對這五個物種的CLH家族基因的蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 生物信息學分析

使用MEME網(wǎng)站（https://meme-suite.org/meme/index.html）對CLH基因家族的保守motif進行分析。從小麥基因信息GTF文件中提取TaCLHs的基因結(jié)構(gòu)信息，并通過TBtools將motif和基因結(jié)構(gòu)進行可視化。利用Expasy網(wǎng)站（https://web.expasy.org/protparam/）分析TaCLHs的分子量、等電點、穩(wěn)定指數(shù)和疏水性等相關理化性質(zhì)。利用cropPAL網(wǎng)站（https://croppal.org/）對家族成員進行亞細胞定位預測。利用SOPMA網(wǎng)站（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）預測CLH家族成員的二級結(jié)構(gòu)。通過TBtools軟件從小麥全基因組序列中快速提取小麥CLH基因家族成員啟動子區(qū)域（上游2 kb）。利用PlantCARE網(wǎng)站（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）分析與生物和非生物脅迫相關的順式作用元件。

1.2.4 小麥CLH基因家族的表達模式分析

為研究CLH家族成員在不同組織器官中的表達情況，將TaCLHs序列提交到ExpVIP數(shù)據(jù)庫（http://www.wheat-expression.com/）中進行組織特異性分析，主要對4個組織（根、葉/嫩枝、穗和種子）的3個時期（幼苗期、營養(yǎng)生長期和生殖生長期）進行了分析。

1.2.5 植物總RNA提取與引物設計

利用Trizol法提取RNA。使用TaKaRa公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一條鏈。根據(jù)小麥數(shù)據(jù)庫中公布的序列設計部分TaCLHs的熒光定量引物（表1），引物由北京擎科生物技術公司合成。

表1 qRT-PCR引物序列Tab. 1 qRT-PCR primer sequence

1.2.6 實時熒光定量PCR與數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用TaKaRa公司的熒光定量試劑盒檢測Ta-CLHs的表達模式。每個樣本均設置3個平行樣，內(nèi)參基因Actin和TaCLHs均做3次生物學重復。采用2-△△Ct法計算基因的相對表達量。

2 結(jié)果與分析

2.1 TaCLHs的染色體定位

通過小麥全基因組水平掃描共鑒定到13個TaCLHs，根據(jù)它們在染色體上的分布位置將13個成員分別命名為TaCLH1～TaCLH13。13個家族成員主要分布在9條染色體上（圖1），分別是3A、3B、3D、4B、5A、5D、6A、6B和6D染色體。其中在6B染色體上分布著3個基因，分別是TaCLH10、Ta-CLH11和TaCLH12；在5D和6A染色體上分別分布著2個基因，其余6條染色體上均只有1個家族基因。

圖1 TaCLHs基因在染色體上的分布Fig. 1 Chromosomal localization of TaCLHs gene

2.2 TaCLHs蛋白的系統(tǒng)進化分析

為了進一步研究CLH基因家族的系統(tǒng)發(fā)育關系，將小麥中的13個CLHs與藜麥（Chenopodium quinoaWilld.）、谷子（Setaria italica）、擬南芥和玉米（Zea maysL.）中的CLH蛋白進行序列分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明（圖2），五個物種的CLH基因家族成員共分為四大組（Group Ⅰ～Ⅳ），Group Ⅰ中只有藜麥和谷子的部分CLHs成員，而小麥的13個CLHs全部分布在其他三組中，其中Group Ⅱ中包含6個成員，Group Ⅲ中包含4個成員，Group Ⅳ中包含3個成員。通過對比分析發(fā)現(xiàn)，TaCLHs與單子葉植物玉米和谷子的親緣關系較近，而與雙子葉植物擬南芥和藜麥的親緣關系較遠。

圖2 CLHs蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Phylogenetic tree of CLHs proteins

