信號(hào)分子活性氧和NO在土荊芥化感脅迫誘導(dǎo)蠶豆根邊緣細(xì)胞死亡中的調(diào)控

何勝利,谷從璟,2,馬丹煒,*,張 紅

1 四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 成都 610101 2 云南省梁河縣第一中學(xué), 梁河 679200

“Novel Weapons”假說(shuō)認(rèn)為,化感作用是外來(lái)植物成功入侵的機(jī)制之一[1],擴(kuò)散到新環(huán)境中的入侵植物比原產(chǎn)地具有更強(qiáng)的化感作用,從而在競(jìng)爭(zhēng)中占有優(yōu)勢(shì)[2]。它們通過(guò)淋溶、揮發(fā)、根系分泌、殘株腐解等方式釋放到環(huán)境中的化感物質(zhì),大多數(shù)最終將進(jìn)入土壤,抑制其他植物根系乃至整個(gè)植株的生長(zhǎng)[3]。根邊緣細(xì)胞 (Root border cells, RBCs) 是在植物根尖發(fā)育過(guò)程中由根冠分生組織發(fā)育而來(lái)并聚集在根冠周?chē)囊蝗禾厥饧?xì)胞[4—5],根邊緣細(xì)胞及其分泌物質(zhì)構(gòu)成的胞外誘捕網(wǎng)(Border cell extracellular traps, BETs)[6]共同在根和土壤之間構(gòu)筑了一道保護(hù)屏障,抵御包括化感物質(zhì)等在內(nèi)的外界不良因素對(duì)根系的影響[7—9]。土荊芥(ChenopodiumambrosioidesL.)原產(chǎn)于熱帶美洲,現(xiàn)廣泛分布于世界熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū), 憑借其較強(qiáng)的化感作用[10]在我國(guó)大部分地區(qū)形成了優(yōu)勢(shì)種群,是一種威脅我國(guó)生態(tài)安全的外來(lái)惡性雜草[11]。土荊芥全株富含的揮發(fā)性化感物質(zhì)具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性和遺傳毒性[12—14],干擾受體RBCs的釋放并引起RBCs活性降低[13],進(jìn)而導(dǎo)致根尖細(xì)胞出現(xiàn)氧化損傷[15]以及Ca2+和Caspase依賴(lài)性的細(xì)胞凋亡[16]?；钚匝?Reactive oxygen species,ROS)和NO本身具有毒性,另一方面也是植物細(xì)胞信號(hào)傳遞的關(guān)鍵組分,在逆境脅迫下,植物細(xì)胞內(nèi)ROS和NO增加,其濃度在未達(dá)到毒性水平的情況下,會(huì)作為信號(hào)分子進(jìn)行傳遞,觸發(fā)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程以應(yīng)對(duì)逆境脅迫[17]。然而,有關(guān)土荊芥化感作用誘導(dǎo)RBCs死亡及其相關(guān)信號(hào)調(diào)節(jié)過(guò)程卻知之甚少。本研究以西南地區(qū)土荊芥入侵地廣泛種植的蠶豆(ViciafabaL.)RBCs為靶標(biāo),研究了土荊芥揮發(fā)性化感物質(zhì)作用下,受體RBCs的ROS和NO等信號(hào)分子和粘膠層的變化規(guī)律,旨在探討土荊芥揮發(fā)性化感物質(zhì)誘導(dǎo)受體RBCs死亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程,明確土荊芥化感作用對(duì)受體防御功能的干擾機(jī)制,為土荊芥入侵機(jī)制的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

成熟期的土荊芥全株采自四川省成都市包江橋附近(104°5′57″E,30°35′34″N)；供試蠶豆品種“成胡14#”購(gòu)自成都市新都區(qū)龍橋鎮(zhèn)。試驗(yàn)所用標(biāo)準(zhǔn)品α-萜品烯購(gòu)于上海Aladdin-阿拉丁試劑公司 (≥90%),ρ-對(duì)傘花素購(gòu)自上海Adamas-beta試劑有限公司(≥99%)。

