非人靈長類動物種質(zhì)冷凍保存研究進展和展望

李明文

（新鄉(xiāng)醫(yī)學院三全學院生育力保存實驗室，新鄉(xiāng) 453003）

非人靈長類是最高等的動物類群和人類的近親，在形態(tài)、生理、生殖、發(fā)育、行為和遺傳等諸方面與人類高度近似，因此是研究生物醫(yī)學和人類疾病的理想動物模型，長期以來供不應求(Changet al.,2021)。非人靈長類動物雖然種類繁多，包括原猴、新大陸猴、舊大陸猴和巨猿等類群，約500余種(Rylands and Mittermeier,2014；尹峰等，2015;Zinner and Roos,2016)，但是由于人類活動、棲息地破壞、狩獵、遺傳隔離和氣候變化等因素，許多非人靈長類動物的野生種群數(shù)量急劇下降，其中不少瀕臨滅絕的邊緣(馬世來和王應祥，1988；張榮祖等，1992；范朋飛，2012)。

中國的非人靈長類動物除獼猴(Macaca mulatta)為國家二級重點保護野生動物外，其余均被列為國家一級重點保護野生動物，處于易危、瀕?；驑O危等級(范朋飛，2012；尹峰等，2015;Zinner and Roos,2016；中國野生動物保護協(xié)會，2020)，其中最為瀕危的是長臂猿類，例如中國特有的海南長臂猿(Nomascus hainanus)和天行長臂猿(Hoolock tianxing)，種群數(shù)量分別只有約33只和200只，瀕臨滅絕的邊緣。原猴類的蜂猴(Nycticebus bengalensis)和倭蜂猴(Nycticebus pygmae-us)也處于極危等級，前者種群數(shù)量為800~1 200只，后者只有100只左右。疣猴類狀況也不容樂觀，滇金絲猴(Rhinopithecus bieti)和黔金絲猴(Rhinopithecus brelichi)每種數(shù)量少于2 000只，黑葉猴(Presbytis francoisi)約1 600只，白頭葉猴(Trachypithecus leucocephalus)約1 200只，而戴帽葉猴(Presbytis pileatus)只剩約300只。獼猴屬一些種類也亟需加強保護，例如中國特有的藏酋猴(Macaca thibetana)的種群數(shù)量約為2 000只，藏南獼猴(Macaca munzala)估計少于500只，而白頰獼猴(Macaca leucogenys)則數(shù)量不詳。

為了保護非人靈長類動物和拯救瀕危物種，除了建立野生動物保護區(qū)和對一些物種進行異地圈養(yǎng)外，近幾十年還對一些物種的生殖生物學、輔助生殖和種質(zhì)冷凍保存進行了研究。輔助生殖包括人工授精、體外受精、精子卵胞漿顯微注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)和胚胎移植等，是拯救動物和提高繁殖效率的重要手段(Mazuret al.,2008;Comizzoli,2017)。為了方便和有效地進行輔助生殖，常常需要對精子、卵子和胚胎等生殖材料進行冷凍保存，在需要時進行復蘇和用于輔助生殖。生殖材料的冷凍保存還包括對含有生殖干細胞和生殖細胞的性腺組織(睪丸組織和卵巢組織)的冷凍保存。由于生殖材料的冷凍保存與生殖密切有關，故常被稱為種質(zhì)保存(germplasm preservation)(Mazuret al.,2008;Luvoni and Colombo,2020)或生育力保存(fertility preservation)(Comizzoli,2017;Picton,2018;Changet al.,2021)。種質(zhì)冷凍保存與輔助生殖相結(jié)合對保存動物遺傳物質(zhì)資源、拯救瀕危動物、提高繁殖效率和在圈養(yǎng)種群中增加遺傳多樣性等具有重要意義(Mazuret al.,2008;Comizzoli,2017;Luvoni and Colombo,2020)，另外還是保存基因編輯非人靈長類動物品系的重要方法(Changet al.,2021)。

冷凍保存一般是將細胞或組織在冷凍保護劑的存在下，經(jīng)過適當?shù)拿撍?以避免冰晶損傷)和降溫處理后，放置于液氮的超低溫度(-196℃)下，使其生物活動有效停止，并同時使其結(jié)構和功能得以長期保存(Pegg,2015;Fahy and Wowk,2021)。根據(jù)對生物膜通透性的不同，冷凍保護劑分為膜通透性保護劑(如乙二醇、丙二醇、二甲基亞砜和甘油)和膜非通透性保護劑(如蔗糖、海藻糖)。種質(zhì)冷凍保存常用的方法包括慢速冷凍和玻璃化，而玻璃化又根據(jù)冷卻速率的不同分為快速冷凍(rapid freezing)和超快速冷凍(ultra-rapid freezing)，前者是先在液氮蒸汽內(nèi)進行冷卻，然后浸入液氮，而后者則是直接浸入液氮冷凍保存。

慢速冷凍方法采用較低濃度的冷凍保護劑和緩慢的冷卻速率，使細胞逐步脫水，以防止細胞內(nèi)結(jié)冰。慢速冷凍方法一般在結(jié)冰溫度到來之前的-6℃~-7℃對冷凍樣品進行人工植冰(seeding)，以避免過冷現(xiàn)象(supercooling)的傷害(Pegg,2015)。與慢速冷凍方法相比，玻璃化冷凍方法采用高濃度的冷凍保護劑，并迅速把樣品冷卻到玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(glass transition temperature)以下，使冷凍液迅速轉(zhuǎn)化為高度粘稠的固體狀態(tài)，即玻璃化狀態(tài)，從而避免了細胞內(nèi)、外冰晶的形成(Fahy and Wowk,2021)。為了避免過高濃度的單一冷凍保護劑的傷害，?；旌鲜褂脙煞N或多種冷凍保護劑。

