童優(yōu)蕓 王小寶 王曉燕 丁文慧

摘要 [目的]通過優(yōu)化高效液相色譜條件和前處理步驟，建立高效液相色譜法同時測定液體食品中檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、亮藍、誘惑紅6種人工合成色素，以此提高合成色素的檢測效率。[方法]試驗優(yōu)化了前處理方法，液體食品基質(zhì)比較干凈時采用直接水提進樣法，基質(zhì)比較復(fù)雜時采用固相萃取凈化法;優(yōu)化了梯度洗脫程序和波長程序等儀器條件。[結(jié)果]6種人工合成色素濃度在5～50 μg/mL 線性關(guān)系良好（R2>0.999）;檸檬黃、莧菜紅、日落黃、胭脂紅、誘惑紅的檢出限為0.031 25 mg/kg，亮藍的檢出限為0.125 00 mg/kg，樣品添加標準物質(zhì)后平均回收率在89.0%～100.3%，相對標準偏差（RSD）在1.56%～3.12%。[結(jié)論]該研究可為實驗室日常的人工合成色素檢測提供參考。

關(guān)鍵詞 高效液相色譜;食品;人工合成色素;儀器條件;前處理;方法優(yōu)化

中圖分類號 TS 207文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2022）04-0190-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.04.049

開放科學（資源服務(wù)）標識碼（OSID）：

Simultaneous Detection of Six Synthetic Pigments in Liquid Food by High Performance Liquid Chromatography

TONG You-yun1，WANG Xiao-bao2，WANG Xiao-yan1 et al

（1.Sion Inspection Service Co.， Ltd.， Ningbo， Zhejiang 315000;2.Ningbo Academy of Product and Food Quality Inspection （Ningbo Fibre Inspection Institute），Ningbo，Zhejiang 315000）

Abstract [Objective] By optimizing the conditions and pretreatment steps of high performance liquid chromatography， a high performance liquid chromatography method was established for the simultaneous determination of 6 synthetic pigments of lemon yellow， amaranth， carmine， sunset yellow， brilliant blue， and allure red in liquid food， so as to improve the detection efficiency of synthetic pigments.[Method] The experiment optimized the pretreatment method. The direct water extraction method was used when the liquid food matrix was relatively clean， and the solid phase extraction purification method was used when the matrix was more complicated;the instrument conditions such as gradient elution procedure and wavelength procedure were optimized.[Result] The concentration of 6 kinds of synthetic pigments has a good linear relationship between 5-50 μg/mL （R2>0.999）.The detection limit of lemon yellow， amaranth， sunset yellow， carmine and allure red was 0.031 25 mg/kg， and the detection limit of brilliant blue was 0.125 00 mg/kg. The average recovery rate of samples after adding standard substances was 89.0%-100.3%，the relative standard deviation （RSD） was 1.56%-3.12%.[Conclusion] This study can provide reference for the daily synthetic pigment detection in laboratories.

Key words High performance liquid chromatography （HPLC）;Food;Synthetic pigments;Instrument conditions;Pretreatment;Method optimization