1.2 揮發(fā)油和處理母液的制備

將土荊芥材料剪成1—2 cm的小段,參照Singh等[18]的水蒸氣蒸餾法提取土荊芥揮發(fā)油,經(jīng)無(wú)水Na2SO4除水后4℃保存?zhèn)溆?。該揮發(fā)油的密度為843 mg/mL,其主要成分α-萜品烯和ρ-對(duì)傘花素的含量分別為151 mg/mL和156 mg/mL。

分別用二甲基亞砜(DMSO)配制土荊芥揮發(fā)油、α-萜品烯和ρ-對(duì)傘花素的處理母液。將10 μL 揮發(fā)油用25% DMSO 稀釋至100 μL 得到0.1 μL /μL的揮發(fā)油處理母液。根據(jù)10 μL揮發(fā)油中α-萜品烯和ρ-對(duì)傘花素的含量,配制二者的處理母液,其終濃度分別為0.0205 μL/μL 和0.0179 μL/μL。

1.3 材料培養(yǎng)及處理1.3.1 材料培養(yǎng)和RBCs的收集

選擇大小一致,飽滿(mǎn)無(wú)損的蠶豆種子,用0.5%的KMnO4溶液表面消毒10—15 min,使用蒸餾水清洗3—5次,置于25℃培養(yǎng)箱浸種24 h,催芽2—3 d,待種子露白后,將種子鋪在墊有濕潤(rùn)雙層無(wú)菌紗布的磁盤(pán)中,再蓋上一層無(wú)菌紗布,置于25℃培養(yǎng)箱中黑暗條件下繼續(xù)培養(yǎng)2—3 d。待根長(zhǎng)約3 cm時(shí)(此時(shí)RBCs數(shù)量達(dá)到峰值),隨機(jī)切取長(zhǎng)約5 mm根尖5個(gè),置于裝有100 μL ddH2O的1.5 mL離心管中,旋渦振蕩30 s,再用50 μL ddH2O沖洗根尖2次,移液槍吸打3—4次,使成團(tuán)的RBCs分散,制得細(xì)胞懸液。

1.3.2試驗(yàn)處理

A組：分別取處理母液1、2、3、4 μL和5 μL (記為T(mén)1, T2, T3, T4, T5),用DMSO補(bǔ)足體積至5 μL,加入盛有200 μL細(xì)胞懸液的離心管,混勻。溶劑對(duì)照組為25% DMSO 5 μL +200 μL ddH2O,陰性對(duì)照組為205 μL ddH2O；所有處理均置于25 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)30 min。每處理重復(fù)3次。

B組：分別取揮發(fā)油、α-萜品烯和ρ-對(duì)傘花素處理母液5 μL,分別加入ROS清除劑抗壞血酸(AsA：0.05,0.10,0.50 mmol/L) 、硝酸還原酶抑制劑疊氮化鈉(NaN3：0.05,0.25,1.25 mmol/L)、泛Caspase抑制劑(Z-VAD-FMK：0.063,0.125,1.250 mmol/L),混勻后加入裝有200 μL細(xì)胞懸液的離心管,混勻。溶劑對(duì)照組為25% DMSO 5 μL +200 μL ddH2O,陰性對(duì)照組為205 μL ddH2O；所有處理均置于25 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)30 min。每處理重復(fù)3次。處理結(jié)束后,用ddH2O漂洗2次進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定。

1.4 指標(biāo)測(cè)定

1.4.1RBCs的原位觀察

隨機(jī)取2個(gè)長(zhǎng)度約3.0 cm的根尖,分別置于載玻片上,將其中1個(gè)根尖上滴1滴ddH2O,將根冠浸入水中數(shù)秒后,滴1滴吖啶橙/溴化乙錠(AO/EB)染液；另1個(gè)根尖直接滴加AO/EB染液；二者均在室溫下避光染色3 min,用Nikon ECLIPSE 55i熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.4.2RBCs形態(tài)觀察和活性測(cè)定

