李明雪，李同夢

(徐州開放大學(xué)，江蘇 徐州 221000)

短鏈脂肪酸(short chain fatty acids，SCFAs)主要包括乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、異戊酸和異己酸等，是腸道菌群代謝飲食中殘留的膳食纖維產(chǎn)生的代謝物。SCFAs的濃度受腸道節(jié)段的影響而發(fā)生變化，在盲腸和結(jié)腸近端處濃度最高，在結(jié)腸遠(yuǎn)端處濃度較低。根據(jù)膳食纖維的含量，每天在結(jié)腸中大約會(huì)產(chǎn)生500～600 mmol的SCFAs。作為被研究最為深入的代謝產(chǎn)物，SCFAs在腸道內(nèi)含量主要取決于腸道菌群的組成、膳食纖維的含量、食物在腸道內(nèi)的消化時(shí)間以及宿主與腸道菌群相互作用的代謝能力。SCFAs多數(shù)以離子形式存在，主要通過轉(zhuǎn)運(yùn)體吸收利用。在被結(jié)腸細(xì)胞吸收之后，SCFAs進(jìn)入線粒體的三羧酸循環(huán)中，為細(xì)胞產(chǎn)生 ATP 和能量。其中，乙酸、丙酸和丁酸都可以作為肝細(xì)胞的能量底物，可經(jīng)血液循環(huán)被肝臟吸收后進(jìn)行分解代謝，參與葡萄糖的轉(zhuǎn)化和調(diào)控脂肪的合成與代謝，影響腸道的電解質(zhì)平衡、腸道粘膜的通透性、促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)等功能。新近的研究表明，SCFAs與疾病之間存在顯著相關(guān)性。研究證實(shí)SCFAs可逆轉(zhuǎn)多發(fā)性硬化患者的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與促炎的輔助性T細(xì)胞的失衡；SCFAs也能與L細(xì)胞表面的FFA2/FFA3受體結(jié)合，調(diào)節(jié)控制食欲的肽類激素的釋放影響肥胖；SCFAs還能與腎素受體介導(dǎo)的腎素-血管緊張素系統(tǒng)的功能呈負(fù)相關(guān)，且有助于降低血壓。因此，SCFAs在維持機(jī)體的正常生理活動(dòng)中具有重要作用，定量檢測正常生理狀態(tài)及病理狀態(tài)下腸道及糞便中該類物質(zhì)的含量對(duì)于靶向慢性疾病的臨床診斷至關(guān)重要。

1 SCFAs的來源與代謝

SCFAs是由1～6個(gè)碳原子組成的有機(jī)脂肪酸，其分子量小，沸點(diǎn)低，常溫下易揮發(fā)，故又稱揮發(fā)性脂肪酸，是腸道中的厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門等有益菌群發(fā)酵代謝膳食纖維產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，主要包括乙酸、丙酸、丁酸等[1]。正常機(jī)體結(jié)腸中三種SCFAs的含量約占總SCFAs的90%以上，當(dāng)機(jī)體健康狀況和營養(yǎng)水平變化時(shí)，SCFAs的水平也會(huì)隨之發(fā)生變化，主要受腸道菌群的數(shù)量、豐度、類型以及膳食纖維在宿主內(nèi)停留時(shí)間的影響[2]。SCFAs主要通過單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(MCTs)介導(dǎo)的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)被結(jié)腸細(xì)胞快速吸收。SCFAs被結(jié)腸腺細(xì)胞吸收后，進(jìn)入線粒體中的檸檬酸循環(huán)，為細(xì)胞產(chǎn)生ATP和能量。未在結(jié)腸細(xì)胞中代謝的SCFAs被運(yùn)送到門靜脈循環(huán)中，參與外周循環(huán)[3]。據(jù)報(bào)道，人體內(nèi)的SCFAs平均濃度分別為乙酸260 μM、丙酸30 μM和丁酸30 μM。在肝臟中，這三種SCFAs都被用作肝細(xì)胞的能量底物[4]。此外，乙酸還被證實(shí)是膽固醇和脂肪酸合成的底物；丙酸是肝臟中合成葡萄糖的前體，參與肝臟代謝。

SCFAs主要通過兩種信號(hào)途徑調(diào)節(jié)宿主的生物反應(yīng)能力。一方面，SCFAs可直接抑制組蛋白去乙酰化酶(HDACs)來調(diào)控細(xì)胞內(nèi)基因的表達(dá)。據(jù)報(bào)道，相比其他SCFAs，丁酸抑制HDACs活性最強(qiáng)。另一方面，SCFAs通過激活G蛋白偶聯(lián)受體(如GPR41、GPR43和GPR109A)信號(hào)通路，進(jìn)一步激活下游信號(hào)傳導(dǎo)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，包括核因子-κB(NF-κB)，磷脂酶C(PLC)，絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)等途徑調(diào)控宿主的生物學(xué)功能[5-6]。