作者簡介 童優(yōu)蕓（1987—），女，浙江寧波人，工程師，從事食品質(zhì)量檢測工作。

收稿日期 2021-06-22;修回日期 2021-07-15

食用人工合成色素是通過人為化學合成的一類有機物質(zhì)，由于其本身艷麗的色彩，可作為食品加工過程中的著色劑，不僅使食品具有賞心悅目的色彩，更能增加商品的價值，吸引消費者的眼光。但是，人工合成色素其本身或者次生的產(chǎn)物對人體產(chǎn)生一定的毒性，另外一些不法商販超標、超范圍使用人工合成色素的現(xiàn)象屢禁不止，長期過多地攝入人工合成色素會使人們的健康受到威脅[1-3] 。所以，加強食品安全的監(jiān)管，提高檢測技術(shù)，開發(fā)一種快速、便捷、準確的檢測方法勢在必行。目前，檢測人工合成色素的國家標準方法主要有GB/T 5009.35—2016《食品中合成著色劑的測定》、GB/T 5009.141—2016《食品中誘惑紅的測定》、GB/T 9695.6—2008《肉制品 胭脂紅著色劑測定》、GB/T 21916—2008《水果罐頭中合成著色劑的測定 高效液相色譜法》、SNT 1743—2006《食品中的誘惑紅、酸性紅、亮藍、日落黃的含量檢測 高效液相色譜法》，所用分析手段有高效液相色譜法[4-6]、電泳法[7-8]、分光光度法[9]等，主要以高效液相色譜法為主，以上方法對食品中人工合成色素測定應(yīng)用或參考具有一定的價值，但同時存在一些問題，如部分標準適合單個合成色素或單種食品基質(zhì)測定;采用聚酰胺吸附法過程煩瑣、耗時;色譜條件不合理導(dǎo)致目標峰分離度差;紙層析色譜法回收率低、檢出限高、精密度差等[10]。該試驗擬在國家標準的基礎(chǔ)上，開發(fā)一種更為簡單有效的樣品前處理方法，并建立一種能同時檢測多種人工合成色素的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試樣品為市售液體食品。日落黃標準溶液、檸檬黃標準溶液、胭脂紅標準溶液、莧菜紅標準溶液、亮藍標準溶液、誘惑紅標準溶液，濃度均為0.500 mg/mL，中國計量科學研究院;甲醇，色譜純，默克;甲酸，色譜純，美國MREDA;乙醇、氨水、乙酸銨，優(yōu)級純，國藥集團化學試劑有限公司;試驗用水均為超純水（一級）。聚酰胺小柱，1 g/6 mL，博納艾杰爾有限公司;HLB萃取柱，6cc（200 mg），Waters公司;色譜柱，XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），美國安捷倫公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀，Agilent 1200，美國安捷倫公司;超聲波，SK8200HP，KUDOS;純水機，UPWS-1-10T，杭州永潔達凈化科技有限公司;離心機，F(xiàn)isher x1r，Thermo;固相萃取裝置，ASE-12，天津奧特賽恩斯儀器有限公司;氮吹儀，N-EVAP112，OA-SYS;電子天平，BS 224S，Sartorius;紫外分光光度計，Lambda 25，PrekinElmer。

1.3 儀器工作條件

色譜柱為美國安捷倫XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）;進樣量20 μL;柱溫30 ℃;流速1 mL/min;流動相為甲醇-乙酸銨0.02 mol/L[11];流動相pH 6～7。波長程序：0～9.5 min，檢測波長254 nm;9.5～16.0 min，檢測波長409 nm。流動相梯度洗脫程序見表1。

1.4 試驗方法

1.4.1

基質(zhì)干凈的液體樣品前處理法。稱取20～40 g（精確至0.001 g）樣品，調(diào)pH至6左右，定容至10 mL，用超聲波振蕩10 min，5 000 r/min離心10 min，過0.45 μm 水相濾膜，收集至樣品瓶，上機。

1.4.2

基質(zhì)復(fù)雜的液體樣品前處理法。

1.4.2.1 提取。①飲料：稱取20～40 g（精確至0.001 g）樣品放入100 mL燒杯中，含二氧化碳樣品加熱去除二氧化碳，調(diào)pH至6左右備用。

②酒類：稱取20～40 g（精確至0.001 g）樣品放入100 mL燒杯中，加熱去除乙醇，調(diào)pH至6左右備用[12]。

③醬汁類：稱取20～40 g（精確至0.001 g）樣品放入50 mL離心管中，加入20 mL 石油醚，漩渦混勻1 min，5 000 r/min離心5 min，棄去石油醚上清液，加入10 mL 1%氨水溶液，漩渦1 min，4 000 r/min 離心5 min，重復(fù)提取至提取液無色，合并上清液，調(diào)pH至6左右備用。