RBCs的凋亡形態(tài)觀察參照楊小環(huán)等[19]的方法。取細(xì)胞懸液20 μL,加入8 μL AO/EB染液,混勻后避光染色1—3 min,Nikon ECLIPSE 55i熒光顯微鏡觀察并拍照,每個(gè)處理重復(fù)3次。統(tǒng)計(jì)死亡細(xì)胞的數(shù)量和細(xì)胞總數(shù),計(jì)算RBCs死亡率：RBCs 死亡率=死亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.4.3RBCs黏膠層厚度的測(cè)定

采用楊小環(huán)等[19]的方法略有改動(dòng)。取細(xì)胞懸液40 μL,加入8 μL印度墨水均勻混合后染色1 min,用Nikon ECLIPSE 55i顯微鏡明場(chǎng)觀察并拍照,測(cè)量黏膠層厚度。

1.4.4RBCs中ROS原位觀察和含量測(cè)定

采用活性氧檢測(cè)試劑盒(碧云天,上海)測(cè)定,Nikon ECLIPSE 55i熒光顯微鏡觀察RBCs中ROS的分布,酶標(biāo)儀測(cè)定ROS相對(duì)熒光值(激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm,發(fā)射波長(zhǎng)為525 nm)。

1.4.5RBCs中NO含量的測(cè)定

采用DAF-FM DA(NO熒光探針)試劑盒(碧云天,上海)測(cè)定,酶標(biāo)儀測(cè)定NO相對(duì)熒光值(激發(fā)波長(zhǎng)為495 nm,發(fā)射波長(zhǎng)為515 nm)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

根據(jù)Williamson和Richardson[20]提出的化感作用響應(yīng)指數(shù)(Allelopathy response index, RI)用于衡量化感作用強(qiáng)度。

式中,C為對(duì)照值,T為處理值,RI<0表示抑制效應(yīng),RI>0表示促進(jìn)效應(yīng),其絕對(duì)值表示化感作用強(qiáng)度大小；化感作用綜合效應(yīng)(Synthesis effect, SE)為RI的算術(shù)平均值[21]。

用SPSS 20.0對(duì)測(cè)定指標(biāo)進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)、Tukey檢驗(yàn)多重比較(LSD)和Pearson相關(guān)性分析,Excel 2019作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 土荊芥揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)蠶豆RBCs形態(tài)的影響

圖1 蠶豆根邊緣細(xì)胞的原位觀察Fig.1 In situ observation of V. faba root border cells A：蠶豆根邊緣細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)圖；B：未浸入水中的根尖；C：浸入水中后的根尖

蠶豆RBCs呈現(xiàn)細(xì)長(zhǎng)的橢圓形(圖1A),明顯的細(xì)胞核,細(xì)胞質(zhì)清晰；從圖1B可以看出,蠶豆根尖未浸入水中時(shí),RBCs緊貼在根冠周?chē)?圖1B)。當(dāng)根尖浸入水中時(shí),RBCs就會(huì)從根冠周?chē)尫懦鰜?lái),甚至呈片狀狀態(tài)從根冠周?chē)撀?圖1C)。

2.2 土荊芥揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)蠶豆RBCs黏膠層厚度的影響

本研究中,溶劑對(duì)照組和陰性對(duì)照組的粘膠層厚度等各種指標(biāo)均無(wú)顯著差異(P>0.05),表明溶劑二甲基亞砜對(duì)RBCs影響不大,后續(xù)指標(biāo)對(duì)此不再贅述。與陰性對(duì)照組相比,在土荊芥揮發(fā)性物質(zhì)處理下RBCs粘膠層顯著增厚,其中以揮發(fā)油處理變化最大(圖2)。隨著處理濃度增加,RBCs粘膠層厚度逐漸增加(P<0.05),在最大處理濃度下,土荊芥揮發(fā)油、ρ-對(duì)傘花素和α-萜品烯處理的RBCs黏膠層厚度分別為對(duì)照組的2.21倍、2.14倍和1.95倍。

