崔清洋，王夢斌，曹銀利，唐成和

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 兒科，河南 衛(wèi)輝 453100)

原發(fā)性免疫缺陷病(primary immunodeficiency diseases, PIDs)為一類和遺傳緊密關聯(lián)的異質性疾病， 患兒易患反復感染、腫瘤、過敏或自身免疫性疾病等。最新版的PIDs分類已在2020年1月17日由國際免疫學會聯(lián)合會專家委員會發(fā)表，分為10大類，包括430種PIDs。其中同時影響細胞和體液免疫缺陷的第2亞類T-B-NK+SCID的原RAG1缺陷和RAG2 缺陷現(xiàn)在統(tǒng)稱為RAG缺陷。

重癥聯(lián)合免疫缺陷病(severe combined immunodeficiency, SCID)是一類細胞免疫的缺陷、同時累及體液免疫的PID，SCID發(fā)生率約為1/100 000活產新生兒[1]，而一項使用美國11個州的新生兒SCID篩查數(shù)據的研究發(fā)現(xiàn)，SCID發(fā)病率為1/58 000活產新生兒，包括典型SCID、泄漏型SCID和Omenn綜合征[2]。此疾病一般具有明確的致病機制及干預治療靶點，其遺傳方式為常染色體隱性遺傳，其中IL2RG基因變異所致 X 連鎖聯(lián)合免疫缺陷(X-linked severe combined immunodeficiency, SCID -XL)占 50%～60%(其中共用受體 γ 鏈基因缺陷是導致 SCID -XL最主要的形式，約占所有 SCID50%)，重組激活基因(recombinase activating gene，RAG)變異(包括RAG1和RAG2)所致的聯(lián)合免疫缺陷病占10%。SCID發(fā)病所涉及的基因有ADA、AK2、LIG4、NHEJ1、PRKDC、DCLRE1CRAG2、RAG1、CORO1A、LAT、CD247、CD3E、CD3D、PTPRC、IL7R、IL2RA、JAK3及IL2RG(其中IL2RG基因變異為X連鎖，其余為常染色體隱性遺傳)。

大部分SCID患兒出生時無明顯異常，但隨胎傳抗體的消耗，患兒很容易在出生的第3～6月齡發(fā)生嚴重的反復感染，包括遷延性腹瀉、口腔念珠菌感染、嚴重中耳炎、間質性肺炎及條件致病微生物如肺孢子蟲和巨細胞病毒等感染，絕大部分患兒伴有生長發(fā)育遲緩[3]。若不及時糾正免疫缺陷，大部分患者在2歲以內因重癥感染而死亡[4]，為兒科醫(yī)生必須面對的臨床急癥。

SCID通?；谌毕莸牧馨图毎麃喨哼M行分類，可分為以下4類：T-B+NK+、T-B+NK-、T-B-NK+、T-B-NK-等，其中85%～90%的SCID患兒伴有已知的分子缺陷[5-6]。與T-B-NK+免疫表型有關的基因有DCLRE1C，LIG4，NHEJ1，PRKDC，XRCC4，RAG1，RAG2等，而T-B-NK+SCID約占SCID所有病例的25%。

本文回顧性分析1例嬰兒SCID患兒的臨床資料及基因檢測結果，且RAG1基因的c.2428A>G雜合錯義變異為國際首次報道及c.1229G>A雜合錯義變異為國內首次報道，以期加強對本病的認識。