1.4.2.2

凈化。先用6 mL甲醇、6 mL水（pH=6～7）活化聚酰胺小柱（1 g/6 mL），加入樣液，用6 mL水（pH=4）、6 mL甲醇∶甲酸（6∶4）、6 mL水（pH=6～7）淋洗，通入空氣吹干小柱，用6 mL 2%的氨化甲醇洗脫，洗脫液于50 ℃氮氣吹干，用水定容至5 mL，過0.45 μm水相濾膜，收集至樣品瓶，上機。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 檢測波長的選擇。用紫外分光光度計對檸檬黃、日落黃、亮藍、胭脂紅、莧菜紅、誘惑紅進行200～600 nm波長掃描，通過分析物質(zhì)的特征波長，得到各物質(zhì)的最大吸收波長分別為檸檬黃260 nm、日落黃230 nm、莧菜紅230 nm、胭脂紅220 nm、亮藍410 nm、誘惑紅220 nm。除亮藍外的5種人工合成色素在250 nm下均有較好的紫外吸收，且出峰時間比亮藍早，所以在0～9.5 min紫外吸收波長設(shè)置為254 nm，而亮藍在410 nm下有較好的紫外吸收，其出峰時間在10 min左右，所以9.5 min后紫外吸收波長設(shè)置為409 nm。6種人工合成色素可在波長程序下有較好的響應(yīng)值。

2.1.2

梯度洗脫程序的選擇。GB/T 5009.35—2016《食品中合成著色劑的測定》中采用的洗脫條件，得到的色譜圖中各個目標峰基本能分開，且峰形良好。但是檸檬黃和莧菜紅這2個物質(zhì)出峰時間比較接近，容易被雜質(zhì)峰覆蓋，進而影響定性和定量。該試驗依據(jù)國標洗脫條件，并參考其他相關(guān)文獻，對甲醇和乙酸銨2個流動相的比例進行調(diào)整，發(fā)現(xiàn)適當拓寬甲醇的比例范圍能使各個目標峰具有更好的分離度，而且能使檸檬黃和莧菜紅的出峰時間延長，有效地與雜質(zhì)峰進行分離。優(yōu)化條件后圖譜和國標方法比較見圖1。

2.1.3 色譜柱的選擇。色譜柱是分離的核心，選擇色譜柱的要求是柱效高、選擇性好、分析速度快等。市售的用于HPLC的各種微粒填料如多孔硅膠以及以硅膠為基質(zhì)的鍵合相、氧化鋁、有機聚合物微球（包括離子交換樹脂）、多孔碳等，其粒度一般為3、5、7、10 μm等。C18和C8色譜柱的應(yīng)用較為廣泛，都屬于反相色譜柱。C8適合分析大分子類的物質(zhì)，其對同一個物質(zhì)的保留能力比C18柱弱，保留時間比C18柱早，一些物質(zhì)出峰過于靠前時使用C8柱很難實現(xiàn)分離。C18柱對中等極性化合物保留最強，主要應(yīng)用于羧基、脂肪酸、苯胺、甘油酯等物質(zhì)的測定，對分子量較小的物質(zhì)有較好的分離效果。因此，考慮合成色素的保留時間和分離度，選用C18柱作為此次試驗的色譜分析柱。

2.1.4

流動相pH的選擇。在其他條件固定的情況下（因為考慮到出峰時間的不一致，所以未采用波長程序），試驗用檸檬酸和氨水調(diào)節(jié)乙酸銨的pH，分別比較了pH為4、6、8時的圖譜情況。結(jié)果表明（圖2），當pH為4和8時，均出現(xiàn)基線漂移、定量不準的現(xiàn)象;當pH為6時，色譜圖出峰良好，且呈現(xiàn)較好的分離度。因此，選擇流動相pH為6。

2.1.5

流速的選擇。在其他條件固定的情況下（因為考慮到出峰時間的不一致，所以未采用波長程序），試驗將流速依次設(shè)置為1.0、0.8、0.6 mL/min，得到的色譜圖（圖3）顯示，流速減少，各個色素峰出峰時間相應(yīng)延后，分離度變差。且12～14 min容易被雜質(zhì)峰影響，因此，綜合考慮保留時間、分離度等因素，最終確定流速為1.0 mL/min。