目前，非人靈長類動物種質(zhì)冷凍保存研究涉及的物種還很有限，主要集中于舊大陸猴的一些種類，例如獼猴、食蟹猴(Macaca fascicularis)和狒狒屬(Papio)。近年來對新大陸猴種質(zhì)保存的研究也逐漸增多，例如狨猴和松鼠猴精子的冷凍保存，但對原猴類動物種質(zhì)保存的研究仍屬空白，只是初步研究了灰鼠狐猴(Microcebus murinus)精液的基本特征(Aslamet al.,2002)，雜色狐猴(Varecia variegata)和環(huán)尾狐猴(Lemur catta)的精液采集方法(Chatfieldet al.,2007)以及棕色狐猴(Eulemur fulvus)精子形態(tài)的季節(jié)性變化等(Brun and Rumpler,1990)。本文主要綜述新大陸猴、舊大陸猴和巨猿類的精子、卵子(也稱卵或卵母細胞)、胚胎和性腺組織冷凍保存的研究進展，并對未來的研究方向進行了探討。

1 新大陸猴種質(zhì)冷凍保存

新大陸猴，也稱闊鼻猴，分布于中、南美洲和墨西哥的熱帶地區(qū)，包括狨猴屬(Callithrix)、獅面狨猴屬(Leontopithecus)、松鼠猴屬(Saimiri)、卷尾猴屬(Cebus)、節(jié)尾猴屬(Callimico)、夜猴屬(Aotus)、僧面猴屬(Pithecia)、叢尾猴屬(Chiropotes)、禿猴屬(Cacajao)、伶猴屬(Callicebus)、吼猴屬(Alouatta)和蜘蛛猴屬(Ateles)等多個類群。迄今為止，對新大陸猴的種質(zhì)保存研究主要集中在狨猴、卷尾猴和松鼠猴3個類群，且主要限于精子的冷凍保存。

最近對普通狨猴(Callithrix jacchus)和黑鉛筆狨猴(Callithrix penicillate)的研究發(fā)現(xiàn)，狨猴類動物精子對低溫和冷凍極其敏感，新鮮精子活力(即運動精子的百分數(shù))可達80%以上，但是冷凍保存和解凍后精子的活力只有0~5%(Arakakiet al.,2019a)。該研究采用先慢速平衡、后快速冷凍的方法，以TES-TRIS(即TEST)做為冷凍液的緩沖劑，以棉籽糖、雞蛋黃和甘油做為冷凍保護劑，冷凍液配方為1.2% Tes、0.2% Tris、2%葡萄糖、2%乳糖、0.2%棉籽糖(質(zhì)量百分比w/v，下同)、20%雞蛋黃和4%~6%甘油(體積百分比v/v，下同)。冷凍前把裝載到冷凍麥管內(nèi)的精子樣品在2 h內(nèi)從室溫緩慢降低到4℃，然后進行快速冷凍，即先在接近液氮面上方的液氮蒸汽內(nèi)快速冷凍10 min，最后浸入液氮保存。

采用與上述狨猴屬精子冷凍保存相似的方法，對松鼠猴屬的柯林斯松鼠猴(Saimiri collinsi)、黑松鼠猴(Saimiri vanzolinii)、洪堡松鼠猴(Saimiri cassiquiarensis)和厄瓜多爾松鼠猴(Saimiri macrodon)的研究發(fā)現(xiàn)，松鼠猴精子對低溫變化和冷凍也很敏感，雞蛋黃和甘油對精子活力的冷凍保存效果不佳，解凍后精子的活力由冷凍前的80%~90%降低到6%~30%(Oliveiraet al.,2015,2016)，這與狨猴精子的冷凍生物學特性近似(Arakakiet al.,2019a)。

對卷尾猴類棕卷尾猴(Cebus apella)和簇絨卷尾猴(Sapajus apella)的研究發(fā)現(xiàn)，以3.0%~3.5%甘油和10%~20%雞蛋黃(v/v)做為冷凍保護劑，先將精子在4℃平衡2 h，然后將其放在較高的溫度下(-60℃或者離液氮面5~10 cm處)停留20 min，使其進行較慢速的冷凍，然后浸入液氮保存，采用此法可以有效地冷凍保存精子的活力(Oliveiraet al.,2011;Le?oet al.,2015)。和新鮮精子的活力(80%左右)相比，解凍后的精子活力為30%~50%，這與在人類和舊大陸猴(如獼猴和食蟹猴)采用快速冷凍法獲得的精液冷凍實驗結(jié)果近似(Tollneret al.,1990;Sánchez-Partidaet al.,2000;Siet al.,2004;Nichols and Bavister,2006;Dong and VandeVoort,2009;Donget al.,2009)。對金頭獅面狨猴(Leontopithecus chrysomelas)的研究也發(fā)現(xiàn)較慢速的冷凍速度有利于保存精子活力(Arakakiet al.,2019b)。精子在4℃平衡2 h后，采用6%甘油和10%雞蛋黃以及較慢速的冷凍方法(將精子樣品置于液氮面上方5 cm處液氮蒸汽內(nèi)10 min)，最后浸入液氮保存。精子在37℃解凍后，精子活力達50%以上。

上述在狨猴、獅面狨猴、松鼠猴和卷尾猴的研究結(jié)果表明，新大陸猴的精子對快速降溫較為敏感，因此冷凍保存需要較慢的冷凍速度。目前尚無新大陸猴卵子冷凍保存的研究報道，不過已經(jīng)發(fā)現(xiàn)普通狨猴卵母細胞可在體外成熟(Tomiokaet al.,2012)，也可以通過注射卵泡刺激素(FSH)和人絨毛膜促性腺激素(hCG)促進卵母細胞在體內(nèi)成熟(Kroppet al.,2017;Kandaet al.,2018)。胚胎可在動物自然交配后從輸卵管或子宮內(nèi)采集，也可利用人工誘導排卵和體外受精的方法在體外進行生產(chǎn)(Summerset al.,1987;Ishibashiet al.,2013;Kroppet al.,2017)。