圖2 土荊芥揮發(fā)油、ρ-對(duì)傘花素和α-萜品烯作用下蠶豆RBCs黏膠層厚度的變化Fig.2 Changes of the Adhesive layer thickness of root border cells of V. faba exposed to the volatile oil from C. ambrosioides, p-cymene and α-terpineneA、B、C和D分別是對(duì)照、α-萜品烯、ρ-對(duì)傘花素和揮發(fā)油的T5處理組,不同小寫(xiě)字母表示同一處理組中不同處理之間在95%水平上的差異顯著性

2.3 土荊芥揮發(fā)性物質(zhì)作用下蠶豆RBCs內(nèi)ROS的變化

ROS原位觀察顯示 (圖3),陰性對(duì)照組中RBCs呈現(xiàn)較弱的綠色熒光, ROS主要集中在細(xì)胞核中,少部分分布在細(xì)胞壁上,而細(xì)胞質(zhì)中ROS的分布比較少 (圖3A)。α-萜品烯處理組中,ROS主要分布在細(xì)胞質(zhì)中(圖3B),而ρ-對(duì)傘花素處理組中ROS更多的集中分布在細(xì)胞質(zhì)中,細(xì)胞核中分布較少 (圖3C)；揮發(fā)油處理組綠色熒光最強(qiáng),ROS幾乎分布于整個(gè)細(xì)胞中(圖3D)。綜上所述,土荊芥揮發(fā)油、ρ-對(duì)傘花素和α-萜品烯處理誘導(dǎo)蠶豆RBCs內(nèi)ROS水平升高。

圖3 土荊芥揮發(fā)油、ρ-對(duì)傘花素和α-萜品烯作用下蠶豆根邊緣細(xì)胞內(nèi)ROS的分布Fig.3 Distribution of reactive oxygen species in root border cells exposed to volatile oil from C. ambrosioides, p-cymene and α-terpinene

圖4 土荊芥揮發(fā)油、ρ-對(duì)傘花素和α-萜品烯作用下蠶豆根邊緣細(xì)胞中ROS相對(duì)含量的變化Fig.4 Changes of ROS relative content in V. faba root border cells exposed to the volatile oil from C. ambrosioides, p-cymene and α-terpineneT1、T2、T3、T4、T5分別代表α-萜品烯、ρ-對(duì)傘花素和揮發(fā)油的不同處理濃度

土荊芥揮發(fā)油、ρ-對(duì)傘花素和α-萜品烯均可誘導(dǎo)RBCs內(nèi)ROS的積累(圖4),且隨著處理濃度的升高,ROS含量不斷增加。T5處理組的細(xì)胞中,ROS積累量最大,揮發(fā)油、ρ-對(duì)傘花素和α-萜品烯處理組分別為對(duì)照組的4.13倍、2.19倍和2.0倍。

2.4 土荊芥揮發(fā)性物質(zhì)作用下蠶豆RBCs內(nèi)NO含量的變化

圖5 土荊芥揮發(fā)油、ρ-對(duì)傘花素和α-萜品烯作用下蠶豆根邊緣細(xì)胞NO相對(duì)含量的變化Fig.5 Changes of NO relative content in V. faba root border cells exposed to the volatile oil from C. ambrosioides, p-cymene and α-terpinene

從圖5可知,隨著土荊芥揮發(fā)油、ρ-對(duì)傘花素和α-萜品烯濃度的升高,蠶豆RBCs內(nèi)NO的含量逐漸增大。當(dāng)濃度達(dá)到最大時(shí)(T5),細(xì)胞內(nèi)NO的含量達(dá)到最大值,分別為對(duì)照組的14.37倍、7.02倍和8.17倍。說(shuō)明土荊芥揮發(fā)油、ρ-對(duì)傘花素和α-萜品烯脅迫處理誘導(dǎo)蠶豆RBCs內(nèi)NO的產(chǎn)生。