2.1.6

柱溫的選擇。在其他條件固定的情況下，試驗將柱溫設(shè)定為20、30、40 ℃，得到的色譜如圖4所示。結(jié)果表明柱壓隨著柱溫的降低而升高，在柱溫設(shè)置為20 ℃時，柱壓最高達18 000 kPa，長期使用會對色譜柱的壽命產(chǎn)生一定的影響。溫度升高，各個組分的保留時間相應(yīng)縮短，分離度變小，所以，綜合考慮保留時間、柱壓、分離度等因素，最終確定柱溫為30 ℃。

2.2 標準曲線、線性相關(guān)和檢出限

準確吸取2 mL檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、亮藍、日落黃標準溶液和1 mL誘惑紅標準溶液于10 mL容量瓶中，用水定容至刻度，配成100 μg/mL的混合標準儲備液。再分別稀釋為5、10、15、20、25、50 μg/mL。在最佳色譜條件下從低濃度到高濃度測定各個組分的峰面積，以峰面積（Y）對濃度（X）進行線性擬合，得到6種人工合成色素的線性方程、決定系數(shù)，由表2可見，6種人工合成色素濃度在5～50 μg/mL時線性關(guān)系良好（R2>0.999）;根據(jù)3倍信噪比（S/N）計算出各組分檢出限，檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃和誘惑紅的檢出限為0.031 25 mg/kg，亮藍的檢出限為0.125 00 mg/kg。

2.3 樣品前處理方法的優(yōu)化

樣品前處理步驟會影響到結(jié)果的回收率、精密度，圖譜的分離效果以及目標物的定性和定量。該試驗針對不同基質(zhì)的液體食品，采用2種前處理方法，并對這2種方法進行優(yōu)化，得到較為適宜的前處理條件。

（1）直接水提法的條件選擇。適合基質(zhì)較為干凈的液體食品。該試驗以添加有檸檬黃的市售水晶葡萄汁為例，水晶葡萄汁本身不含檸檬黃，添加量為100、200、400 μg，定容后濃度分別為10、20、40 μg/mL，檢測濃度均在標準曲線范圍內(nèi)，每組添加量做3次平行試驗。前處理過程中超聲混勻時間、超聲功率和離心時間均有可能影響試驗結(jié)果，最后步驟中的過水系濾膜，其材料會不同程度吸附合成色素，影響圖譜結(jié)果。所以，試驗以超聲時間、超聲功率、離心時間、水相過濾膜材料類型為因素，在其他條件固定的情況下，以樣品中添加檸檬黃標準品的回收率為觀測結(jié)果，分析比較各個因素下的最優(yōu)條件。

結(jié)果表明，隨著超聲提取時間的增加，回收率隨之增大，超聲時間10～25 min所得到的回收率相近，考慮前處理過程的效率性，選定超聲時間為10 min;超聲功率在30 kHz時，回收率趨于最佳，此后增加超聲功率對回收率影響較小，因此選定超聲功率為30 kHz;隨著離心提取時間的增加，回收效果隨之變好，在離心提取時間為10 min時，回收率最高，隨后離心提取時間增加，回收率趨于平緩，因此選定離心提取時間為10 min。

水系過濾膜是利用微濾技術(shù)去除合成色素提取液中不溶性成分和相對分子質(zhì)量大于幾十萬的雜質(zhì)，如淀粉、纖維素、植物膠、大分子蛋白質(zhì)等。濾膜材料主要有纖維素類、聚酰胺類、聚醚砜類、聚偏二氟乙烯、聚四氟乙烯、聚丙烯等。試驗比較了尼龍-66、CA（纖維素）、PES（聚醚砜）、PVDF（聚偏二氟乙烯）、PTFE（聚四氟乙烯）這5種過濾膜對合成色素的吸附作用，結(jié)果表明，尼龍-66的吸附作用最強，PTFE的吸附作用最弱，因此選用PTFE過濾，這與路勇等[13]的報道一致。

