首烏提取物抑制人血清蛋白糖基化反應(yīng)研究

謝作樺 姜周 盛文勝 黃國太 王愛貴 周麗紅

摘要 [目的]研究首烏提取物對人血清蛋白糖基化的抑制效果。[方法]選擇不同濃度的首烏提取物混入人血清蛋白-葡萄糖反應(yīng)體系中得到不同的糖基化產(chǎn)物。[結(jié)果]加入首烏提取物抑制劑的糖基化人血清蛋白的自由氨基含量減少緩慢，空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，疏水基團(tuán)也不易暴露;從抗氧化性角度而言，ABTS+·、DPPH·、超氧陰離子自由基清除能力和還原能力均降低，說明糖基化后期產(chǎn)物生成量減少。[結(jié)論]該研究為首烏提取物在人類醫(yī)藥健康領(lǐng)域的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 首烏提取物;人血清蛋白;糖基化反應(yīng);結(jié)構(gòu);抗氧化活性

中圖分類號 R 285文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2022）04-0172-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.04.045

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Study on Inhibition of Glycosylation of Human Serum Protein by Extract of Radix Polygoni Multiflori

XIE Zuo-hua1，JIANG Zhou2，SHENG Wen-sheng1 et al （1.Jiangxi Deshang Pharmaceutical Research Institute Co.，Ltd.，Zhangshu，Jiangxi 331200;2.Shandong Hongye Food Co.，Ltd.，Rongcheng，Shandong 264300）

Abstract [Objective]To study the inhibitory effect of extract of radix polygoni multiflori on the glycosylation of human serum protein.[Method] The extracts of radix polygoni multiflori with different concentrations were mixed into the human serum protein-glucose reaction system to obtain different glycosylation products.[Result]The free amino group content of glycosylated human serum protein added with radix polygoni multiflori extract inhibitor decreased slowly，the steric structure was changed，and the hydrophobic group was not easily exposed.From the perspective of antioxidant properties，ABTS+·，DPPH·，superoxide anion radical scavenging ability and reducing ability were all reduced，indicating that the production of late glycosylation products was reduced.[Conclusion]This study provides theoretical basis for the development and utilization ofextract of radix polygoni multiflori in the field of human medicine and health.

Key words Extract of radix polygoni multiflori;Human serum protein;Glycosylation reaction;Structure;Antioxidant activity

作者簡介 謝作樺（1983—），男，江西新干人，工程師，從事食品、保健食品和中藥新產(chǎn)品研究。

收稿日期 2021-05-18;修回日期 2021-06-29

在體液中人血清蛋白可以運(yùn)輸脂肪酸、膽色素、氨基酸、類固醇激素、金屬離子和許多治療分子等，同時(shí)是維持血液正常滲透壓的重要物質(zhì)[1-4]。人血清蛋白的改變將影響機(jī)體的正常代謝。糖基化反應(yīng)是機(jī)體中容易發(fā)生的一種蛋白修飾反應(yīng)，它將引起人血清蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變從而影響其功能性質(zhì)擾亂機(jī)體中各種物質(zhì)的運(yùn)輸。

首烏提取物是蓼科植物何首烏的干燥塊根，主要功能成分是卵磷脂、大黃素、大黃酸和其他成分，具有抗衰老、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、降血脂及抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用[5]。首烏提取物中的單體成分可以激活酪氨酸酶，起到防止白發(fā)脫發(fā)的目的，另外，其中含有大量的大黃素、二苯乙烯苷等抗氧化成分，可以保護(hù)細(xì)胞免于氧化損傷，從而起到保護(hù)黑素細(xì)胞的作用。為了進(jìn)一步探索首烏提取物的功效和活性，筆者以抑制人血清蛋白糖基化程度為主要目的，選擇不同濃度的首烏提取物混入人血清蛋白-葡萄糖反應(yīng)體系中得到不同的糖基化產(chǎn)物，并進(jìn)一步探討首烏提取物對人血清蛋白糖基化反應(yīng)的抑制機(jī)制，為首烏提取物在人類醫(yī)藥健康領(lǐng)域的開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試材 首烏提取物為首烏在乙酸乙酯條件下提取2 h后的提取物;人血清蛋白購于美國Sigma;葡萄糖、半乳糖和果糖購于上海阿拉丁試劑有限公司;鄰苯二甲醛、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2 ，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）、鄰苯三酚和菲洛嗪購于美國Sigma。