對普通狨猴胚胎的研究發(fā)現(xiàn)，從輸卵管獲得的分裂期胚胎(4~10個細胞階段)和從子宮獲得的桑葚胚，在含有20%胎牛血清和1.5 mol/L二甲基亞砜(DMSO)的冷凍液中進行慢速冷凍，可成功使胚胎得到冷凍保存(Summerset al.,1987)，這與在人類和食蟹猴獲得的胚胎冷凍實驗結(jié)果近似(Popeet al.,1986;Balmacedaet al.,1986)。胚胎復蘇后進行胚胎移植，可使同步發(fā)情的雌性受體正常懷孕，懷孕率55.6%(Summerset al.,1987)。慢速冷凍步驟依次包括室溫平衡10 min，然后以每分鐘2℃的冷卻速率從室溫降至-6℃，接著人工植冰，再以每分鐘0.3℃的冷卻速率從-6℃降至-60℃，最后快速浸入液氮(-196℃)保存(Summerset al.,1987)。

2 舊大陸猴種質(zhì)冷凍保存

舊大陸猴，又稱狹鼻猴，主要分布于非洲和亞洲，包括獼猴類和疣猴類。主要有獼猴、食蟹猴、臺灣獼猴(Macaca cyclopis)、日本獼猴(Macaca fuscata)、狒狒、長尾猴屬(Cercopithecus)、赤猴(Erythrocebus pata)、綠猴屬(Chlorocebus)、白眉猴屬(Cercocebus)、白瞼猴屬(Lophocebus)、山魈屬(Mandrillus)、疣猴屬(Colobus)、葉猴屬(Presbytis)、烏葉猴屬(Trachypithecus)、白臀葉猴屬(Pygathrix)和仰鼻猴屬(Rhinopithecus)等。迄今為止，對舊大陸猴的種質(zhì)保存研究主要涉及獼猴、食蟹猴、黑長尾猴(Cercopithecus aethiops)和黑冠白瞼猴(Lophocebus aterrimus)，而對本類群其他物種的研究極度欠缺。

2.1 精子冷凍保存

對獼猴精液冷凍保存的系統(tǒng)研究始于2000年左右，冷凍液常以TEST作為基礎液，雞蛋黃(常用濃度為20%，v/v)和甘油(常用濃度為3%~5%，v/v)是最常用的冷凍保護劑。冷凍方法包括慢速冷凍和快速冷凍(Sánchez-Partidaet al.,2000;Siet al.,2004；采克俊等，2005;Nichols and Bavister,2006;Donget al.,2009;Dong and VandeVoort,2009)，但兩種冷凍方法均先將精子樣品從室溫緩慢降溫至4℃~5℃，以免發(fā)生冷休克和精子損傷，具體方法是將精子懸浮于不含甘油的冷凍液內(nèi)，并將容器放入滿盛室溫水的燒杯內(nèi)，然后于4℃平衡2 h。平衡后加入甘油，裝入冷凍容器(如冷凍麥管)進行冷凍?？焖倮鋬龇椒ㄊ前褬悠贩胖迷陔x液氮面1.0~1.5 cm的液氮蒸汽中冷卻10 min，最后浸入液氮保存(-196℃)。解凍方法一般在37℃水浴內(nèi)進行(Donget al.,2009)。

研究還發(fā)現(xiàn)相同濃度(v/v)的甘油和乙二醇(ethylene glycol,EG)在20%雞蛋黃的存在下對獼猴精子的冷凍保護作用近似(Donget al.,2009)，這和食蟹猴精子的冷凍保存結(jié)果一致(Chenet al.,2017;Strelchenkoet al.,2020)。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，雞蛋黃對精子起冷凍保護作用的主要有效成分是低密度脂蛋白(LDL)(Donget al.,2011)，并且雞蛋黃的濃度不必是20%，因為在2%~20%(v/v)濃度范圍內(nèi)其對精子活力的冷凍保護效果并無顯著區(qū)別(Donget al.,2009)。最近的研究還發(fā)現(xiàn)，超快速冷凍方法(即將精子樣品直接浸入液氮，不在液氮氣相中停留)不適合獼猴精子，解凍后精子活力幾乎為零(de Carvalhoet al.,2021)。

食蟹猴由于全年繁殖(Tollneret al.,1990；王宏等，2017)，也是常用的非人靈長類實驗動物。早在1990年代的研究就發(fā)現(xiàn)含有20%雞蛋黃和3%甘油的TEST是食蟹猴精子的有效冷凍液(Tollneret al.,1990)，并且上述的獼猴精子冷凍保存方法對食蟹猴精子同樣有效，解凍后精子活力平均達56.0%，這和在獼猴獲得的結(jié)果相似(Donget al.,2009;Tollneret al.,2011)。如果在含有20%雞蛋黃和3%甘油的冷凍液內(nèi)另加20%(v/v)脫脂牛奶，解凍后的精子活力更好，可達67.0%(Tollneret al.,1990)。

除了食蟹猴和獼猴外，對黑長尾猴的研究也發(fā)現(xiàn)含有雞蛋黃和甘油的TEST冷凍液可以有效地冷凍保存精子，解凍后的精子活力可達冷凍前新鮮精子活力的63.6%(Seieret al.,1993)。另外，最近對黑冠白瞼猴的研究發(fā)現(xiàn)，精子樣品在快速冷凍前于15℃~20℃平衡10 min即可，不必像上述對獼猴和食蟹猴等動物的精子那樣在快速冷凍前先將精子樣品在2 h內(nèi)緩慢從室溫降至4℃~5℃。采用這種快速平衡和快速冷凍的方法，黑冠白瞼猴的精子在冷凍保存和解凍復蘇后，其精子活力高達67.0%(Gadeaet al.,2019)。