1 臨床資料

女性患兒，1個月6天，因發(fā)現(xiàn)體質量不增半月余于2020年1月26日入院。半月余前發(fā)現(xiàn)患兒體質量不增，進乳可，大便4～5次/d，呈黃色糊狀。G1P1，胎齡42周時因“胎兒宮內窘迫”剖宮產出生，出生體質量3 500 g，出生時有重度窒息史，羊水Ⅲ度污染，但無產傷史。出生1小時后因呼吸困難轉入我院新生兒科，入院時血常規(guī)(2020-01-26)未見異常，見表1。予抗感染、營養(yǎng)腦細胞、靜脈營養(yǎng)及合理喂養(yǎng)等治療15天后好轉出院。父母體健，非近親結婚。入院體格檢查：體質量3 500 g，一般情況尚可，發(fā)育不良，營養(yǎng)不良，體型偏瘦，心肺腹未見異常，四肢肌張力增高，四肢肌力正常。?？茩z查：語言及智能評估：會哭；仰臥位：頭可居于中線，追視追聽欠佳，雙手不可居于中線位活動，雙下肢屈曲，非對稱型緊張性頸反射(ATNR)姿勢存在；俯臥位：被動肘支撐，不可瞬間抬頭；坐位：全前傾坐位；立位：踏步反射存在，雙下肢可支撐體質量；手抓位：拇指內收；肌張力：四肢肌張力增高；關節(jié)活動度：股角60度，腘窩角120度，足背屈角30度，圍巾征不過中線，跟耳征陰性。入院診斷：蛋白質-能量營養(yǎng)不良。輔助檢查：甲狀腺功能三項未見異常；血常規(guī)(2020-03-05)示粒細胞缺乏，見表1；大便常規(guī)潛血陽性；入院第2天患兒出現(xiàn)發(fā)熱，超敏C反應蛋白(hs-CRP)22.31 mg/L；胸片示支氣管肺炎；復查hs-CRP 43.05 mg/L，白細胞介素6(IL-6)48.67 pg/ml，降鈣素原(PCT)0.90 ng/ml，連續(xù)復查2次血常規(guī)(2020-03-06和2020-03-09)均提示粒細胞缺乏或減少，見表1。予康復、先后予頭孢替安及頭孢他啶抗感染及降溫對癥治療后患兒仍反復發(fā)熱，升級抗生素為美羅培南加強抗感染后發(fā)熱緩解，奶量可，但監(jiān)測體質量有下降趨勢，復查hs-CRP仍無明顯下降，予丙種球蛋白(IVIG)增強機體免疫力，因不排除血液系統(tǒng)惡性疾病，進一步檢查：自身抗體14項陰性，人微小病毒B19-DNA、EBV-DNA及人巨細胞病毒DNA均陰性。血培養(yǎng)及骨髓培養(yǎng)均陰性；網織紅細胞絕對計數(shù)76.81×109/L，網織紅細胞百分比0.03；骨髓穿刺結果示：①骨髓有核細胞增生活躍，粒系占66%，紅系占22%，粒:紅=3.0；②粒系增生活躍，比值增高，部分細胞胞體脹大，漿內顆粒增多增粗，中性分葉核粒細胞缺如；③紅系增生活躍，比值及形態(tài)可；④淋巴細胞及單核細胞比例增高；⑤血小板易見。乳酸2.9 mmo/L；血氨34.8 mmo/L；血串聯(lián)質譜及尿有機酸分析未見異常；復查肝功能：丙氨酸轉氨酶(ALT)365 U/L，天冬氨酸轉氨酶(AST)302 U/L，谷氨酰轉肽酶150 U/L，總膽汁酸(TBA)17.16 μmol/L；淋巴細胞亞群示：淋巴細胞3.66%(40%～60%)，總T淋巴細胞(CD3+)56.07%(60%～84%)，CD3+CD8+19.53%(20%～35%)，CD3+CD4+36.26%(36%～55%)，CD3+CD4+CD8+0.31%(0～5%)，CD3+CD4+/CD3+CD8+1.86%(0.8%～2.6%)，CD19+B淋巴細胞41.48%(8%～28%)，CD3+CD56+T-NK細胞1.96%，淋巴細胞計數(shù)430×106/L，總T淋巴細胞(CD3+)241×106/L，CD3+CD8+84×106/L，CD3+CD4+156×106/L，CD19+B淋巴細胞13×106/L ，CD3+CD56+T-NK細胞178×106/L，符合T-B-NK+免疫表型。排除白血病及再障和遺傳代謝病，予調整抗生素、保肝及粒細胞刺激因子升高粒細胞治療后患兒未再發(fā)熱，體質量緩慢增加，白細胞升高(但容易再次下降)，住院期間患兒出現(xiàn)腹脹，腹部X線立臥位平片示腹部部分腸管擴張并積氣；予生理鹽水回流灌腸腹脹減輕后鋇劑灌腸提示直腸痙攣狹窄，建議隔期復查除外先天性巨結腸。住院38天后患兒家屬要求出院轉上級醫(yī)院進一步治療。出院診斷：①重度熱能營養(yǎng)不良；②支氣管肺炎；③肝損傷；④不完全性腸梗阻；⑤重度貧血；⑥膿毒血癥；⑦中毒性腸麻痹；⑧先天性巨結腸？⑨直腸狹窄。