2.5 土荊芥揮發(fā)性物質(zhì)作用下蠶豆RBCs活性的變化

2.5.1土荊芥揮發(fā)性物質(zhì)作用下蠶豆RBCs的形態(tài)學(xué)觀察

從圖6中可見(jiàn),土荊芥揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)蠶豆RBCs具有致死效應(yīng)。經(jīng)過(guò)AO/EB染色后,對(duì)照組(圖6A)RBCs呈現(xiàn)綠色熒光,細(xì)胞輪廓清晰,細(xì)胞核結(jié)構(gòu)明顯,且呈現(xiàn)綠色熒光亮斑；經(jīng)過(guò)揮發(fā)性物質(zhì)處理(圖6B, 圖6C, 圖6D)后,RBCs染色不均勻且細(xì)胞呈現(xiàn)淺橘紅色熒光,細(xì)胞核呈現(xiàn)橘紅色熒光亮斑,甚至部分細(xì)胞核已經(jīng)裂解,表明RBCs活性喪失,表現(xiàn)出凋亡特征。

圖6 土荊芥揮發(fā)油、ρ-對(duì)傘花素和α-萜品烯脅迫下蠶豆根邊緣細(xì)胞熒光圖像Fig.6 Root border cell fluorescence images of V. faba exposed to the volatile oil from C. ambrosioides, p-cymene and α-terpinene

2.5.2土荊芥揮發(fā)性物質(zhì)作用下蠶豆RBCs的活性變化

圖7顯示,蠶豆RBCs對(duì)土荊芥揮發(fā)性物質(zhì)十分敏感,在低濃度(T1)處理下,細(xì)胞都會(huì)大量死亡,隨著處理濃度的增大RBCs而增加,呈現(xiàn)濃度梯度效應(yīng)。最大處理濃度下(T5),揮發(fā)油、ρ-對(duì)傘花素和α-萜品烯處理組的細(xì)胞死亡率分別達(dá)到了78.29%、55.11%和47.88%。

2.5.3泛Caspase抑制劑對(duì)土荊芥揮發(fā)性物質(zhì)誘導(dǎo)RBCs死亡的影響

在處理組中加入泛Caspase抑制劑Z-VAD-FMK后,土荊芥揮發(fā)油、α-萜品烯和ρ-對(duì)傘花素誘導(dǎo)的RBCs死亡明顯減少(圖8),且Z-VAD-FMK濃度越大,死亡率越低(P<0.05)。在Z-VAD-FMK處理濃度最大時(shí),細(xì)胞死亡率較T5處理組顯著下降,揮發(fā)油、ρ-對(duì)傘花素和α-萜品烯處理組的細(xì)胞死亡率分別降低為10.56%、9.31%和12.28%。結(jié)合熒光染色試驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn),土荊芥揮發(fā)性物質(zhì)誘導(dǎo)RBCs死亡形式為Caspase依賴(lài)性的細(xì)胞凋亡。

2.5.4抗壞血酸對(duì)土荊芥揮發(fā)性物質(zhì)誘導(dǎo)RBCs死亡的影響

施加ROS清除劑AsA處理RBCs后,土荊芥揮發(fā)油、α-萜品烯和ρ-對(duì)傘花素誘導(dǎo)的RBCs死亡明顯減少(圖9)。即使施加低濃度AsA(0.05mmol/L),細(xì)胞凋亡率也會(huì)顯著降低(P<0.05),并且AsA濃度越高,這一效應(yīng)更為顯著,呈現(xiàn)濃度梯度效應(yīng)。當(dāng)AsA濃度最大時(shí)(0.50mmol/L),土荊芥揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)蠶豆RBCs致死的緩解效應(yīng)最強(qiáng),與T5處理組相比,揮發(fā)油、ρ-對(duì)傘花素和α-萜品烯處理組細(xì)胞死亡率顯著下降,分別降低為12.49%、10.41%和15.19%,表明在土荊芥揮發(fā)性物質(zhì)處理誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡與細(xì)胞內(nèi)ROS誘導(dǎo)的氧化損傷密切相關(guān)。

圖7 土荊芥揮發(fā)油、ρ-對(duì)傘花素和α-萜品烯作用下對(duì)蠶豆根邊緣細(xì)胞活性的變化Fig.7 Changes of the ctivity of V. faba root border cells exposed to the volatile oil from C. ambrosioides, p-cymene and α-terpinene