由于蛋黃和牛奶成分復雜，且可能含有動物源性微生物，因此研究化學成分確定的精子冷凍液具有重要意義。Li等(2005)研究了在不含蛋黃和牛奶的情況下采用TEST+甘油冷凍液，發(fā)現(xiàn)5%甘油對食蟹猴精子的快速冷凍保存具有最佳的保護作用，解凍后精子活力平均為43.0%。Strelchenko等(2020)采用Tes(52 mmol/L)和哌嗪-N,N'-雙(2-乙磺酸)(PIPES,16 mmol/L)作為緩沖劑和含有海藻糖(58 mmol/L)、棉籽糖(4 mmol/L)、葡萄糖(111 mmol/L)、脯氨酸(5 mmol/L)、甘氨酸(10 mmol/L)、谷氨酰胺(10 mmol/L)和人血清白蛋白(9.1%,w/v)的冷凍液，對食蟹猴精子進行了快速冷凍，發(fā)現(xiàn)5%(v/v)甘油對精子存活度和精子活力的冷凍保護作用效果最佳，解凍后精子的活力平均為51.6%。

2.2 卵子和胚胎冷凍保存

目前對舊大陸猴卵子冷凍保存的研究很少。早期的研究表明，獼猴未成熟卵母細胞比成熟卵母細胞對乙二醇高滲溶液造成的損傷更具有耐受性(VandeVoort and Leibo,2005)，并且快速冷凍比慢速冷凍能更好地保存卵母細胞的微管等結(jié)構(VandeVoortet al.,2008)。黃璋瓊等(2014)分別對食蟹猴和獼猴卵母細胞進行了玻璃化冷凍保存研究，解凍后對生發(fā)泡期(GV)、減數(shù)分裂中期Ⅰ(MⅠ)和中期Ⅱ(MⅡ)階段食蟹猴卵母細胞的冷凍保存分別獲得了87.5%、78.3%和83.3%的存活率，對相同階段獼猴卵母細胞的冷凍保存分別獲得了83.4%、89.2%和76.9%的存活率。本方法采用DMSO和EG為冷凍保護劑，玻璃化程序是先把卵在含有7.5%DMSO和7.5%EG(v/v，以培養(yǎng)液配制)的平衡液內(nèi)平衡5 min，然后將卵轉(zhuǎn)入含有15% DMSO、15% EG和0.5 mol/L蔗糖的冷凍液內(nèi)孵育30~60 s，最后將卵裝載于開放載體上，并直接迅速浸入液氮進行玻璃化冷凍保存。解凍程序是把開放的卵載體從液氮取出后，直接浸入37℃的含有1 mol/L蔗糖的解凍液內(nèi)孵育1 min，然后在室溫0.5 mol/L蔗糖液內(nèi)孵育3~4 min進行恢復，最后在室溫的培養(yǎng)液內(nèi)孵育8~10 min。目前在舊大陸非人靈長類動物尚無采用冷凍保存的卵進行體外受精的研究報道。

對舊大陸猴胚胎冷凍保存和胚胎移植的研究最先在狒狒(分裂階段胚胎和囊胚)和食蟹猴(4~8細胞階段胚胎)獲得成功(Popeet al.,1984,1986;Balmacedaet al.,1986)。狒狒胚胎通過自然交配和非手術性生殖道沖洗法獲得，冷凍保護劑為1.4 mol/L甘油，冷凍方法為慢速冷凍，即在甘油冷凍液內(nèi)進行室溫平衡后，將胚胎裝載入0.25 mL冷凍麥管內(nèi)，然后以每分鐘2℃的速率從室溫逐漸降至-7℃，人工植冰后，再以每分鐘0.3℃~0.5℃冷卻至-30℃，最后浸入液氮保存。解凍方法是先在20℃水內(nèi)解凍，然后在含有0.5 mol/L蔗糖和牛血清白蛋白(BSA)的磷酸鹽緩沖液(PBS)內(nèi)于室溫培養(yǎng)5~10 min進行水化復蘇。解凍后存活的8細胞階段胚胎在被移植到性皮膚開始消腫3 d后的狒狒子宮內(nèi)后，獲得了33.0%懷孕率(Popeet al.,1986)。采用1.5 mol/L DMSO及與狒狒胚胎相似的冷凍和解凍方法，食蟹猴4~8細胞階段胚胎在冷凍保存和解凍后獲得了70.0%的存活率，并且胚胎在移植到同步發(fā)情的受體后獲得33.3%的懷孕率(Balmacedaet al.,1986)。

冷凍保護劑1,2-丙二醇(1,2-propanediol,PROH)和慢速冷凍法也被成功用于冷凍保存食蟹猴的2~8細胞階段的胚胎，冷凍保存后胚胎的存活率達82.0%(Curnowet al.,2002)。方法是把胚胎先在含有1.5 mol/L PROH的平衡液內(nèi)于室溫培養(yǎng)10 min，然后轉(zhuǎn)入含有1.5 mol/L PROH和0.1mol/L蔗糖的冷凍液內(nèi)，并裝入冷凍麥管。密封麥管后，把樣品在程控冷凍液內(nèi)降溫，使其以每分鐘2℃降至-6℃，然后植冰，進而以每分鐘0.3℃降至-40℃，最后轉(zhuǎn)入液氮保存。解凍方法是把冷凍麥管從液氮取出后，在空氣中停滯10 s，然后在37℃水浴內(nèi)孵育10 s，接著把胚胎從麥管轉(zhuǎn)入含有1.0 mol/L PROH和0.2 mol/L蔗糖的PBS+BSA內(nèi)室溫培養(yǎng)5 min，然后依次分別在含有0.5 mol/L PROH和0.2 mol/L蔗糖的PBS+BSA內(nèi)培養(yǎng)5~10 min，達到逐步復水和復蘇的目的。