表1 血常規(guī)變化情況

因患兒多次血常規(guī)提示粒細胞減少甚至缺乏，考慮先天性中性粒細胞缺乏癥可能，在獲得家長知情同意后，采集患兒及父母的外周血行基因檢測。RAG基因exon2引物為：正向引物序列 CCTGGAGAGTC CAG TG AAG TCC； TGCCAGGCTACC AC C ACTTT；反向引物序列 AGCCAG CAGG AACA AGGTCA； GAGAATGCCT CCC A GCTCAA。擴增條件為：①預變性:95 ℃，10 min；②變性(35個循環(huán)):95 ℃，30 s；③退火(35個循環(huán)):60 ℃，30 s；④延伸(35個循環(huán)):72 ℃，45 s；⑤徹底延伸(35個循環(huán)):72 ℃，5 min。

測序分析發(fā)現(xiàn)患兒RAG1基因第2外顯子分別為存在c.1229G>A(p.Arg410Gln)、c.2428A>G(p.Ile810Val)錯義變異(母源性)和c.2005G>A(p.Glu669Lys)的錯義變異(父源性)，見圖1～3。上述變異可能導致蛋白質功能受到影響，c.1229G>A及c.2005G>A變異的致病性已有文獻報道，但c.2428A>G變異的致病性未見報道(所參考數(shù)據庫： HGMD Pro、 PubMed及ClinVar)，且c.1229G>A雜合變異為國內首次報道。上述的變異不屬于多態(tài)性變化，在人群中發(fā)生頻率極低(所參考數(shù)據庫 1000Genomes及dbSNP)。家系驗證結果顯示，患兒c.1229 G>A和c.2428A>G來自母親，c.2005G>A來自父親，為復合雜合變異，符合常染色體隱性遺傳規(guī)律。

圖1 RAG基因c.1229G>A變異測序峰圖 a、b及c分別為患兒和父母，箭頭示突變位點

圖2 RAG基因c.2428A>G變異測序峰圖 a、b及c分別為患兒和父母，箭頭示突變位點

圖3 RAG基因c.2005G>A變異測序峰圖 a、b及c分別為患兒和父母，箭頭示突變位點

根據文獻[7]進行致病性分析：①RAG1基因 c.1229G>A變異的證據強度為“PS1+PM1+PM2+PM3+PP3”，判斷為致病性的變異；②RAG1基因c.2005G>A變異的證據強度為“PS1+PM2+PM3+PP3+PP5”，判斷為致病性的變異；③RAG1基因c.2428A>G變異的證據強度為“PM2+PM3+PP3”，判斷為臨床意義不明的變異，但亦未有無致病性的定論，需待日后進一步行相關驗證。

RAG1基因序列全長為1 043個氨基酸，包括478個alpha-helix，121個extended strand，56個beta-turn，388個Random coil。各種二級結構所占的百分比為alpha-helix占45.83%，extended strand占11.6%， beta turn占5.37%，random coil占37.2%。c.1229G>A(p.Arg410Gln)，導致第410號氨基酸由精氨酸變成了谷氨酰胺；c.2428A>G(p.Ile810Val)，導致第810號氨基酸由異亮氨酸變成了纈氨酸；c.2005 G>A(p.Glu669Lys)，導致第669號氨基酸由谷氨酸變成了賴氨酸。該3個變異均發(fā)生在RAG1蛋白家族結構域中，RAG1蛋白家族是RAG1-RAG2 V(D)J復合酶復合物的兩個不同組分之一。RAG復合物由RAG1蛋白和RAG2蛋白組成，是一種多蛋白復合體，在V(D)J重組過程中介導DNA裂解，其中RAG1介導DNA-binding結合到保守重組信號序列(RSS)上，氨基酸的改變可能導致蛋白質功能受到影響，見圖4～5。