2 SCFAs的測定方法

近年來，SCFAs在糞便、血漿中水平的升高被證實(shí)在抑郁癥、阿爾茲海默、酒精性脂肪肝等疾病中發(fā)揮重要作用。因此，如何準(zhǔn)確有效的檢測 SCFAs的含量尤為關(guān)鍵。目前SCFAs常用的測定方法包括氣相色譜法(gas chromatography，GC)、液相色譜法(liquid chromatography，LC)以及高效毛細(xì)管電泳法(high performance capillary electrophoresis，HPCE)等，本文將根據(jù)相關(guān)的研究結(jié)果，總結(jié)各方法的研究進(jìn)展。

2.1 氣相色譜法(GC)

1952年，GC首次被證實(shí)可用于SCFAs檢測[7]。采用GC的分析方法檢測SCFAs對(duì)檢測器、色譜柱具有一定的要求，這主要是因?yàn)镾CFAs含有羧基，具有強(qiáng)極性，能吸附氣相色譜柱，影響色譜柱的重現(xiàn)性。因此，在用GC對(duì)SCFAs進(jìn)行檢測時(shí)，首先要對(duì)其進(jìn)行衍生化。常見的衍生化試劑有芐基溴、五氟芐基等。氣相色譜法在測試的過程中通常使用火焰離子化檢測器(flame ionization detector，F(xiàn)ID)、火焰光度檢測器(flame photometric detector，F(xiàn)PD)、熱導(dǎo)檢測器(thermal conductivity detector，TCD)等檢測器。其中，F(xiàn)ID是一種首選的GC檢測器，在SCFAs的定量分析方面具有優(yōu)勢，具有較高的靈敏度。氣相色譜柱常選用毛細(xì)管柱，主要包括強(qiáng)極性柱(如FFAP)、弱極性柱(如DB-5)等，由于SCFAs極性大，F(xiàn)FAP柱對(duì)SCFAs的分離效果更佳[8]。與FFAP色譜柱具有相同特性的毛細(xì)管柱(Econo-Cap EC-1000)也被廣泛用于SCFAs測定[9-10]。由于SCFAs極性較強(qiáng)，研發(fā)者在靶向GC這種方法進(jìn)行測試時(shí)，應(yīng)當(dāng)篩選極性相對(duì)較強(qiáng)的毛細(xì)管柱，以盡可能確保保留時(shí)間和分離度能達(dá)到最佳效果。

值得注意的是，由于待檢的糞便SCFAs的含量相對(duì)較低，故使用串聯(lián)質(zhì)譜可顯著提高檢測器的檢測能力。如氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)能兼具定性及定量的優(yōu)點(diǎn)，具有更精確的優(yōu)勢。

2.2 液相色譜法(LC)

SCFAs具有揮發(fā)性，但并不能產(chǎn)生熒光或吸收紫外線的化學(xué)基團(tuán)，因此在檢測時(shí)需先對(duì)SCFAs的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，再采用相關(guān)紫外線或熒光檢測器對(duì)其進(jìn)行檢測。常見的熒光衍生試劑和紫外衍生試劑有重氮甲烷、喹啉及苯并酰肼及苯甲酰甲基、對(duì)硝基芐基、對(duì)-溴苯甲酰甲基等。在檢測器的選擇中，紫外檢測器(ultra violet detector，UVD)、質(zhì)譜檢測器(mass detector，MSD)等較為常用。在色譜柱的選擇中，常用的色譜柱主要有，以C18硅膠為填料的色譜柱、YMC-Pack FA色譜柱、離子色譜柱等[11]。目前，采用離子色譜柱方法重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高、專屬性和耐用性強(qiáng)，已成為檢測SCFAs的優(yōu)勢分析方法[12]。單一采用LC進(jìn)行SCFAs檢測具有一定的局限性，聯(lián)用效果更佳。Han等[13]在2015年采用LC-MS聯(lián)用的方法，報(bào)道了一種新的衍生化試劑3-硝基苯肼(3-NPH)檢測SCFAs，充分驗(yàn)證了這種衍生物具有良好的靈敏度和化學(xué)穩(wěn)定性。由于與糞便樣品相比，血清和血漿樣品需要更高的檢測靈敏度，Tsang和曹等[14]在2018年研究了幾種衍生化試劑，以確定哪一種提供了最大的分析物敏感性，并探究證實(shí)了小鼠血清中的 SCFAs 和酮體與干擾結(jié)構(gòu)異構(gòu)體的最佳分離時(shí)間。雖然他們推薦使用鄰芐基羥胺(O-BHA)作為同時(shí)測定SCFAs和酮體的衍生試劑，但是與 O-BHA相比，當(dāng)用3-NPH 衍生時(shí)，SCFAs被檢測到的靈敏度更高。Song等[15]在2019年也使用LC-MS監(jiān)測小鼠血漿中SCFAs的濃度，但使用4-乙酰氨基-7-巰基-2,1,3-苯并噁二唑作為衍生試劑。雖然衍生化方法具有在室溫下完成的優(yōu)點(diǎn)，但色譜運(yùn)行時(shí)間為65 min是較為顯著的缺點(diǎn)。