對獼猴和食蟹猴的研究還發(fā)現(xiàn)，分裂期的胚胎和囊胚也可以采用玻璃化方法進行冷凍保存。食蟹猴分裂期(4~8細胞階段)胚胎通過玻璃化保存和解凍后，存活率為95.0%，并且存活的胚胎在經(jīng)過體外培養(yǎng)和胚胎移植后獲得了29.2%的懷孕率，并從7只懷孕母猴獲得了3個健康幼仔(Yamasakiet al.,2011)。所采用的胚胎玻璃化的平衡液和冷凍液的配方以及玻璃化步驟與上述獼猴和食蟹猴卵母細胞的玻璃化方法近似(黃璋瓊等，2014)，即平衡液為7.5% DMSO+7.5% EG(v/v)，冷凍液為15% DMSO+15% EG+0.5 mol/L蔗糖，冷凍載體為開放的Cryotop聚丙烯條(Yamasakiet al.,2011)。

囊胚由于具有含有大量水分的囊胚腔，在冷凍過程中容易結(jié)冰，因此需要在冷凍前進行囊胚腔脫水。囊胚腔脫水可通過機械穿刺或滲透性脫水來完成。在獼猴囊胚的研究發(fā)現(xiàn)(Yeomanet al.,2001)，囊胚先后在平衡液A(1.36 mol/L甘油)和平衡液B(1.36 mol/L甘油+2.7 mol/L EG)內(nèi)于室溫平衡3 min，然后在含有3.4 mol/L甘油和4.5 mol/L EG的冷凍液內(nèi)停留25 s，最后把胚胎裝載于開放載體上，并快速、直接地浸入液氮，采用此玻璃化方法冷凍保存的囊胚在解凍后獲得了85.0%的成活率和71.0%的孵化率。

3 巨猿類種質(zhì)冷凍保存

巨猿類動物是最高等非人靈長類，與人類親緣關系最近，包括長臂猿屬(Hylobates)、猩猩(Pongo pygmaeus)、大猩猩(Gorilla gorilla)、黑猩猩(Pan troglodytes)和倭黑猩猩(Pan paniscu)等，主要分布于非洲、南亞和東南亞(Rylands and Mittermeier,2014)。由于本類群動物分布范圍小和數(shù)量極少，種質(zhì)冷凍保存研究的報道極其有限，且僅限于精子的冷凍保存。對黑猩猩精子的研究發(fā)現(xiàn)，含有7.8%甘油和15%(v/v)熱滅活人臍帶血清的Ham’s F10培養(yǎng)液是良好的精子冷凍液。精子在此冷凍液內(nèi)于4℃冷卻30 min后，進行程控慢速冷凍，使樣品先以每分鐘-5℃的冷卻速率從4℃緩慢降至-30℃，然后以每分鐘-25℃的冷卻速率從-30℃快速降至-100℃，最后直接浸入液氮保存。解凍后精子活力恢復率達70.0%，并且采用冷凍保存的精液進行人工授精，成功地使兩只雌性黑猩猩懷孕(Gould and Styperek,1989)。

對白掌長臂猿(Hylobates lar)精液的冷凍保存研究發(fā)現(xiàn)，TEST+20%雞蛋黃+5%甘油(v/v)對精液的冷凍保存效果較好，冷凍方法和上述獼猴及食蟹猴精子的冷凍方法近似，即先將精液懸浮在TEST+20%雞蛋黃內(nèi)，在2 h內(nèi)將樣品溫度由室溫逐漸降至4℃，后加入5%甘油，把樣品裝載入冷凍容器，接著放在液氮面上方5 cm處的液氮蒸汽內(nèi)快速冷凍10 min，最后浸入液氮保存。冷凍保存的精子在解凍后具有25.0%~35.0%的活力，與新鮮精子60.0%~75.0%的活力相比，恢復率為40.0%~58.0%(Takasuet al.,2016)。

和其他非人靈長類動物一樣(除大猩猩外)，巨猿類動物的精液在射精后變成凝膠狀固體(Kinoshitaet al.,2021)，因此阻礙精子的制備過程。最近的研究發(fā)現(xiàn)，用0.1%(w/v)Ⅰ型膠原酶處理猩猩和黑猩猩的凝固精液后可以將不少精子從中釋放出來，并且這種處理不影響精子活力，也不會刺激精子自發(fā)地獲能和頂體反應，因此，應用Ⅰ型膠原酶處理精液凝塊是獲得精子的有效方法(Yuet al.,2018)。早期的研究發(fā)現(xiàn)蛋白酶處理獼猴、狒狒、黑猩猩等動物的精液凝塊雖然有助于獲得精子，但蛋白酶處理會損傷精子(Gould and Styperek,1989;Morrell and Hodges,1998)。

4 睪丸組織冷凍保存

最近在年幼獼猴的研究發(fā)現(xiàn)，睪丸組織在冷凍保存和自體移植后，移植的睪丸組織具有精子發(fā)生的能力，并且產(chǎn)生的精子可以使卵受精和發(fā)育成健康后代(Fayomiet al.,2019)，充分表明睪丸組織冷凍保存是保存物種遺傳物質(zhì)和生育力的重要途經(jīng)之一。對于意外死亡的性成熟雄性非人靈長類動物，可以從附睪中采集精子進行冷凍保存，也可以從睪丸采集精子或早期階段的生殖細胞(Silvaet al.,2020)。睪丸精子可以在分離后進行冷凍保存，也可以組織碎片的形式進行冷凍保存，并且后者可以一同保存精原干細胞及其增殖和分化所需要的體內(nèi)微環(huán)境，有利于組織移植后生育力的迅速恢復或再生(Baertet al.,2018;Shettyet al.,2018,2020)。睪丸精子細胞可以通過ICSI技術使卵受精，而睪丸組織可以通過組織移植或體外精子發(fā)生的方法達到生殖目的(Honaramoozet al.,2004;Hermannet al.,2012)。由于性成熟前雄性動物尚無精子發(fā)生，附睪和睪丸內(nèi)不存在精子細胞，因此只能通過冷凍保存含有精原干細胞(spermatogonial stem cells,SSC)的睪丸組織才能達到保存遺傳物質(zhì)和種質(zhì)的目的(Huleihel and Lunenfeld,2020)。