1.2 儀器 電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海恒科學(xué)儀器有限公司）;Leader-A1型超純水儀（上海領(lǐng)德儀器有限公司）;冷凍干燥機(jī)（北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司）;Synergy H1型酶標(biāo)分析儀（美國Bio Tek公司）;F-7000型熒光光譜儀（日本日立公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 人血清糖基化產(chǎn)物的制備。

糖基化反應(yīng)參照Yang等[6]的方法并略微改動(dòng)。用PBS緩沖液（pH 7.4，10 mmol/L）將人血清蛋白配制成10 mg/mL的溶液，并加入質(zhì)量比為1∶1的葡萄糖混勻，然后分別加入0、10、20、40、80、160 μg/mL的首烏提取物混勻，凍干48 h后將樣品置于37 ℃烘箱中反應(yīng)2 d。反應(yīng)結(jié)束后，經(jīng)透析除去多余的糖和首烏提取物，而后凍干得到人血清糖基化產(chǎn)物，以未處理人血清蛋白（HSA）樣品以及未加首烏提取物的人血清蛋白和葡萄糖（HSA+G）混合物為參照。

1.3.2 自由氨基測定。參照Nielsen等[7]的方法并略微修改。分別稱取9.525 g硼砂（Na2B4O7·10H2O，十水合四硼酸二鈉）和0.25 g十二烷基硫酸鈉（SDS）于一小燒杯中，并用150 mL蒸餾水使其完全溶解;再分別稱取200 mg 鄰苯二甲醛（OPA）和0.264 g二硫蘇糖醇（DTT，99%）溶于5.0 mL乙醇（95%）;最后用蒸餾水定容到250 mL（棕色容量瓶避光），且OPA溶液在2 h之內(nèi)使用。取200 μL樣品溶液（1 mg/mL），加入配制好的OPA溶液4 mL，室溫下避光靜置反應(yīng)2 min，于340 nm處測定吸光度。向濃度梯度為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL的賴氨酸溶液中分別加4 mL的OPA溶液，以濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各糖基化產(chǎn)物中自由氨基含量。

1.3.3 內(nèi)源熒光測定。

用超純水將糖基化產(chǎn)物溶解至質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL，對樣品進(jìn)行內(nèi)源熒光分析。內(nèi)源熒光測定條件：激發(fā)波長為280 nm，發(fā)射波長為300～450 nm，激發(fā)和發(fā)射的狹縫寬度均為5 nm，掃描速度為1 200 nm/min。

1.3.4 表面疏水性測定。

測定方法參照Xiang等[8]并略微修改。采用8-苯胺基-1-萘磺酸鈉（ANS）作為熒光探針，測定各人血清蛋白糖基化產(chǎn)物的表面疏水性。首先將人血清蛋白糖基化產(chǎn)物稀釋為0.05、0.10、0.20、0.40、0.80 mg/mL，然后分別取6 mL稀釋的樣品與40 μL ANS溶液（8 mmol/L）混合，測定其熒光強(qiáng)度。測定條件設(shè)置為：發(fā)射波長為400～600 nm，激發(fā)波長為390 nm，發(fā)射和激發(fā)的狹縫寬度均為2.5 nm，掃描速度為1 200 nm/min，電壓為400 V。以人血清蛋白樣品質(zhì)量濃度 （mg/mL） 為橫坐標(biāo)、熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)繪圖，對曲線采用線性回歸分析進(jìn)行擬合，通過計(jì)算得到曲線斜率，即為各人血清蛋白糖基化產(chǎn)物的表面疏水性。

1.3.5 ABTS+·清除能力測定。

參照Hwang等[9]的方法，測定人血清蛋白糖基化產(chǎn)物的ABTS+·清除能力。將ABTS+·溶解于70%乙醇溶液中并稀釋至其在734 nm時(shí)的吸光度為0.7左右備用。取100 μL 樣品與3.9 mL的ABTS+·溶液混勻，常溫下反應(yīng)10 min，于734 nm處測定其吸光度。各人血清蛋白糖基化產(chǎn)物的ABTS+·清除能力計(jì)算公式如下：