2.3 高效毛細(xì)管電泳法(HPCE)

HPCE是采用高壓直流電場力對(duì)毛細(xì)管進(jìn)行驅(qū)動(dòng)分離的一項(xiàng)液相分離技術(shù)。與前兩者相比，HPCE的方法快速、簡便，樣品量少且反應(yīng)條件溫和，適用于SCFAs的常規(guī)分析[16]。毛細(xì)管電泳中常見的衍生化試劑有5-溴甲基熒光素、4-巰基-7-甲巰基-2、1,3-苯并氧二唑等。臨床上常用毛細(xì)管電泳-紫外和毛細(xì)管電泳-熒光對(duì)糞便SCFAs的含量進(jìn)行檢測。但值得注意的是，這兩種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，如毛細(xì)管電泳-紫外檢測法分離范圍廣，但其靈敏度較低；毛細(xì)管電泳-熒光檢測法的靈敏度較高，但其分離范圍窄?？傊?，用GC、LC及HPCE等方法對(duì)SCFAs進(jìn)行檢測均存在一定的局限性。因此，要使SCFAs檢測過程的分析時(shí)間、操作難度及靈敏度等各項(xiàng)指標(biāo)達(dá)到更好的效果，應(yīng)當(dāng)采用串聯(lián)技術(shù)，如GC、HPLC及CE與MS檢測器聯(lián)用，可同時(shí)獲得定性、定量數(shù)據(jù)，如Yao等[17]開發(fā)了一種在血漿/血清酸化后用甲基叔丁基醚萃取法測定SCFAs的靈敏方法。這種方法采用GC-MS聯(lián)用技術(shù)，將SCFAs的有機(jī)提取物直接注射，并用極性氣相色譜柱與質(zhì)譜法聯(lián)用進(jìn)行分離和檢測。對(duì)SCFAs質(zhì)子化所需的溶劑比、血漿體積和鹽酸用量進(jìn)行了優(yōu)化。方法驗(yàn)證也顯示了良好的日內(nèi)和日間重復(fù)性。通過簡化樣品制備程序，這種方法降低了污染的風(fēng)險(xiǎn)，降低了分析成本，提高了產(chǎn)量。

2.4 核磁共振法(NMR)

核磁共振方法是基于特定原子核的磁特性，利用原子核在磁場中吸收和發(fā)射電磁輻射的作用進(jìn)行檢測。NMR產(chǎn)生的能量出現(xiàn)在一個(gè)特定的共振頻率，這取決于特定同位素的磁場和磁特性。同位素核心1H和13C已被用于糞便樣品中的SCFAs研究[18]。核磁共振是一種定量(絕對(duì))、無損、可重復(fù)、客觀的方法。它主要用于同時(shí)追蹤復(fù)雜生物材料中不同代謝物的化學(xué)成份和濃度。它需要在核磁共振實(shí)驗(yàn)中使用氘化溶劑，以糾正場強(qiáng)，并避免巨大的溶劑吸收，否則會(huì)破壞1H-NMR 譜，將導(dǎo)致重大的分析物損失。同時(shí)該方法是非破壞性的，并且只引起材料的微小變化。因此，這種方法已用于監(jiān)測人體代謝活動(dòng)，尤其是微生物群對(duì)宿主代謝調(diào)節(jié)的影響?；贜MR的代謝譜分析可以提供未來的疾病診斷方法，但是在較差的預(yù)處理優(yōu)化方法、儀器成本和靈敏度等方面仍然存在缺陷[19-20]。

3 結(jié) 語

腸道微生物群具有維持人體平衡的重要功能。微生物群落的變化會(huì)導(dǎo)致新陳代謝的不同病理狀態(tài)。SCFAs作為腸道產(chǎn)生的關(guān)鍵代謝產(chǎn)物，在人類健康疾病中的作用，越來越引起研究者的重視，靶向?qū)CFAs的全面了解對(duì)調(diào)控宿主的生理功能作用至關(guān)重要。因此，一個(gè)良好和可靠的檢測SCFAs的技術(shù)是必不可少的。目前，大多數(shù)SCFAs分析方法都有優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。根據(jù)糞便樣品中SCFAs的預(yù)期濃度，采用GC/FID或MS、HPLC等方法檢測SCFAs的方法性能都是可行的。建議研究人員在選擇適當(dāng)?shù)募S便SCFAs檢測方法時(shí)，考慮儀器的可用性、時(shí)間消耗和成本，以便在研究、臨床常規(guī)使用和潛在的自動(dòng)化方面進(jìn)行檢測。