2.3 TaCLHs的理化性質(zhì)預測

分析13個TaCLHs的理化性質(zhì)發(fā)現(xiàn)（表2）：Ta-CLHs編碼的氨基酸個數(shù)介于290（TaCLH11）～329（TaCLH12）之間；相對分子量在30 968.82（Ta-CLH11）～35 668.10（TaCLH12）Da之間；理論等電點介于4.83（TaCLH4）～7.15（TaCLH3）之間，大部分屬于弱酸性蛋白；總平均疏水指數(shù)均大于0，表明都是疏水性蛋白；除TaCLH4和TaCLH11的穩(wěn)定指數(shù)大于40表現(xiàn)出不穩(wěn)定外，其余11個成員的蛋白性質(zhì)均穩(wěn)定；此外，除了TaCLH12定位在質(zhì)體內(nèi)，其余12個TaCLHs均定位在細胞質(zhì)基質(zhì)中。

表2 TaCLHs 的理化性質(zhì)Tab. 2 Physicochemical parameters of TaCLHs

2.4 TaCLHs基因家族的保守基序和基因結(jié)構(gòu)分析

為了進一步查找小麥中CLH家族成員所包含的保守序列，使用MEME網(wǎng)站預測保守基序（motifs），結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖3）：13個TaCLHs中最多出現(xiàn)了21個motifs，其中TaCLH1、TaCLH2和TaCLH3均含有13個相同的motifs；TaCLH8、TaCLH9、TaCLH10和TaCLH13同樣含有12個相同的motifs。此外，13個TaCLHs基因中均包含motif 8、1、6、3、4、2、9，這7個motifs出現(xiàn)頻率最高，為100%；而motif 20和21均只在一個基因中出現(xiàn)，頻率最低，為7.69%。對比motif序列發(fā)現(xiàn)，motif 3中含有一個以絲氨酸殘基為中心的“GHSRGG”的脂肪酶保守區(qū)域。

圖3 TaCLHs基因家族的保守基序與基因結(jié)構(gòu)分析Fig. 3 Conserved motif and gene structures analysis of TaCLHs

分析TaCLHs的基因結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子和外顯子數(shù)量差異較小，主要分為三大類，其中只含有一個外顯子的基因是TaCLH4，占總數(shù)的7.69%；含有兩個外顯子的基因有9個，占總數(shù)的69.23%；含有三個外顯子的基因有3個，分別是TaCLH1、Ta-CLH2和TaCLH3，占總數(shù)的23.08%。

2.5 TaCLHs蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析

蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)是連接一級結(jié)構(gòu)和高級結(jié)構(gòu)的中心樞紐。使用網(wǎng)站對小麥CLH家族成員進行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)在線預測（表3），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，13個成員間的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)元件組成類似，均包括α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲4種成分，且無規(guī)則卷曲和α-螺旋在蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中占比較多，而延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角則相對占比較少。其中，無規(guī)則卷曲占二級結(jié)構(gòu)總量的44.38% ~ 50.32%；α-螺旋占二級結(jié)構(gòu)總量的25.64% ~ 33.43%；延伸鏈占二級結(jié)構(gòu)總量的16.10% ~ 19.20%；β-轉(zhuǎn)角占二級結(jié)構(gòu)總量的4.02% ~ 8.28%。預測結(jié)果表明，無規(guī)則卷曲和α-螺旋是構(gòu)成TaCLHs蛋白二級結(jié)構(gòu)的主要元件。

表3 TaCLHs 蛋白的二級結(jié)構(gòu)預測Tab. 3 Predicted secondary structure of TaCLHs proteins

