郭敏梁捷何向陽歐偉新彭定雄麥展昭黃海濤,3*張禮標*

（1廣東省科學院動物研究所，廣東省動物保護與資源利用重點實驗室，廣東省野生動物保護與利用公共實驗室，廣州 510260）（2澳門市政署，澳門特別行政區(qū) 999078）（3廣東科建生物技術有限公司，廣州 510260）

預防鼠患是保障農(nóng)業(yè)及城市健康發(fā)展的一項重要工作(石杲，2003；孟慶云，2003)。在鼠患預防中，抗凝血滅鼠劑在全球使用量最大，共歷經(jīng)了兩代(陳心堯，1992；劉剛和曾虹，2002)，溴鼠靈(brodifacoum)屬于第二代抗凝血滅鼠劑。溴鼠靈于1975年開始投入使用，藥效比第一代抗凝血滅鼠劑強約100倍，能迅速殺死對一代藥和部分二代藥(如溴敵隆和鼠得克)有抗性的褐家鼠(Rattus norvegicus)(Buckleet al.,2012)，其毒性不僅限于凝血功能障礙(Bachmann and Sullivan,1983;Wareet al.,2015;Kalininet al.,2017)，也包括細胞損傷(Bakeret al.,2002;Gulet al.,2016)。由于溴鼠靈藥效強、田間試驗效果好，該藥物已在國內(nèi)外推廣使用了數(shù)十年。目前對溴鼠靈的研究主要集中在滅殺高效性(宋明亮等，2002；熊孟韜等，2003;Buckleet al.,2012；陳蔚恩等，2016)和生物安全性(Easonet al.,2002;Ayalaet al.,2007;Geduhnet al.,2014;Alomaret al.,2018;Waltheret al.,2021)等方面，但對其長期使用是否造成鼠類抗藥性的進化，尤其是維生素K環(huán)氧化物還原酶復合體亞單位1(vitamin K-epoxide reductas complex 1,Vkorc1)基因核苷酸改變的相關研究還比較缺乏。

澳門地區(qū)已使用溴鼠靈近25年，為調查鼠類對溴鼠靈抗藥性進化提供了良好模型。本研究擬結合生理抗性檢測和Vkorc1基因突變檢測來探查澳門地區(qū)褐家鼠對溴鼠靈的抗性及進化，試圖通過該研究為鼠類對溴鼠靈抗藥性的發(fā)生和發(fā)展提供理論依據(jù)，引導溴鼠靈的安全使用，更好地預防鼠患。生理抗性檢測參考全國鼠類抗藥性監(jiān)測協(xié)作組的致死期食毒法(LFP)開展(鼠類抗藥性監(jiān)測協(xié)作組，1991；張濤和吳明壽，2007)。例如陳戊申等(2007)使用LFP法進行溴鼠靈的滅殺效果評價，發(fā)現(xiàn)毒餌消耗的高峰期在第3天，總消耗量超過12 mg/kg(毒餌/體重)，但死亡高峰期在第6天。在有統(tǒng)計學意義的個體數(shù)量中，LFP法檢測到的抗性鼠若占比超過15%，則認為該地區(qū)該種鼠群對所用滅鼠藥已產(chǎn)生抗性(鼠類抗藥性監(jiān)測協(xié)作組，1991)。此外，結合Vkorc1基因突變檢測，可對鼠類抗藥機理及抗性關聯(lián)進化進行深入挖掘。例如對黃胸鼠(Rattus flavipectus)和褐家鼠進行生理抗性測試實驗(華法林)和Vkorc1基因突變檢測，發(fā)現(xiàn)了抗性鼠以及與抗性有顯著關聯(lián)的Vkorc1基因突變位點(褚敏捷等，2018)。姚丹丹等(2019)亦通過生理抗性測試實驗(殺鼠靈)和Vkorc1基因突變檢測，發(fā)現(xiàn)了黃毛鼠(Rattus losea)抗性種群及12個Vkorc1基因突變位點，但這些突變位點與生理抗性測試結果無顯著相關性。前人研究揭示，褐家鼠Vkorc1基因的外顯子中至少有8個位點與抗藥有關聯(lián)，其中Y(Tyr)139C(Cys)的突變與兩代滅鼠藥的抗性關聯(lián)最強(Rostet al.,2009;Buckleet al.,2012;Mooneyet al.,2018)。而且隨著鼠種的不同，Vkorc1基因發(fā)生抗性突變的位點和方式也不同(Rostet al.,2009；王智泉等，2014；褚敏捷等，2018)。