對食蟹猴的研究發(fā)現(xiàn)，睪丸組織冷凍保存較細胞懸液的冷凍保存效果好，組織冷凍保存后的細胞存活度為46.0%±4.8%，而細胞懸液冷凍保存后的細胞存活度只有33.7%±6.0%(Junget al.,2020)。細胞懸液冷凍保存雖然可以繞過組織冷凍保存遇到的熱量和質(zhì)量交換障礙，然而，細胞懸液的獲得一般需要進行酶處理、機械分離和離心等，這均可能造成細胞損傷，影響后續(xù)的冷凍保存和復蘇效果(Schneideret al.,2015)。

研究發(fā)現(xiàn)，睪丸組織冷凍保存的方法以慢速冷凍較好，已經(jīng)應用的冷凍保護劑包括DMSO、EG、甘油、蔗糖和海藻糖等。對獼猴的研究發(fā)現(xiàn)，性成熟前幼猴睪丸組織碎片在含有1.4 mol/L DMSO或EG的冷凍液內(nèi)被成功進行慢速冷凍保存，解凍的睪丸組織被移植到免疫缺陷型小鼠皮下后，可發(fā)生組織增生和細胞分化，形成生殖細胞(Jahnukainenet al.,2007)。研究還發(fā)現(xiàn)，慢速冷凍保存的性成熟前幼猴睪丸組織碎片在通過自體移植方法移植到去勢的性成熟獼猴背部或陰囊皮下后，移植的睪丸組織細胞能夠迅速生長和分化、再生睪酮分泌和精子發(fā)生功能(Fayomiet al.,2019)。慢速冷凍采用的冷凍液為含有5% DMSO和5%胎牛血清(v/v)的MEMα培養(yǎng)液，樣品先在4℃平衡30 min，然后在程控冷凍儀內(nèi)以每分鐘-1℃的冷卻速率從4℃降至0℃，接著以每分鐘-0.5℃從0℃降至-8℃，在此溫度下進行人工植冰，然后以每分鐘-0.5℃降至-40℃，接著以每分鐘-1.5℃從-40℃降至-80℃，最后快速浸入和保存于液氮內(nèi)(Fayomiet al.,2019)。最近對青春期前食蟹猴睪丸組織的慢速冷凍研究發(fā)現(xiàn)，含有1.4 mol/L DMSO和0.2 mol/L海藻糖的冷凍液比只含有1.5 mol/L DMSO的冷凍液的冷凍保存效果好，前者冷凍保存和解凍后培養(yǎng)的睪丸組織內(nèi)生殖細胞的細胞數(shù)量為(2.4±0.6)×106/g，而后者冷凍保存和解凍后培養(yǎng)的睪丸組織內(nèi)生殖細胞的數(shù)量只有(1.1±0.3)×106/g(Junget al.,2020)。

以10%~20%(v/v)DMSO為冷凍保護劑，慢速冷凍法還被用于山魈(Mandrillus sphinx)、黑猩猩和白頭狨猴(Callithrix geoffroyi)的睪丸組織冷凍保存，發(fā)現(xiàn)這3種動物性成熟的睪丸組織在冷凍保存和解凍后，均能表達精子細胞特有的PRM2和TNP1蛋白質(zhì)(Pothanaet al.,2016)。睪丸組織冷凍保存的另外一個方法是玻璃化。早期對獼猴的研究發(fā)現(xiàn)，玻璃化方法可對幼猴睪丸組織的結(jié)構以及精母細胞和支持細胞(Sertoli細胞和Leydig細胞)的結(jié)構和功能進行有效地冷凍保存(Poelset al.,2012)，但是如上所述，近年來對非人靈長類動物睪丸組織冷凍保存的研究主要采用的是慢速冷凍方法，另外在人類中獲得的不少研究結(jié)果也顯示慢速冷凍較玻璃化能更好地保存睪丸組織的結(jié)構和功能(Moravejiet al.,2019)。

5 卵巢組織冷凍保存

卵巢組織冷凍保存已經(jīng)在人類、非人靈長類和其他哺乳動物類群中證明是行之有效的保存遺傳物質(zhì)和生育力的方法(Dolmanset al.,2021;Bhat and Sofi,2021)，并且對青春期前雌性和需要立即進行化療的成年婦女癌癥患者來說，卵巢組織冷凍保存是生育力保存的唯一方法(Leeet al.,2004,2017;Devi and Goel,2016;Ladanyiet al.,2017;Pampaniniet al.,2020)。冷凍保存的卵巢組織將來可以通過自體移植恢復生育能力，也可以通過卵泡體外激活(IVA)或卵母細胞體外成熟(IVM)等方法在體外生產(chǎn)卵子，達到生殖目的。卵巢組織冷凍保存的策略主要集中在對卵巢皮質(zhì)內(nèi)眾多原始卵泡的原位保存，這樣使原始卵母細胞及其周圍細胞和組織構成的微環(huán)境一并得到冷凍保存。與成熟的卵母細胞相比，原始卵母細胞在體積上小3~4倍，更適合冷凍保存(Dolmanset al.,2021)。一些研究還認為小鼠、食蟹猴和人類等卵巢內(nèi)存在雌性生殖干細胞或卵原干細胞(Oogonial stem cells)，但目前對其是否存在仍具有爭議(Whiteet al.,2012;Wagneret al.,2020;Liet al.,2022)。