圖4 c.1229G>A、c.2428A>G及c.2005 G>A變異位點(b)及變異前的位置(a)

圖5 c.1229G>A、c.2428A>G及c.2005 G>A變異位點(b、d及f)及變異前的位置(a、c及e)

結合患兒臨床表現(xiàn)及基因檢測分析診斷RAG1基因c.2005G>A、c.1229G>A及c.2428A>G所致的SCID基本明確，告知患兒家屬目前該病最有效的治療措施為造血干細胞移植，家屬考慮中，隨訪患兒一般情況暫時尚可。

2 討 論

RAG1基因定位于11p12，基因組全長約11.73 kb，包含2個外顯子，外顯子長度約6 564 bp，編碼1 043個氨基酸。目前RAG1基因變異類型多為錯義變異，其次為無義變異、堿基缺失和插入變異，尚無變異類型與臨床類型關系報道，但臨床上純合變異較復合雜合變異癥狀重，本例患兒RAG1基因3個變異位點均為錯義變異，且予以升級抗生素及IVIG和粒細胞刺激因子治療后癥狀改善，支持文獻報道。RAG1基因氨基末端區(qū)域有核定位的信號，尤其是4個堿性區(qū)域BI、BIIa、BIIb及BIII，是核轉運蛋白SRPI的靶點。另外2個鋅指結構域C3HC4及C2H2參與RAG1蛋白二聚體的形成。RAG1蛋白的中心區(qū)域有2個顯著保守的功能域，1個氨基酸殘基區(qū)域，識別重組信號序列(RSSs)，將RAG1-RAG2的蛋白復合體錨定在RSSs區(qū)。另一個氨基酸的殘基區(qū)域是重組酶活性區(qū)域，與RAG2蛋白相互作用的功能域定位于其他氨基酸殘基區(qū)域，包括活性中心和羧基末端區(qū)域。

RAG為Ig及TCR基因片段重排所必需，RAG1基因變異造成其編碼的重組酶活性完全或部分喪失，V(D)J重組失衡，T及B淋巴細胞發(fā)育在早期為阻斷而致PID發(fā)病。RAG1蛋白核心的氨基酸區(qū)域是387-1008，其編碼產物Rag1蛋白所形成的復合物為最重要的重組酶之一。該基因完全變異造成功能喪失，阻斷V(D)J重組，致成熟的B及T細胞功能完全喪失。

V(D)J基因片段的重組為RAG1或RAG2所誘發(fā)，其核酸內切酶誘導DNA雙鏈斷裂。由非同源的末端連接蛋白對斷裂的DNA進行修復，該過程 至少包括5個蛋白，即Artemis、LIG4、XRCC4、DNA-PKcs和Ku70/80[8]，這些分子的缺陷均可導致 T-B-NK+SCID發(fā)生。

如果不是新生兒篩查發(fā)現(xiàn)，T-B-NK+SCID患兒在生命的早期會出現(xiàn)嚴重到危及生命的感染、發(fā)育不良、T和B細胞數(shù)量和功能低下或缺失、NK細胞數(shù)量和功能正常。T-B-NK+SCID可由編碼抗原受體基因V(D)J重組蛋白的任何一個基因的常染色體隱性缺陷引起。重組過程隨機組合可變的、多樣性的和連接的基因片段，這些片段分別編碼TCR和免疫球蛋白基因。這些基因編碼的一些蛋白質也參與了人體所有細胞的DNA修復。這些基因的缺陷與額外的免疫表型有關，包括生長發(fā)育異常以及對電離輻射和化療的敏感性增高。