1 研究方法

1.1 研究對象

研究對象為澳門地區(qū)捕捉到的61只褐家鼠，捕捉方法為籠捕法，對捕捉到的全部褐家鼠個體進行稱重、性別鑒別以及編號。選擇體重≥80 g的44只健康成年鼠(34只捕獲于澳門紅街市，10只捕獲于澳門營地街市)進行生理抗性檢測。剔除實驗前死亡、不滿足實驗條件和實驗期間產(chǎn)仔的個體，最后完成生理抗性檢測的褐家鼠個體為35只，其中雌鼠11只，雄鼠24只。此外，對全部61只褐家鼠進行Vkorc1基因序列多態(tài)性檢測。

1.2 褐家鼠生理抗性檢測

于2019年12月2日至14日對捕獲于澳門紅街市(34只)和營地(10只)的褐家鼠，參照LFP法進行生理抗性檢測實驗。

具體步驟依次為：(1)適應期喂養(yǎng)。將實驗鼠單籠分裝，開展4 d的適應期喂養(yǎng)，即投喂無毒的番薯塊和足量的純凈水。(2)毒餌制備及食毒期喂養(yǎng)。將澳門地區(qū)當前主要投放的第二代滅鼠藥TALON(廠家：Syngenta；有效成分：brodifacoum)與番薯塊按0.005%(質量比：w/w)混合拌勻來制備毒餌。每天供應充足的毒餌(≥40 g)和足量的純凈水，持續(xù)6 d，記錄實驗鼠個體當日毒餌消耗量(測算方法見下)。淘汰食毒期第一天毒餌消耗量不及前一天無毒餌料消耗量1/10的個體。再根據(jù)每日實驗鼠食毒量和體重比值的均值，淘汰當天毒餌消耗量異常的個體。若食毒期個體死亡，記錄死亡鼠的出血部位和死亡時間；對無出血表征的死亡鼠進行解剖，觀察有無內(nèi)出血。(3)觀察期喂養(yǎng)。將食毒期結束后的余存?zhèn)€體轉移至干凈鼠籠進行無毒喂養(yǎng)觀察，即喂食無毒番薯塊和足量的純凈水，持續(xù)14 d。若觀察期出現(xiàn)個體死亡，記錄死亡鼠的出血部位和死亡時間；對無出血表征的死亡鼠進行解剖，觀察有無內(nèi)出血。此外，淘汰實驗期間產(chǎn)仔的個體。

毒餌消耗量測算方法為：投放毒餌時在籠下鋪放干凈的紙，次日收集紙上的餌料(剔除糞便)，與籠內(nèi)剩餌一起稱量，來計算個體每日毒餌消耗量。

1.3 褐家鼠Vkorc1基因的突變檢測

2019年10—12月在澳門地區(qū)捕捉到61只褐家鼠(包括已完成生理抗性檢測實驗的44只褐家鼠)，取其肌肉和肝臟組織，分別保存于無水酒精和RNAlocker(廠家：生工)中。然后，利用Ezup柱式動物基因組DNA抽提試劑盒(廠家：生工)提取樣品的基因組DNA，再擴增Vkorc1基因片段，最后通過對擴增片段測序分析來檢測Vkorc1基因序列的核苷酸多態(tài)性。

由于鼠類Vkorc1基因全長約為2 800 bp，難以通過一對引物來擴增出全長片段。因此，參照Goulois等(2016)用兩對引物(兩對引物的擴增區(qū)間能覆蓋Vkorc1基因全部的3個外顯子區(qū))來分段擴增Vkorc1基因序列，以檢測Vkorc1基因外顯子區(qū)的核苷酸多態(tài)性。第一對引物目標擴增片段為Vkorc1基因的前1 105 bp(5′-3′方向)：正向引物序列 為rVKOR-S1(5′-GGTTCTTCCCTCTTGTGTCTG-3′)，反向引物序列為rVKOR-AS1(5′-GGGTCACCAAGACATGAGGTG-3′)；第二對引物目標擴增片段為Vkorc1基因的后1 335 bp：正向引物序列為rVKORC1-S2(5′-ACTT-GGGCAAGGCTCATGTG-3′)，反向引物序列為rVKORC1-AS2(5′-AAGAGTAGGGGACAAGGTG-GC-3′)。