清除率=A0-AsA0×100%（1）

式中，A0為超純水替代樣品測定的吸光度，As為各人血清蛋白糖基化產(chǎn)物與ABTS+·溶液反應(yīng)后的吸光度。

1.3.6 DPPH·清除能力測定。

根據(jù)胡月明[10]的方法測定人血清蛋白糖基化產(chǎn)物的DPPH·清除能力。以70%的乙醇溶液配制濃度為0.25 mmol/L的DPPH·溶液，取100 μL稀釋的樣品溶液與100 μL DPPH·溶液于酶標(biāo)板（96孔）上混勻，室溫下避光反應(yīng)30 min，于517 nm處測定吸光度。各人血清蛋白糖基化產(chǎn)物的DPPH·清除率計(jì)算公式如下：

清除率=A0-AsA0×100%（2）

式中，As為100 μL糖基化樣品與100 μL DPPH·溶液混合測得的吸光度，A0為100 μL樣品與100 μL 70%的乙醇混合后的吸光度。

1.3.7 超氧陰離子自由基清除能力測定。

向稀釋的各人血清蛋白糖基化產(chǎn)物溶液中加入40 μL鄰苯三酚（25 mmol/L），混勻后室溫下反應(yīng)3 min，快速加入50 μL二硫蘇糖醇溶液（50 mg/mL），混勻后室溫反應(yīng)15 min，于325 nm處測定吸光度[10]。各人血清蛋白糖基化產(chǎn)物超氧陰離子自由基清除能力計(jì)算公式如下：

清除率=A0-AsA0×100%（3）

式中，A0為超純水代替樣品測定的吸光度，As為加入樣品測定的吸光度。

1.3.8 還原力測定。按1∶1∶2的比例混合適當(dāng)濃度的各人血清蛋白糖基化產(chǎn)物、FeCl2 （2 mmol/L）和菲洛嗪溶液（5 mmol/L），常溫下反應(yīng)10 min后于562 nm處測定其吸光度。各人血清蛋白糖基化產(chǎn)物的還原力計(jì)算公式如下：

還原力=A0-AsA0×100%（4）

式中，As為加入樣品測定的吸光度，A0為PBS溶液代替樣品測定的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 自由氨基含量

糖基化反應(yīng)實(shí)質(zhì)是蛋白質(zhì)分子上的氨基與還原糖中羰基的結(jié)合[11]。因此，通過蛋白質(zhì)分子中自由氨基含量的變化可以判斷糖基化反應(yīng)程度。由圖1可知，隨著首烏提取物濃度的增大，人血清蛋白中自由氨基也逐漸增多。這表明首烏提取物能夠抑制葡萄糖與人血清蛋白中自由氨基的反應(yīng)。

2.2 內(nèi)源熒光分析

芳香族氨基酸尤其是色氨酸是引起蛋白質(zhì)發(fā)內(nèi)源熒光的原因，而蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變會(huì)引起色氨酸的暴露或者隱藏，從而影響蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光強(qiáng)弱[12]。當(dāng)人血清蛋白與葡萄糖發(fā)生糖基化反應(yīng)時(shí)，其空間結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生改變，從而引起內(nèi)源熒光改變[13]。通過對其內(nèi)源熒光的分析可以推測其構(gòu)象變化。由圖2可知，未加入任何試劑的人血清蛋白其熒光強(qiáng)度最高，加入葡萄糖后，其熒光強(qiáng)度明顯降低，但是隨著首烏提取物濃度的增大，其熒光強(qiáng)度逐漸增大。這說明葡萄糖與人血清蛋白發(fā)生糖基化反應(yīng)后，可能由于空間位阻或者能量再吸收使得人血清蛋白的熒光強(qiáng)度降低，但是當(dāng)首烏提取物加入反應(yīng)體系后，能夠有效地抑制糖基化反應(yīng)，從而維持人血清蛋白的空間構(gòu)象，使其熒光強(qiáng)度降低較小。