圖8 Caspase抑制劑對(duì)土荊芥揮發(fā)油、ρ-對(duì)傘花素和α-萜品烯誘導(dǎo)蠶豆根邊緣細(xì)胞死亡的緩解效應(yīng)Fig.8 Alleviated effect of Caspase inhibitor on volatile oil from C. ambrosioides, p-cymene and α-terpinene induced death of root border cells of V. faba

2.5.5NaN3對(duì)土荊芥揮發(fā)性物質(zhì)誘導(dǎo)RBCs死亡的影響

施加NO清除劑疊氮化鈉(NaN3)處理RBCs后,土荊芥揮發(fā)油、α-萜品烯和ρ-對(duì)傘花素誘導(dǎo)的RBCs死亡明顯減少(圖10)。即使施加低濃度NaN3(0.05mmol/L),細(xì)胞凋亡率也會(huì)顯著降低(P<0.05),并且NaN3濃度越高,這一效應(yīng)更為顯著,呈現(xiàn)濃度梯度效應(yīng)。當(dāng)NaN3濃度最大時(shí)(1.25mmol/L),對(duì)蠶豆RBCs的緩解效應(yīng)最強(qiáng),與單獨(dú)施加α-萜品烯、ρ-對(duì)傘花素和土荊芥揮發(fā)油的對(duì)照相比,細(xì)胞凋亡率分別降低為22.25%、22.55%和36.54%。

圖9 抗壞血酸對(duì)土荊芥揮發(fā)油、ρ-對(duì)傘花素和α-萜品烯誘導(dǎo)的蠶豆根邊緣細(xì)胞凋亡的緩解效應(yīng)Fig.9 Alleviated effect of ascorbic acid on the volatile oil from C. ambrosioides, p-cymene and α-terpinene induced death of root border cells of V. faba

圖10 NaN3對(duì)土荊芥揮發(fā)油、ρ-對(duì)傘花素和α-萜品烯誘導(dǎo)的蠶豆根邊緣細(xì)胞凋亡的緩解效應(yīng)Fig.10 Alleviated effect of NaN3 on the volatile oil from C. ambrosioides, p-cymene and α-terpinene induced death of root border cells of V. faba

2.5.6土荊芥揮發(fā)性物質(zhì)作用下蠶豆RBCs相關(guān)參數(shù)之間的相關(guān)性分析

圖11 土荊芥揮發(fā)油、α-萜品烯和ρ-對(duì)傘花素作用下蠶豆根邊緣細(xì)胞參數(shù)相關(guān)性熱圖Fig.11 Heat Map of the Correlation of Parameters of V. faba root border cells under the action of C. ambrosioides volatile oil, α-terpinene and p-cymene

從圖11相關(guān)性分析可知,RBCs死亡率與ROS和NO呈顯著正相關(guān)；在土荊芥揮發(fā)油作用下,RBCs死亡率與ROS和NO的相關(guān)系數(shù)較大,分別達(dá)到0.685和0.95。在ρ-對(duì)傘花素和α-萜品烯作用下,RBCs死亡率與ROS和NO也存在極顯著的相關(guān)性(P<0.01)。此外,在α-萜品烯和揮發(fā)油處理中,RBCs中ROS水平和NO水平的變化存在著極顯著的正相關(guān)關(guān)系(P<0.01)。上述結(jié)果表明,土荊芥揮發(fā)性物質(zhì)誘導(dǎo)RBCs死亡與ROS和NO之間有著緊密的相關(guān)關(guān)系,且ROS和NO二者協(xié)同作用的結(jié)果。

2.6 土荊芥揮發(fā)油與兩個(gè)主要成分化感效應(yīng)的比較

本研究綜合分析不同梯度處理下的細(xì)胞死亡率、粘膠層厚度、ROS水平、NO水平4個(gè)指標(biāo)化感響應(yīng)指數(shù)發(fā)現(xiàn),土荊芥揮發(fā)油及其兩個(gè)主要成分的化感綜合效應(yīng)指數(shù)(SE)從大到小依次是揮發(fā)油(0.782)>α-萜品烯(0.541)>ρ-對(duì)傘花素(0.536)。由此可見(jiàn),揮發(fā)油化感效應(yīng)最強(qiáng),揮發(fā)油的兩個(gè)主要成分的化感效應(yīng)比揮發(fā)油小,兩個(gè)單體成分的化感效應(yīng)差異不大。