PCR擴增條件：94℃3 min；94℃20 s，52℃20 s，68℃2 min(12個循環(huán))；94℃20 s，59℃20 s，68℃2 min(38個循環(huán))；68℃10 min；10℃30 min。PCR擴增產(chǎn)物電泳檢測的凝膠濃度為1.5%，上樣量為2 μL。最后使用ABI 3730XL測序儀對陽性PCR擴增產(chǎn)物進行雙向測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

通過計算實驗鼠個體的攝毒量與體重的比值，得到個體的單位體重攝毒量。然后分別按地點(紅街市、營地)和性別(雌、雄)對實驗鼠進行分組，對個體分組后的單位體重攝毒量數(shù)據(jù)，進行以下分析：(1)計算各組單位體重攝毒量，用平均值±標準誤(mean±SE)來表示；(2)分析組間單位體重攝毒量差異的顯著性。先通過R軟件的“ks.test”函數(shù)(One-sample Kolmogorov-Smirnov test)檢測各組數(shù)據(jù)是否呈正態(tài)分布，若P＞0.05則是正態(tài)分布；再通過R軟件的“var.test”函數(shù)(F-test)檢測分組數(shù)據(jù)是否方差齊性，若P＞0.05則方差齊性。對符合正態(tài)分布且方差齊性的分組數(shù)據(jù)，通過R軟件的“t.test”函數(shù)進行t-test分析，檢測組間差異的顯著性；對不符合正態(tài)分布且方差齊性的分組數(shù)據(jù)，則通過R軟件的“wilcox.test”函數(shù)分析來檢測組間差異的顯著性。

以NCBI數(shù)據(jù)庫中挪威褐家鼠的Vkorc1基因(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/309004)為參考基因，進行澳門褐家鼠Vkorc1基因外顯子核苷酸多態(tài)性分析。分析方法：通過SeqMan Pro將擴增得到的全部澳門褐家鼠Vkorc1基因序列與參考基因序列進行比對，比對后有差異的核苷酸Seq-Man Pro會自動以紅色標示出來。再以參考基因3個外顯子CDS的起止位置(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_051336.1?report=genbank&from=182502491&to=182505012&strand=true)為基準，界定澳門褐家鼠Vkorc1基因的外顯子區(qū)段。最后人工統(tǒng)計澳門褐家鼠Vkorc1基因與參考基因在外顯子區(qū)段有差異的核苷酸的位置、種類和頻次。

2 結果

2.1 褐家鼠生理抗性

生理抗性檢測的35只實驗鼠均在實驗期死亡。31只在食毒期死亡，剩余4只在觀察期首日死亡。雄鼠的平均致死時長為3.3 d，雌鼠為3.5 d。實驗前，雄鼠個體體重均值為248 g(86~406 g)，雌鼠個體為258 g(122~470 g)，雄鼠和雌鼠的平均攝毒量均高于12 mg/kg：雄鼠攝毒量2.02~35.03 mg/kg，平均為(15.69±1.59)mg/kg，雌鼠攝毒量0.17~31.43 mg/kg，平均為(14.39±2.93)mg/kg，總體平均攝毒量為(15.28±1.40)mg/kg。

此外，分別按地點和性別對實驗鼠分組后，組內(nèi)數(shù)據(jù)均不符合正態(tài)分布(One-sample Kolmogorov-Smirnov test,P＜0.05)，故采用Wilcoxon方法檢驗組間差異顯著性，結果顯示組間溴鼠靈的平均攝毒量均無顯著差異(地點間：P=0.254 7；性別間：P=0.687 3)(圖1)。

圖1 澳門地區(qū)不同地點、性別褐家鼠的攝毒量.圖中圓點代表實驗鼠個體.縱坐標表示個體在食毒期內(nèi)的單位體重攝毒劑量(mg/kg).通過Wilcoxon方法檢驗按地點或性別分組的褐家鼠組間平均攝毒量差異的顯著性Fig.1 Variations in brodifacoum intake among R.norvegicus grouped by gender and living site from Macao.Solid dots denote rat individuals.The Y-axis shows individual brodifacoum intake per weight(mg/kg)after LFP test.Significance of the difference between genders or living sites was detected by Wilcoxon method