2.6 TaCLHs的啟動子順式作用元件分析

對CLHs編碼區(qū)上游2 000 bp的啟動子區(qū)域進行順式作用調(diào)控元件分析（圖4和圖5），發(fā)現(xiàn)其含有豐富的順式作用元件，主要分為植物激素響應元件、環(huán)境脅迫響應元件和植物生長發(fā)育響應元件三大類。植物激素響應元件主要有脫落酸響應元件［A-box和ABA responsive element（ABRE）］、茉莉酸甲酯響應元件（CGTCA-motif和TGACGmotif）、生長素響應元件［auxein responsive element（AuxRE）、AuxRR-core和TGA-element］、赤霉素響應元件（F-box和P-box）、水楊酸響應元件（salicylic acid response element，TCA）和乙烯響應元件（ethylene responsive element，ERE），其中脫落酸和茉莉酸甲酯的響應元件最多。環(huán)境脅迫響應元件包括光響應元件（Box 4、GATA-motif、G-box、GT1-motif、I-box、TCCC-motif等）、缺氧響應元件（GC-motif）、厭氧響應元件［antioxidant response element（ARE）和O2-site］、干旱響應元件（MYB binding sites，MBS）、低溫響應元件（low temperature respone，LTR）和其他相關逆境響應元件［stress response element（STRE）和wound response element（WRE3）］等，光響應元件所占比例最多。植物生長發(fā)育響應元件主要包括CCGTCC motif分生組織表達元件。其中，13個TaCLHs基因的啟動子區(qū)域均含有光響應元件和脫落酸響應元件。此外，除了TaCLH5和TaCLH12中沒有MeJA響應元件外，其余11個基因均含有該調(diào)控元件。由于葉綠素是光合作用中捕獲光的主要成分，因此，光響應元件在13個TaCLHs啟動子中出現(xiàn)的次數(shù)最多。此外，ABA和MeJA響應元件在13個家族成員中的數(shù)目僅次于光響應元件，因此，試驗后期對它們進行了激素脅迫處理。

圖4 TaCLHs啟動子區(qū)域的順式作用元件熱圖Fig. 4 Heatmap of cis-acting elements in the promoter region of TaCLHs

圖5 TaCLHs啟動子區(qū)域的順式作用元件分布Fig. 5 Distribution of cis-acting elements in promoter region of TaCLHs

2.7 TaCLHs的表達模式分析

2.7.1TaCLHs的組織表達模式分析

利用ExpVIP數(shù)據(jù)庫中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對TaCLHs在不同時期（幼苗期、營養(yǎng)生長期和生殖生長期）和不同部位（根、葉/嫩枝、穗和種子）的表達模式進行分析。

TaCLHs基因在不同組織中的表達模式有明顯差異（圖6）。TaCLH4主要在種子和穗中表達，而其余12個TaCLHs主要在葉/嫩枝和穗中表達，說明CLH基因家族成員均具有組織特異性，可能在植物葉片和穗部發(fā)育等方面起著重要作用。

圖6 TaCLHs基因在不同組織中的表達熱圖Fig. 6 Heatmap of TaCLHs gene expression in different tissues of wheat

相同基因在同一組織的不同發(fā)育階段表達量差異明顯。13個TaCLHs在生殖生長階段的穗中表達量均要高于營養(yǎng)生長階段。TaCLH1、TaCLH2、TaCLH3、TaCLH5和TaCLH7在生殖生長階段中的葉/嫩枝表達量要高于營養(yǎng)生長階段和幼苗生長階段。這些結(jié)果表明，同一基因在不同發(fā)育時期起著不同作用，可能受某些生長發(fā)育的因素誘導。

2.7.2 脅迫處理下TaCLHs的表達模式分析

13個TaCLHs的組織表達模式數(shù)據(jù)顯示，Ta-CLH4、TaCLH7、TaCLH9、TaCLH10、TaCLH11和TaCLH12整體上均處于一個低水平表達，因此，本研究分析其余7個TaCLHs在自然衰老、黑暗、ABA和MeJA處理下的表達模式。

對自然衰老過程下的表達趨勢進行分析（圖7a），發(fā)現(xiàn)TaCLHs在自然衰老過程中的表達量變化波動較大，但是達到表達量最大值的時間點有差異。其中TaCLH1、TaCLH2、TaCLH13在花后10 d表達量最大；TaCLH3在花后22 d表達量最大；TaCLH5在花后25 d表達量最大；TaCLH6在花后7 d表達量最大；TaCLH8在花后16 d表達量最大。這表明TaCLHs在葉片衰老過程中錯峰表達。