2.3 表面疏水性分析

表面疏水性主要用于評價(jià)蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)在其三級結(jié)構(gòu)的分布情況[14-15]。從圖3可以看出，經(jīng)過糖基化處理后，人血清蛋白的表面疏水性增大明顯，這表明葡萄糖的接入使得人血清蛋白的內(nèi)部疏水區(qū)域展開，導(dǎo)致疏水基團(tuán)的暴露而使表面疏水性增大。而首烏提取物的加入使其表面疏水性逐漸降低，且首烏提取物濃度越大，表面疏水性越低，這更加進(jìn)一步證明首烏提取物對維持人血清蛋白的空間構(gòu)象具有積極作用。

2.4 ABTS+·清除能力

ABTS可被K2S2O8氧化成藍(lán)色自由基ABTS+，當(dāng)存在抗氧化劑時(shí)，ABTS+·能被還原成沒有顏色的ABTS[16]。因此可以根據(jù)顏色的深淺判斷樣品的抗氧化能力。由圖4可知，糖基化后的人血清蛋白其ABTS+·清除率大大增加，這是因?yàn)樘腔磻?yīng)會(huì)產(chǎn)生許多抗氧化物質(zhì)。隨著首烏提取物濃度的不斷加大，糖基化人血清蛋白的ABTS+·清除能力在不斷降低，這表明產(chǎn)生的糖基化抗氧化物質(zhì)的減少，也說明首烏提取物的抗氧化性不明顯。

2.5 DPPH·清除能力

DPPH·是一種在517 nm處具有強(qiáng)吸收的穩(wěn)定的單電子自由基。當(dāng)DPPH·被清除后顏色會(huì)從深紫色變?yōu)辄S色或無色[17]。由圖5可知，糖基化后的人血清蛋白其DPPH·清除率大大增加，這是因?yàn)樘腔磻?yīng)會(huì)產(chǎn)生許多抗氧化物質(zhì)。隨著首烏提取物濃度的不斷加大，糖基化人血清蛋白的DPPH·清除率在不斷降低，這表明產(chǎn)生的糖基化抗氧化物質(zhì)的減少。這與ABTS+·清除能力的結(jié)果一致。

2.6 超氧陰離子自由基清除能力

體內(nèi)的超氧陰離子自由基容易引起體內(nèi)脂質(zhì)的氧化[18]，加快從皮膚到器官的衰老進(jìn)程，嚴(yán)重可能引起皮膚病變和癌癥等[19]。因此，研究超氧陰離子自由基的清除能力對研究機(jī)體抗衰老具有重要意義。由圖6可知，糖基化后的人血清蛋白其超氧陰離子自由基清除率大大增加。隨著首烏提取物濃度的不斷加大，糖基化人血清蛋白的超氧陰離子自由基清除率在不斷降低，這表明產(chǎn)生的糖基化抗氧化物質(zhì)的減少。這與ABTS+·清除能力和DPPH·清除能力的結(jié)果一致。

2.7 還原力 從圖7可以看出，

還原力的結(jié)果趨勢與ABTS+·、DPPH·和超氧陰離子自由基的清除能力一致，但是還原力相對較高。這并不是因?yàn)槭诪跆崛∥飳μ腔磻?yīng)的抑制效果差，可能是因?yàn)槭诪跆崛∥镆簿哂幸欢ǖ倪€原能力[20]。

3 結(jié)論

糖基化反應(yīng)是發(fā)生在人體內(nèi)的常見反應(yīng)，是引起組織器官衰老的主要原因之一，該研究結(jié)果表明，不同濃度的首烏提取物與人血清蛋白和葡萄糖同時(shí)反應(yīng)后，其自由氨基含量增多、內(nèi)源熒光增強(qiáng)，表面疏水性降低，抗氧化能力也有所降低，且隨著首烏提取物濃度的增大，其對人血清蛋白糖基化的抑制效果越明顯。這將為首烏提取物在抑制人機(jī)體糖基化反應(yīng)方面提供重要的研究基礎(chǔ)。

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