2.2 褐家鼠Vkorc1基因外顯子核苷酸多態(tài)性

2.2.1 褐家鼠Vkorc1基因外顯子序列擴增

用兩對引物對全部61只褐家鼠Vkorc1基因的外顯子區(qū)段進行擴增，結果顯示，第一對引物(rVKOR-S1、rVKOR-AS1，擴 增Vkorc1基 因 前1 105 bp序列)的擴增效果明顯比第二對引物(rVKORC1-S2、rVKORC1-AS2，擴增Vkorc1基因后1 335 bp序列)好：第一對引物成功擴增出57只(93%)褐家鼠Vkorc1基因的前1 105 bp序列，其中55只在正向和反向引物上均測序成功；第二對引物僅成功擴增出20只(33%)褐家鼠Vkorc1基因的后1 335 bp序列，其中13只在正向和反向引物上均測序成功。最終，58只(95%)褐家鼠的Vkorc1基因被擴增到陽性條帶，但僅12只兩對引物均能成功擴增和測序。3只褐家鼠的Vkorc1基因兩對引物均無擴增條帶(表1)。

表1 Vkorc1基因片段陽性擴增子測序成功的褐家鼠個體數(shù)Table 1 Number of R.norvegicus successfully sequenced after positive amplification of Vkorc1 gene fragments

2.2.2Vkorc1基因外顯子核苷酸多態(tài)性

鼠類Vkorc1基因有3個外顯子，共表達161個氨基酸(aa)。本研究中，褐家鼠Vkorc1基因的3個外顯子區(qū)均能被成功擴增序列所覆蓋，但由于兩對引物的擴增成功率有較大差異，從而表現(xiàn)出有的外顯子區(qū)段覆蓋次數(shù)多，有的則少。通過與NCBI數(shù)據(jù)庫中挪威褐家鼠Vkorc1基因的外顯子編碼序列(CDS)比對，澳門褐家鼠Vkorc1基因的外顯子編碼序列僅2個核苷酸位點有差異，且均為同義突變，分別為：第68位氨基酸H(CAC)-H(CAT)(共有55只褐家鼠擴增到該核苷酸位點，突變發(fā)生率為100%)和第82位氨基酸I(ATA)-I(ATT)(共有55只褐家鼠擴增到該核苷酸位點，突變發(fā)生率為32.72%)。本研究發(fā)現(xiàn)，澳門地區(qū)褐家鼠個體的Vkorc1外顯子序列有很強的保守性，通過進一步整理，得到澳門褐家鼠Vkorc1基因3個外顯子編碼區(qū)(CDS)的保守(一致)核苷酸序列(161 aa)：第 一 外 顯 子 為ATGGGCACCAC CTGGAGGAGCCCTGGACGTTTGCGGCTTGCAC TATGCCTCGCTGGCCTAGCCCTCTCACTGTACG CACTGCACGTGAAGGCGGCGCGCGCCCGCAA TGAGGATTACCGCGCGCTCTGCGACGTGGGCA CGGCCATCAGCTGTTCCCGCGTCTTCTCCTCTC G；第二外顯子為GTGGGGCCGGGGCTTTGGG CTGGTGGAGCATGTGTTAGGAGCTGACAGCAT CCTCAACCAATCCAACAGCATTTTTGGTTGCAT GTTCTACACCATACAGCTGTTGTTAG；第 三 外顯子為GTTGCTTGAGGGGACGTTGGGCCTCT ATCCTACTGATCCTGAGTTCCCTGGTGTCTGTC GCTGGTTCTCTGTACCTGGCCTGGATCCTGTTC TTTGTCCTGTATGATTTCTGCATTGTTTGCATCA CCACCTATGCCATCAATGCGGGCCTGATGTTGC TTAGCTTCCAGAAGGTGCCAGAACACAAGGTC AAAAAGCCCTGA。

3 討論

澳門是世界上人口密度最高的地區(qū)之一，1995年后開始使用第二代抗凝血滅鼠劑?；诎拈T獨特的城市及發(fā)展背景，對該地區(qū)鼠類抗藥能力的調查能為鼠類對第二代抗凝血滅鼠劑抗藥性的發(fā)生和發(fā)展提供非常有價值的參考。本研究以澳門地區(qū)褐家鼠對溴鼠靈的抗藥性為切入點，通過生理抗性檢測和Vkorc1基因分子檢測相結合的方法，探索鼠群對溴鼠靈的抗藥發(fā)展。結果表明，澳門地區(qū)投放溴鼠靈近25年，沒有出現(xiàn)褐家鼠群體抗藥性，揭示該地區(qū)可繼續(xù)使用溴鼠靈滅鼠劑，但檢測到2個同義核苷酸突變，表明仍需要持續(xù)監(jiān)測抗藥性的發(fā)生和發(fā)展。