和人類卵巢組織的冷凍保存方法一樣(Ladanyiet al.,2017;Kometaset al.,2021)，非人靈長類動物卵巢組織冷凍保存的有效方法是玻璃化方法，包括快速冷凍和超快速冷凍。對成年獼猴卵巢皮層組織的快速冷凍研究發(fā)現(xiàn)，冷凍液VEG(27% EG+27%甘油，w/v)對原始卵泡和初級卵泡形態(tài)和功能的冷凍保存效果較冷凍液VED(25.5% EG+25.5% DMSO，w/v)好，且用VEG冷凍保存的卵巢組織在體外3D培養(yǎng)6周后能與新鮮卵巢組織一樣存活、生長和分泌雌二醇與孕酮(Tinget al.,2013)。對成年狒狒卵巢組織的玻璃化研究發(fā)現(xiàn)，卵巢組織在26%(w/v)EG和1 mol/L蔗糖的存在下可在較低濃度DMSO(10%,w/v)的冷凍液內(nèi)進行有效的玻璃化冷凍，冷凍保存的卵巢組織在自體移植后可恢復卵泡的生存、生長和內(nèi)分泌功能(Amorimet al.,2013,2019)。采用同樣的冷凍液和玻璃化方法，食蟹猴卵巢組織也得到了良好的保存(Dolmanset al.,2015)。在膜非通透性冷凍保護劑蔗糖或海藻糖的存在下，采用較低濃度的膜通透性冷凍保護劑進行玻璃化保存，有利于降低冷凍液的細胞毒性。

對食蟹猴的研究發(fā)現(xiàn)，卵巢組織在玻璃化保存后進行自體移植，卵巢的功能可以得以恢復(Suzukiet al.,2012)。該研究采用含有20%血清替代品補充劑(Serum Substitute Supplement,SSS)、5.64 mol/L EG、5%(w/v)聚乙烯吡咯烷酮(PVP，分子量360 kDa)和0.5 mol/L蔗糖的H199培養(yǎng)液做為冷凍液。卵巢皮層碎片尺寸為1 mm×1 mm×1 mm，在玻璃化冷凍前分三步在室溫進行平衡，即先在含20%SSS和1.61 mol/L EG的平衡液內(nèi)孵育10 min，進而在含有20% SSS和3.22 mol/L EG的平衡液內(nèi)孵育10 min，然后在冷凍液內(nèi)平衡5 min。把樣品裝入0.5 mL冷凍麥管內(nèi)并密封后，直接浸入液氮冷凍保存。解凍在35℃~37℃下進行，并分別在含有0.8 mol/L、0.4 mol/L和0.0 mol/L蔗糖的H99培養(yǎng)液內(nèi)逐步進行復水和復蘇。

對新生普通狨猴卵巢玻璃化冷凍保存的初步研究發(fā)現(xiàn)，常用的人類卵玻璃化冷凍方法也可以有效地冷凍保存卵巢組織內(nèi)的卵母細胞(Motohashi and Ishibashi,2016)。具體方法是把幼小的卵巢(長軸2.8 mm±0.1 mm，短軸1.2 mm±0.1 mm)清洗后，先在含有7.5% EG、7.5% DMSO和20%SSS的HEPES-TCM199培養(yǎng)液內(nèi)室溫孵育15 min，然后在含有15% EG、15% DMSO和0.5 mol/L蔗糖的HEPES-TCM199培養(yǎng)液內(nèi)于4℃孵育30 min，最后裝載到Cryotop上直接浸入液氮進行冷凍保存。解凍方法是把Cryotop從液氮中取出后，快速浸入37℃的含有1 mol/L蔗糖的HEPES-TCM199培養(yǎng)液內(nèi)孵育10 min。

6 總結(jié)和展望

原猴動物主要分布于非洲和亞洲南部熱帶地區(qū)，包括各種狐猴、懶猴、嬰猴科(Galagidae)和眼鏡猴等類群，約150種，其中狐猴亞目全部90多種僅分布在馬達加斯加島及其附近小島(Rylands and Mittermeier,2014；中國野生動物保護協(xié)會，2020)。雖然不少原猴動物處于瀕危狀態(tài)(Aslamet al.,2002;Chatfieldet al.,2007)，但目前對這些非人靈長類動物種質(zhì)保存和輔助生殖的研究基本仍屬空白。

野生巨猿類是最瀕危的非人靈長類動物，但由于其生存高度依賴森林環(huán)境、分布范圍狹小和數(shù)量極少，對其種質(zhì)冷凍保存的研究極其有限。由于巨猿類動物與人類親緣關系最近，因此人類精子、卵子、胚胎和性腺組織冷凍保存的研究成果應該對巨猿類最具有借鑒意義?，F(xiàn)在的關鍵是需要進一步重視種質(zhì)的保存，建立冷凍保存實驗室和保存設施，并配備熟練掌握種質(zhì)冷凍保存的科技人員進行生殖材料的冷凍保存。特別是要建立精液采集和冷凍保存的方法和技術條件，并注意從死亡動物的附睪中獲得和冷凍保存精子。另外，還要及時采集死亡動物的睪丸和卵巢，并對之進行冷凍保存。

迄今為止，對非人靈長類動物種質(zhì)冷凍保存的研究主要集中于舊大陸猴的獼猴、食蟹猴和狒狒以及新大陸猴的狨猴、松鼠猴和卷尾猴等，而且主要限于精子和生殖腺組織的冷凍保存，對成熟卵母細胞冷凍保存的研究很少。精子冷凍保存長期以來一直是遺傳資源和生育力保存及輔助生殖的重要策略，盡管在非人靈長類精子冷凍保存方面取得了廣泛進展，但目前尚未被廣泛用于促進非人靈長類動物的種群繁殖和對遺傳資源多樣性的長期保存，重要原因是冷凍保存后精子活力仍然顯著下降，特別是狨猴和松鼠猴精子的冷凍保存效果最差(Oliveiraet al.,2015,2016;Arakakiet al.,2019a)，因此需要進一步研究不同類群非人靈長類動物精子的生殖生物學和冷凍生物學特性，改進冷凍方法和提高冷凍保存的效率。