3 討論

3.1 土荊芥化感脅迫對(duì)蠶豆根邊緣細(xì)胞的致死效應(yīng)

RBCs及其BETs是根系與土壤之間的一道生物屏障[22]。當(dāng)一種植物通過(guò)各種途徑釋放的化感物質(zhì)進(jìn)入土壤后,會(huì)刺激受體植物加速釋放根邊緣細(xì)胞并增加BETs厚度來(lái)抵御化感脅迫,如在肉桂酸作用下,黃瓜(CucumissativusL.)和西葫蘆(FigleafGourd)RBCs數(shù)量增加,BETs厚度增大[23]；在ρ-對(duì)羥基苯甲酸刺激下,葡萄RBCs通過(guò)增加數(shù)量、提高次生代謝物質(zhì)和水楊酸的積累,激活了細(xì)胞的抗氧化防御系統(tǒng)[24]；大豆[Glycinemax(Linn.) Merr.] RBCs受到土荊芥根系分泌物化感脅迫時(shí),可能通過(guò)加速死亡并分泌一些物質(zhì)螯合土荊芥根分泌物,以緩解根系分泌物對(duì)根尖組織的傷害[25]；豌豆(PisumsativumL.)RBCs受到土荊芥揮發(fā)油化感脅迫時(shí),根尖通過(guò)上調(diào)PME活性,加速釋放根邊緣細(xì)胞來(lái)抵御化感脅迫[26]。但這種緩解效應(yīng)是有限的,隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)、處理強(qiáng)度增大,RBCs活性下降而導(dǎo)致其保護(hù)根尖的功能減弱甚至喪失。本研究中,在土荊芥揮發(fā)油及其主要成分α-萜品烯和ρ-對(duì)傘花素作用下,蠶豆RBCs粘膠層厚度增大,隨著處理強(qiáng)度增加RBCs活性下降,與上述研究結(jié)果和本實(shí)驗(yàn)室之前的研究成果[7,14]相吻合。在泛Caspase抑制劑Z-VAD-FMK作用下,土荊芥揮發(fā)油、α-萜品烯和ρ-對(duì)傘花素誘導(dǎo)對(duì)RBCs的致死效應(yīng)明顯減弱,表明蠶豆RBCs的死亡形式是Caspase依賴(lài)性的細(xì)胞凋亡,熒光染色的細(xì)胞結(jié)構(gòu)特征也映證了這一論斷。由此可見(jiàn),化感作用通過(guò)誘導(dǎo)受體植物RBCs凋亡而干預(yù)了受體植物的防御功能。

土荊芥揮發(fā)油成分較為復(fù)雜,含有萜類(lèi)及其氧化物、酯類(lèi)、酮類(lèi)、醇類(lèi)和酚類(lèi)等化合物[13],并且其成分也隨著分布區(qū)而變化,在不同地區(qū)的土荊芥揮發(fā)油中普遍存在α-萜品烯和ρ-對(duì)傘花素這兩種主要成分[27-28]。Li等[16]研究發(fā)現(xiàn),土荊芥揮發(fā)油誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡效應(yīng)顯著高于α-萜品烯和ρ-對(duì)傘花素同時(shí)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡效應(yīng),揮發(fā)油誘導(dǎo)的化感應(yīng)激是其多種化學(xué)成分協(xié)同作用的結(jié)果。本研究通過(guò)分析綜合化感效應(yīng)發(fā)現(xiàn),α-萜品烯略大于ρ-對(duì)傘花素的化感效應(yīng),但二者的化感效應(yīng)小于揮發(fā)油,與上述研究結(jié)果基本一致。這一結(jié)果說(shuō)明,土荊芥揮發(fā)油對(duì)RBCs作用的物質(zhì)除ρ-對(duì)傘花素和α-萜品烯外,還存在著其他的化感活性物質(zhì)。由此可見(jiàn),土荊芥通過(guò)揮發(fā)途徑對(duì)蠶豆根系生長(zhǎng)所產(chǎn)生的化感作用應(yīng)該是包括α-萜品烯和ρ-對(duì)傘花素在內(nèi)的多種化感活性物質(zhì)協(xié)同作用的結(jié)果。后續(xù)研究尚需進(jìn)一步挖掘主效化感物質(zhì)。