本研究使用的抗凝藥溴鼠靈問世于1975年，藥效比第一代抗凝血滅鼠劑強，鼠類食用后主要富集于肝臟，并能維持高濃度超過96 h。溴鼠靈對人類及與人類生活關聯(lián)密切的動物也有毒性(Breckenridgeet al.,1985;Booth,1989;Boermanset al.,1991;Easonet al.,2002;Ayalaet al.,2007;Geduhnet al.,2014;Booth and Mody,2016;Fitzgeraldet al.,2018)，而且還可以通過食物鏈進行傳播和累積(Easonet al.,2002;Ayalaet al.,2007;Geduhnet al.,2014;Alomaret al.,2018;Waltheret al.,2021)。這強調了全球化背景下對各地區(qū)溴鼠靈的使用監(jiān)管以及調查鼠類對溴鼠靈抗藥的必要性。

盡管溴鼠靈已在澳門地區(qū)投放近25年，本研究尚未發(fā)現(xiàn)抗溴鼠靈的褐家鼠，可能有以下3個主要原因。第一，溴鼠靈的強毒性。溴鼠靈對鼠類機體功能的破壞高效且致命(Buckleet al.,2012)，以致于溴鼠靈自問世以來歷經(jīng)了約45年的使用，國內(nèi)外仍沒有發(fā)現(xiàn)溴鼠靈抗性鼠的報道。第二，溴鼠靈的致病復雜性。除了凝血功能障礙，溴鼠靈還能造成鼠類多種生理機能損傷(Bachmann and Sullivan,1983;Bakeret al.,2002;Wareet al.,2015;Gulet al.,2016;Kalininet al.,2017)，關聯(lián)基因多，鼠類很難通過短時間的進化來產(chǎn)生全面抗性。第三，溴鼠靈并非澳門地區(qū)唯一使用的滅鼠藥，市區(qū)內(nèi)其他滅鼠藥的并行使用減緩了溴鼠靈對鼠群的選擇壓力。這點從Vkorc1基因的突變情況能有所反映：相比挪威褐家鼠，澳門褐家鼠的Vkorc1基因僅檢測到2個同義突變，且均發(fā)生在氨基酸密碼子的第三位，該位點本身就具有很強的擺動性。這兩個同義突變是否蘊含其他的進化生物學意義還有待挖掘。

由于溴鼠靈的致病復雜性以及無可參考的溴鼠靈抗性鼠Vkorc1基因，已發(fā)現(xiàn)的對第一代和部分二代(溴敵隆和鼠得克)抗凝血滅鼠劑有抗性的Vkorc1基因突變位點對溴鼠靈未必有效，反映出開展生理抗性檢測的重要性。本研究中，澳門地區(qū)褐家鼠雖然在食毒期及觀察期內(nèi)全部死亡，顯示出溴鼠靈滅殺的高效性，但總體平均攝毒量高達(15.28±1.40)mg/kg(高于12 mg/kg)。出現(xiàn)這種情況可能的原因包括：其一，溴鼠靈良好的適口性以及慢性發(fā)毒過程。國內(nèi)研究人員對褐家鼠和大白鼠進行0.005%溴鼠靈毒餌投喂實驗發(fā)現(xiàn)，盡管實驗鼠在4~7 d內(nèi)全部死亡，但均有很高(攝毒量均高于12 mg/kg)的毒餌消耗量(宋明亮等，2002；熊孟韜等，2003；陳蔚恩等，2016)，這也表明對食毒期內(nèi)溴鼠靈毒理過程的闡明是一個今后可挖掘的方向。其二，除上述原因以及Vkorc1基因突變之外的其他原因導致對溴鼠靈耐受的增強。例如研究人員對南通市有抗藥性的黃胸鼠、褐家鼠等家棲鼠Vkorc1基因的重要抗藥突變位點檢測，未發(fā)現(xiàn)氨基酸突變(王智泉等，2014)。類似結果也報道于廣東省抗性鼠的Vkorc1基因片段檢測中(姚丹丹等，2019)。這揭示了Vkorc1基因的其他位點、基因組其他基因(如細胞色素P450等)，以及生物遺傳差異等因素對鼠類抗藥能力也有重要影響(Endepolset al.,2013)。

致謝：感謝廣州市荔灣區(qū)海龍村梁錦松，以及廣東省科學院動物研究所李秋劍副研究員，劉炳榮、胡少芳助理研究員等在野外工作中給予的協(xié)助。