在黑暗處理過程中，TaCLHs表達量達到最大值的時間點有差異（圖7b）。其中TaCLH5、TaCLH6和TaCLH13在黑暗處理后的6 h達到表達量的最大值，分別為處理前的21.57、147.49和5.39倍；Ta-CLH1、TaCLH2和TaCLH3的表達量最大值出現(xiàn)在處理24 h時；TaCLH8則在處理72 h達到峰值。在ABA脅迫下的TaCLH5、TaCLH6、TaCLH8和Ta-CLH13在整個處理過程中低水平表達（圖7c）；Ta-CLH1、TaCLH2和TaCLH3的表達模式較為相近，均呈現(xiàn)出一個下降-上升-下降的過程，且峰值都出現(xiàn)在48 h。在MeJA處理過程中，TaCLHs的表達模式有明顯的差異（圖7d）。其中TaCLH2和TaCLH6在處理后的表達量都沒有超過處理前的表達量，處于一個低水平表達；TaCLH5和TaCLH8在整個處理過程中呈現(xiàn)出一個下降-上升-下降-上升的過程，但是表達量最大值出現(xiàn)的時間點不一樣，TaCLH5最大值出現(xiàn)在12 h，TaCLH8出現(xiàn)在72 h。從結(jié)果看出，TaCLHs的表達受不同脅迫處理誘導，表明Ta-CLHs在非生物脅迫中發(fā)揮了一定的作用。

圖7 TaCLHs基因在不同脅迫下的表達熱圖Fig. 7 Heatmap of TaCLHs gene expression under different stresses

3 討論

植物在長期的自然選擇過程中形成了一套復雜的脅迫應答響應機制來適應環(huán)境的變化，也因此產(chǎn)生了一系列植物特有的基因家族，分析這些基因家族的特性有利于了解植物的生理機制［19］。本研究發(fā)現(xiàn)，小麥CLH基因家族包含13個成員，較擬南芥、玉米、谷子、藜麥物種多，可能是因為小麥是異源六倍體作物，在A、B、D三個基因組上存在同源基因［20］，或者是因為CLH基因家族內(nèi)部發(fā)生了基因復制現(xiàn)象，如TaCLH6和TaCLH7在5D染色體上緊密排列呈串聯(lián)分布，這種串聯(lián)重復基因在功能上可能相似或存在協(xié)同作用［21］?；蚪?jīng)轉(zhuǎn)錄翻譯生成蛋白質(zhì)來行使生物學功能，因此，了解蛋白質(zhì)在細胞中發(fā)揮作用的位置將有助于研究基因的功能［22］。本研究中除了TaCLH12的亞細胞定位預測在質(zhì)體內(nèi)，其余12個CLHs均預測在細胞質(zhì)基質(zhì)中，表明TaCLHs在植株生長發(fā)育過程中主要集中在細胞質(zhì)中發(fā)揮作用，與擬南芥中的定位結(jié)果一致。同時每個基因共有的motif 3中都含有一個以絲氨酸殘基為中心的“GHSRGG”脂肪酶保守區(qū)域，與前人研究一致［14-15］。

不同發(fā)育時期以及不同組織部位的表達模式在一定程度上可以預測基因參與的生長發(fā)育過程和分子功能［23］。CLHs在植物中表現(xiàn)出明顯的組織特異性，主要在葉片中高表達，而在根中幾乎不表達［13］。小麥CLH基因家族也具有相同的結(jié)果，但是TaCLHs除了在葉片中高表達外，也在生殖生長階段的穗中有表達，推測TaCLHs可能主要在葉片生長發(fā)育階段和穗發(fā)育后期發(fā)揮作用。