（2）固相萃取法的條件選擇。適合基質(zhì)較為復(fù)雜的液體食品，通過吸附作用，能有效地分離目標物質(zhì)和雜質(zhì)。該試驗分別以市售的芒果汁、楊梅酒、醬汁為樣品，用市售的2種規(guī)格型號固相萃取小柱來進行凈化，以回收率和圖譜情況為判斷依據(jù)，來分析得到固相萃取法比較適宜的條件。第1種萃取柱為聚酰胺萃取柱，其填料為聚酰胺粉末（100～200目，1 g/6 mL）;第2種為HLB萃取柱，其填料為親脂性二乙烯苯和親水性N-乙烯基吡咯烷酮單體按一定比例組成的大孔共聚物（6cc，200 mg），保留機理為反相。試驗結(jié)果表明，2種固相萃取柱對凈化基質(zhì)都有明顯的效果，芒果汁添加6種人工合成色素后使用聚酰胺和HLB萃取柱的回收率分別為89.2%～97.6%和91.0%～98.9%，楊梅酒的回收率分別為93.5%～95.8%和89.6%～96.9%，醬汁的回收率分別為90.7%～99.6%和92.5%～102.3%，均符合試驗要求。在價格方面，聚酰胺萃取小柱具有明顯的優(yōu)勢，因此綜合考慮檢測成本，選用聚酰胺萃取小柱來凈化樣液。

3 結(jié)論

該研究結(jié)合GB/T 5009.35—2016《食品中合成著色劑的測定》和GB/T 5009.141—2016《食品中誘惑紅的測定》，建立高效液相色譜法同時測定液體食品中檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍這6種人工合成色素，并對樣品前處理方法和高效液相的儀器條件進行優(yōu)化。最終確定的儀器條件：色譜柱為美國安捷倫XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）;進樣量20 μL;柱溫30 ℃;流速1 mL/min;流動相為甲醇-乙酸銨0.02 mol/L;流動相pH為6～7。梯度洗脫程序：0～4.65 min，甲醇10%～30%;4.65～8.00 min，甲醇30%～80%;8～12 min，甲醇80%～10%;12～16 min，甲醇10%。波長程序：0～9.5 min，檢測波長254 nm;9.5～16.0 min，檢測波長409 nm。樣品前處理方法：①基質(zhì)簡單樣品采用直接水提進樣法測定;②基質(zhì)復(fù)雜樣品采用聚酰胺固相萃取小柱凈化法測定。結(jié)果表明，6種人工合成色素濃度在5～50 μg/mL線性關(guān)系良好（R2>0.999），檸檬黃、莧菜紅、日落黃、胭脂紅、誘惑紅的檢出限為0.031 25 mg/kg，亮藍的檢出限為0.125 00 mg/kg，檢出限均低于國家標準。

優(yōu)化的方法與國家標準方法比較，從以下幾個方面來分析：①優(yōu)化后降低了方法檢出限，GB/T 5009.35—2016《食品中合成著色劑的測定》中檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃均為0.5 mg/kg，亮藍為0.2 mg/kg[14];GB/T 5009.141—2016《食品中誘惑紅的測定》中誘惑紅檢出限為25 mg/kg[15];SNT 1743—2006《食品中的誘惑紅、酸性紅、亮藍、日落黃的含量檢測 高效液相色譜法》中日落黃、誘惑紅測定低限為2.5 mg/kg，亮藍為5.0 mg/kg[16]。優(yōu)化方法后，檸檬黃、莧菜紅、日落黃、胭脂紅、誘惑紅的檢出限為0.031 25 mg/kg，亮藍的檢出限為0.125 00 mg/kg，均低于國家標準水平，說明優(yōu)化后色譜條件和前處理方法提高了方法的靈敏度。②優(yōu)化方法后所得到的檢測數(shù)據(jù)準確可靠，所得到的圖譜基線噪聲低，分離度好，出峰時間和雜質(zhì)峰分離，定性和定量更加準確。6種人工合成色素線性關(guān)系、決定系數(shù)以及樣品加標平均回收率、相對標準偏差均滿足試驗要求。③優(yōu)化后提高了試驗效率，國標的前處理方法耗時、耗力、耗試劑，一般處理一個樣品需花費30 min;優(yōu)化后的前處理過程省時快捷，且試劑使用量少，不僅提高工作效率，還減少了對身體健康的危害。④優(yōu)化后的方法能同時測定6種人工合成色素，相比較國標方法，更適合檢測機構(gòu)樣品量大、項目繁雜的情況。

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