與V(D)J重組相關的T-B-NK+SCID主要有兩種類型：有或無放療/化療敏感性的患者。其類型取決于缺陷基因是否同時參與V(D)J重組和DNA修復或重組。RAG1或RAG2基因的嚴重變異可致無輻射敏感性的T-B-NK+SCID，因RAG1和RAG2基因只參與V(D)J重組，而不參與DNA修復；某些RAG基因變異導致部分蛋白表達和T、B細胞產生數(shù)量受限但臨床表現(xiàn)較為明顯，稱為Omenn綜合征。Omenn綜合征也為一種T-B-NK+SCID，盡管它是一種產生無功能T和B細胞的泄漏型SCID，因此可能表現(xiàn)為T+B+NK+SCID或輕度聯(lián)合免疫缺陷。B-NK+SCID另一類型是輻射敏感性的SCID(RS-SCID)，其中包括阿薩巴斯卡SCID(SCID-A)，在講阿薩巴斯卡語的美洲土著人中發(fā)現(xiàn)。RS-SCID主要由DCLRE1C基因變異引起，但也可以在涉及基因PRKDC、LIG4、NHEJ1和NBS1變異中發(fā)現(xiàn)，所有這些都是NHEJDNA修復所必需的。

SCID臨床上可分為典型SCID，如果不太嚴重，則根據T細胞定性和定量缺陷的嚴重程度分為泄漏型SCID。新生兒篩查或家族史診斷為SCID的嬰兒在出生時和嬰兒早期表現(xiàn)正常。新生兒期未確診的SCID患者的典型癥狀是反復嚴重感染、慢性腹瀉和發(fā)育不良。在缺乏以人群為基礎的新生兒SCID篩查的情況下，通常直到嬰兒出現(xiàn)一種或多種嚴重感染才會做出診斷。大多數(shù)SCID患兒的胸片上沒有胸腺陰影，淋巴細胞絕對計數(shù)通常很低。典型SCID定義為自體T細胞計數(shù)<300×106/L，體外淋巴細胞轉化試驗(PHA)反應<正常的10%，泄漏型SCID是指淋巴細胞減少(2歲以下的自體T細胞計數(shù)<1 000×106/L，2～4歲<800×106/L，或4歲以上<600×106/L)，PHA反應<30%正常。該患兒自體T淋巴計數(shù)241×106/L，小于300×106/L，符合典型SCID定義，其在第1次住院時(即新生兒期)一般抗感染治療有效，白細胞明顯降低，考慮為一過性。第2次因發(fā)育不良住院，且在新生兒期之后出現(xiàn)不易控制的感染，支持上述文獻報道。但該患兒胸片可見胸腺影，與上述文獻略有不同。

對于SCID家庭及高危孕婦應加強遺傳咨詢，更重要的是進行必要的產前診斷，其一可早期采取措施減少SCID患兒的出生，其二也有利于醫(yī)護人員為有缺陷患兒出生后提供及時而有效的診治做好必要的準備。

SCID的初始管理為預防感染，包括與潛在的疾病接觸者隔離、免疫球蛋白替代療法、開始抗菌預防和避免使用活病毒疫苗。而大多數(shù)SCID最常見、最普遍及最有效的治療方法是來自匹配良好的健康異基因供體的造血細胞移植。這種治療有很好的整體生存率，重建T細胞免疫，在許多情況下，B細胞免疫及腺苷脫氨酶(ADA)缺乏可采用酶替代療法。如果沒有人類白細胞抗原(HLA)相同的供體，基因治療在某些形式的SCID中是一種越來越有效和成功的替代方案。但遺憾的是，相當一部分患兒因經濟和配型困難等原因，往往在造血細胞移植前死亡。

盡管依據美國醫(yī)學遺傳學與基因組學學會(ACMG)和美國分子病理學會(AMP)“基因序列變異的解釋標準和指南”進行致病性分析顯示尚無法明確c.2428A>G變異位點的致病性，但c.2428A>G不屬于多態(tài)性變化，在人群中發(fā)生的頻率極低(所參考的數(shù)據庫 dbSNP及1000Genomes)，為進一步明確RAG1基因c.2428A>G變異位點的致病性，需要進一步大樣本回歸分析并進行轉基因動物模型驗證。患兒有SCID典型的臨床表現(xiàn)，故綜合考慮基因結果及患者癥狀和家族史等信息，可確認c.2005G>A及c.1229G>A變異位點為患兒的致病性變異，擴充了SCID國際上的基因變異譜。