3.2 ROS和NO對(duì)土荊芥化感脅迫誘導(dǎo)蠶豆根邊緣細(xì)胞凋亡的影響

細(xì)胞凋亡是一種在環(huán)境刺激下消除特定細(xì)胞的可控機(jī)制。當(dāng)外界脅迫程度超過(guò)植物自身的承受范圍時(shí),植物就會(huì)以ROS、NO等作為信號(hào)分子,誘導(dǎo)植物特定部位發(fā)生程序性死亡,從而避免脅迫對(duì)其他組織的傷害,由此獲得不良環(huán)境的適應(yīng)[29-30]。本研究結(jié)果表明,在土荊芥揮發(fā)油及其主要成分α-萜品烯和ρ-對(duì)傘花素化感作用下,蠶豆RBCs內(nèi)ROS和NO水平均大幅度升高,且呈現(xiàn)濃度依賴(lài)效應(yīng),尤其是揮發(fā)油處理組的漲幅最為劇烈。另一方面,RBCs卻隨著處理濃度的增大而死亡率逐漸增加。相關(guān)性分析表明,α-萜品烯和ρ-對(duì)傘花素2個(gè)處理組中,RBCs死亡率與ROS和NO水平呈極顯著的相關(guān)性。揮發(fā)油處理組中,ROS水平與RBCs死亡率和NO水平之間均存在著呈極顯著的正相關(guān)性。通過(guò)施加ROS和NO的清除劑后,土荊芥揮發(fā)性化感物質(zhì)對(duì)蠶豆RBCs的致死效應(yīng)得到顯著緩解。綜合上述結(jié)果可以說(shuō)明,ROS和NO參與了土荊芥化感脅迫誘導(dǎo)RBCs凋亡的信號(hào)調(diào)節(jié)過(guò)程。在逆境脅迫下,ROS和NO同時(shí)產(chǎn)生,二者之間存在著復(fù)雜的互作關(guān)系[31]。NO可以作為一種抗氧化劑,在氧化應(yīng)激過(guò)程中淬滅ROS,減少膜脂過(guò)氧化[32],而高濃度的NO能導(dǎo)致ROS爆發(fā),誘導(dǎo)氧化損傷而引起細(xì)胞死亡[33]。ROS和NO協(xié)同作用觸發(fā)了細(xì)胞快速死亡,是凋亡樣細(xì)胞死亡和自噬細(xì)胞死亡的觸發(fā)器[34]。本研究結(jié)果表明,在α-萜品烯處理組和揮發(fā)油處理組中,ROS水平變化和NO水平變化之間具有極顯著的關(guān)聯(lián)性,表明二者協(xié)同作用調(diào)控了蠶豆根邊緣細(xì)胞凋亡(圖12)。

圖12 土荊芥揮發(fā)性化感物質(zhì)對(duì)受體植物根生長(zhǎng)的作用機(jī)制示意圖Fig.12 Schematic diagram of the mechanism of action of volatile allelochemicals from C. ambrosioides on the growth of recipient plant root

4 結(jié)論

土荊芥揮發(fā)油及其主要成分α-萜品烯、ρ-對(duì)傘花素具有較強(qiáng)的化感脅迫,導(dǎo)致蠶豆RBCs粘膠層厚度增加,細(xì)胞內(nèi)ROS和NO水平升高,二者協(xié)同作用,誘導(dǎo)RBCs出現(xiàn)Caspase依賴(lài)性的細(xì)胞凋亡,導(dǎo)致受體植物防御功能障礙,影響植物根系發(fā)育。