冷凍保存需要克服的主要困難是細胞和組織對低溫損傷的脆弱性，這取決于細胞或組織的大小和種類、細胞膜的結(jié)構組成及對水和冷凍保護劑的滲透性、細胞對滲透壓和溫度變化速率的耐受性，以及冷凍保護劑的細胞毒性等。高濃度的通透性低溫保護劑具有一定的細胞毒性，并且毒性大小與其濃度、暴露時間和溫度呈正相關(Pegg,2015;Fahy and Wowk,2021)。低溫保存過程的不同階段對細胞會造成多種不利影響或傷害，如冷休克、滲透性休克、結(jié)冰、溶液效應和氧化應激等?；罨跏羌毎粑漠a(chǎn)物，如O2-、H2O2和OH-等，正常情況下產(chǎn)生的活化氧是細胞功能所需要的，但在逆境條件下細胞可產(chǎn)生和積累過量的活化氧，因而造成細胞結(jié)構和機能的損傷。大量對人類、嚙齒類和其他哺乳動物的研究已經(jīng)證明，精子的低溫保存過程伴隨著線粒體損傷、抗氧化系統(tǒng)的破壞和活化氧的積累，因此氧化損傷是導致精子低溫損傷的重要原因之一(Chatterjee and Gagnon,2001;Thomsonet al.,2009;Gadeaet al.,2011)。獼猴精子冷凍可導致活化氧濃度的顯著升高(McCarthy and Meyers,2011)，因此在冷凍液中添加抗氧化劑如維生素E等有益于精子活力的冷凍保護，特別是對質(zhì)量較差和對冷凍損傷敏感的精子樣品的冷凍保護作用更加明顯(Donget al.,2010)，但是迄今為止對抗氧化劑在非人靈長類動物精子冷凍保存過程中的保護作用的研究很少，需要進一步探索不同種類和劑量的抗氧化劑對不同非人靈長類動物精子的冷凍保護作用，并借鑒在人類和其他哺乳動物中已經(jīng)獲得的有關抗氧化劑冷凍保護精子的研究成果(Liet al.,2014;Karimfaret al.,2015;Amidiet al.,2016;Shiet al.,2018)。

除了精子活力、存活度和頂體結(jié)構等的保護外，冷凍保存還必須高度重視對精子遺傳物質(zhì)的保護。對獼猴、人類和小鼠等的研究顯示，目前的精子冷凍保存技術可以使一些精子的DNA受到損傷，進而造成胚胎發(fā)育率低、著床失敗、流產(chǎn)或使后代的健康受到影響(Liet al.,2007;Ziniet al.,2008;Cankutet al.,2019;Li and Lloyd,2020)。對小鼠和人類的研究還發(fā)現(xiàn)，精液或附睪中精子的數(shù)量、形態(tài)和活力與精子DNA損傷程度呈高度直線負相關(Li and Lloyd,2020)，且質(zhì)量差的精子的DNA更容易在冷凍保存過程中受到損傷(Lopeset al.,2021)。

雖然精子保存是種質(zhì)保存最方便和最有效的方法，卵子和胚胎的冷凍保存也是重要的遺傳物質(zhì)和生育力保存的方法，對物種保護、保存和輔助生殖必不可少。目前雖然非人靈長類動物胚胎的冷凍保存方法已經(jīng)成熟，但對非人靈長類動物卵的冷凍保存的研究尚處于起步階段，不過人類卵冷凍保存的研究成果可以做為借鑒。人類卵母細胞低溫生物學和冷凍保存的研究始于20世紀70年代，現(xiàn)在已經(jīng)在不育癥治療和生育力保存方面得到廣泛應用。人卵冷凍保存常用的方法是玻璃化超快速冷凍，冷凍保護劑包括DMSO、EG、蔗糖和海藻糖(Kuwayamaet al.,2005;Moussaet al.,2014;Picton,2018;Bhat and Sofi,2021)。目前人卵冷凍保存的最大問題是冷凍保存過程本身導致的透明帶提早硬化(premature zona hardening)，從而阻止精子穿過透明帶，因此卵在冷凍保存和解凍復蘇后無法用常規(guī)的體外受精方法使其高效受精，不得不借助ICSI達到受精的目的(Moussaet al.,2014；石曉衛(wèi)等，2019)，因此需要深入研究卵在冷凍保存過程中透明帶提前硬化的機制和防御對策。

動物的多樣性決定了各類群和各物種生殖生物學、生理學和冷凍生物學的多樣性(Hildebrandtet al.,2021)，因此，為了更好地開展非人靈長類動物種質(zhì)保存工作，亟需加強對各種非人靈長類動物生殖生物學、生理學和生殖材料冷凍生物學的基礎研究(Bhat and Sofi,2021)。只有了解了各種動物的生殖季節(jié)性規(guī)律，才能在最佳的季節(jié)和時間采集冷凍保存所需要的高質(zhì)量精子、卵子、胚胎和生殖腺組織。只有在了解各種動物發(fā)情規(guī)律和排卵周期的情況下才能建立刺激卵泡發(fā)育和達到超數(shù)排卵的最佳效果。另外，只有在分別建立了各種動物精子、卵子和胚胎理想的體外培養(yǎng)條件和方法的情況下，才能將獲得的珍貴材料進行科學有效的處理和培養(yǎng)，進而達到冷凍保存高質(zhì)量種質(zhì)的目的。此外，了解和建立各種動物精子獲能和體外受精(IVF)的條件和方法后，才能有效地進行IVF或ICSI，生產(chǎn)冷凍保存所需要的胚胎。當然，非人靈長類動物種質(zhì)保存、輔助受精和生殖生物學的研究和應用還需要更多的科技人員和經(jīng)費的投入。