此前很多研究已經(jīng)證實，自然衰老、光和植物激素等都可以誘導CLHs表達，例如：CLH1表達量隨著草地早熟禾葉片不斷發(fā)育逐漸增加，且在黑暗處理中期呈現(xiàn)出一個驟增的過程，此外ABA也能誘導草地早熟禾葉片中CHL1基因的表達來加速葉綠素降解［13］；在擬南芥中過表達CLH1能提高幼苗對光的耐受性，從而起到光保護作用，并且MeJA能強烈誘導CLH1的表達，從而降低植物體內(nèi)葉綠素的含量［24］。順式作用元件預測中發(fā)現(xiàn)，13個TaCLHs的啟動子區(qū)含有大量與光響應和植物激素響應等密切相關的順式作用元件，且通過熒光定量分析發(fā)現(xiàn)，TaCLHs均響應不同脅迫處理。根據(jù)研究結(jié)果推測，CLHs基因可能通過與植物激素和環(huán)境脅迫相關基因互相作用來調(diào)控植物的生長發(fā)育和對脅迫環(huán)境的抵御能力。

CLH是葉綠素降解過程中的關鍵酶，在植物生長發(fā)育過程中扮演著不同的角色。目前研究表明，擬南芥的CLH在幼葉階段的葉綠素降解過程中發(fā)揮光保護功能［9］，草地早熟禾的CLH在衰老時期的葉綠素降解過程中發(fā)揮作用［11-13］。研究發(fā)現(xiàn)，啟動子區(qū)順式作用元件可以通過結(jié)合上游轉(zhuǎn)錄因子來精確調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的起始和效率，而順式作用元件的種類和數(shù)目則可導致基因的表達量有差異［25］。分析CLH基因家族的啟動子區(qū)域順式作用元件，發(fā)現(xiàn)其含有不同種類和數(shù)量的元件，因此，推測造成基因家族功能分化的原因可能是順式作用元件的差異性。本研究結(jié)果表明，小麥CLH家族成員在葉綠素降解過程中發(fā)揮的作用主要分為三類，第一類是幼苗階段受光誘導的基因，如TaCLH6在黑暗處理下誘導表達，表達量最大值可達到處理前的147.49倍，而在自然衰老過程中的表達量相對較低，最大值為衰老起始前的2.39倍，結(jié)合前人研究成果推測TaCLH6可能主要在幼苗階段受光的誘導表達［9］；第二類是在衰老階段參與葉綠素降解的基因，如TaCLH1、TaCLH2和TaCLH3在生殖生長階段的表達量均要高于幼苗和營養(yǎng)生長階段，且在自然衰老過程、黑暗處理和ABA脅迫下均被誘導表達，且表達模式大致相同，推測這3個基因可能主要在生長發(fā)育后期發(fā)揮作用，與草地早熟禾中的CLH1基因的研究結(jié)果一致［13］，同時也發(fā)現(xiàn)這3個基因均含有3個外顯子，且在系統(tǒng)發(fā)育樹中被聚在單獨的一類中，基于此推測插入的內(nèi)含子可能在一定程度上加大了轉(zhuǎn)錄水平可變剪切的復雜性，導致TaCLH1、TaCLH2和TaCLH3的進化和功能的分化［26］；第三類是在兩個發(fā)育時期均發(fā)揮作用的基因，如TaCLH5在苗期黑暗和MeJA處理下都被不同程度的誘導表達，且該基因在在幼苗、營養(yǎng)生長和生殖生長階段的表達量都很高，但是生殖生長的表達量相對是最高的，基于此推測TaCLH5在幼苗和衰老時期均發(fā)揮作用。這些研究結(jié)果均表明，基因結(jié)構(gòu)和順式作用元件的多樣性可能導致TaCLHs在整個發(fā)育過程中參與葉綠素降解的階段有差異。

綜上所述，本研究通過生物信息學分析方法鑒定小麥CLH基因家族成員，初步分析了家族成員的基因結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)等方面，并發(fā)現(xiàn)TaCLHs在葉綠素降解過程中發(fā)揮著不同的作用，這些結(jié)果為今后研究TaCLHs的基因功能提供了參考依據(jù)。