宋 宇,楊清海,曲貴偉

(遼東學院，遼寧 丹東 118003)

【研究意義】根際是指距離植物根系幾毫米寬的狹窄土壤區(qū)域，內(nèi)含細菌、真菌、古生菌等種類眾多的微生物及腐殖質等，植物根系分泌物可為根際微生物提供生長發(fā)育的營養(yǎng)物質；根際微生物能促進土壤中有機物質的分解,同時使土壤中的碳、氮、磷、硫等元素參與到農(nóng)作物的物質循環(huán)中并能抑制或減輕作物病害、逆境危害等，從而促進農(nóng)作物的生長發(fā)育和提高農(nóng)作物的產(chǎn)量[1-2]。水稻是我國最重要的糧食作物，過去幾十年中，由于引進高產(chǎn)品種、人為灌溉、大量使用化肥和農(nóng)藥，水稻產(chǎn)量有所增加[3-4]。但化肥和農(nóng)藥的過量使用會導致土壤酸化板結、溫室氣體排放增加、水體富養(yǎng)化等一系列生態(tài)環(huán)境問題[5-7]。如今，將農(nóng)作物和動物生產(chǎn)有效結合的復合種養(yǎng)模式受到人們廣泛關注。該模式不僅能提高養(yǎng)分循環(huán)效率而且能改善土壤生態(tài)環(huán)境[22]。研究表明，土壤微生物是維護稻田土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要成員，水稻在不同生育期的生長過程實質是土壤—微生物—水稻相互作用的過程[8-9]。水稻及其根系的生長代謝活動可改變土壤理化性質，土壤性質又可影響水稻及其根系的生長代謝，兩者的相互作用可調(diào)控土壤微生物群落結構和豐度的變化[10]。但河蟹對生物有機肥稻田不同生育期根際土壤微生物的群落結構影響的研究還屬少見?！厩叭搜芯窟M展】土壤微生物群落結構研究已由最初的傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法逐步發(fā)展到可高效、準確、快速獲取大量土壤微生物信息的高通量測序法。隨著高通量測序技術的發(fā)展，對常規(guī)種植的水稻的根際微生物群落的研究取得了一定進展[11]，目前已可全面分析菌群組成及群落結構的變化?！颈狙芯壳腥朦c】本研究采用高通量測序技術開展河蟹引入生物有機肥稻田后對不同生育期水稻的根際土壤細菌群落多樣性、豐度和群落結構影響的研究。【擬解決的關鍵問題】探討河蟹引入生物有機肥稻田后不同生育期水稻的根際土壤細菌群落多樣性指數(shù)、群落結構變化及門水平的優(yōu)勢類群、相對豐度及和土壤理化因子的冗余(RDA)分析，揭示水稻不同生育期土壤微生物動態(tài)變化及其影響因素，為探究復合種養(yǎng)模式水稻增產(chǎn)提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品采集和處理方法

本試驗選取越光大米為試驗材料，試驗在丹東東港市北井子鎮(zhèn)蓋家壩農(nóng)場進行，供試稻田為生物有機肥稻田和河蟹生物有機肥復合種養(yǎng)稻田，分別于水稻的分蘗期、拔節(jié)期、抽穗期和成熟期在稻田上隨機選取5個點采用破壞性取樣法將水稻整株挖出，勿傷害根系，抖落大塊土壤后用無菌刷取根際區(qū)域約5 mm緊密粘附在根表面的土壤，每5株為1個重復，每個時期3次重復?；旌虾蟮臉悠贩殖?份，1份裝入密封袋，帶回風干處理，用于理化指標分析；1份裝入50 mL離心管中，-80 ℃冷凍保存，用于微生物多樣性分析。生物有機肥稻田的分蘗期、拔節(jié)期、抽穗期和成熟期分別用YJTFN、YJTBJ、YJTCHS和YJTCS表示，河蟹有機肥稻田的4個生長時期則分別用HXTFN、HXTBJ、HXTCHS和HXTCS表示。

1.2 土壤理化因子的測定

土壤pH值采用酸度計法測定；有機質測定采用重鉻酸鉀氧化—分光光度法；速效鉀測定采用氯化鈣浸提—火焰光度計法；速效磷測定采用碳酸氫鈉浸提—鉬銻抗比色法；全氮測定采用凱氏定氮法[12]。

兩極化——中大型軟件平臺向行業(yè)化應用垂直深入，整合的功能和業(yè)務越來越豐富；中小型軟件平臺向輕量化應用演變，界面功能和交互操作越來越簡捷。這兩個看似矛盾的方向，根本上是為解決不同用戶的需求，本質上都是依托先進強大的底層架構。

1.3 土壤微生物DNA提取、擴增及測序

利用FastDNA?Spin Kit for Soil試劑盒進行土壤微生物基因組DNA提取，提取的DNA經(jīng)適當稀釋后在-20 ℃條件下保存用于后續(xù)PCR擴增。用通用引物338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′和806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′擴增細菌16S rRNA基因的V3～V4區(qū)，并利用Illumina公司的Miseq PE300平臺委托上海美吉生物對PCR擴增產(chǎn)物進行高通量測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理

如表3所示，Shannon、Ace和Chao 3種α多樣性指數(shù)分析顯示生物有機肥田成熟期的Shannon和Chao指數(shù)均高于前3個時期且差異顯著(P<0.05)。成熟期的Ace指數(shù)雖高于前3個時期但差異不顯著(P>0.05)。河蟹引入生物有機肥田后，分蘗期的Shannon指數(shù)高于生物有機肥田的分蘗期且差異顯著(P<0.05)，成熟期的Ace指數(shù)低于生物有機肥田的同一時期且差異顯著(P<0.05)。拔節(jié)和抽穗期的Ace、Chao指數(shù)分別高于生物有機肥田的同一時期但差異不顯著(P>0.05)。

2種稻田不同生育期的根際土壤通過高通量測序獲得的序列可分為55個門，174個綱，397個目，624個科，1071個屬，2292個種。將相對豐度<1%的菌門歸為其它類，則所有樣品中綠彎菌門(Chloroflexi，17.62%～28.44%)、放線菌門(Actinobacteriota，13.28%～25.53%)、變形菌門(Proteobacteria，12.35%～19.52%)、酸桿菌門(Acidobacteriota，9.28%～14.20%)在2種稻田不同生育期的根際土壤細菌群落中因占比最高而成為優(yōu)勢菌門。此外，樣品中還有脫硫桿菌門(Desulfobacterota)、擬桿菌門(Bacteroidota)、厚壁菌門(Firmicutes)、硝化螺旋菌門(Nitrospirota)、Myxococcota、芽單胞菌門(Gemmatimonadota)、MBNT15、髕骨菌門(Patescibacteria)和疣微菌門(Verrucomicrobiota)等(圖1)。在4種優(yōu)勢菌門中，生物有機肥稻田中放線菌門相對豐度值最高，河蟹引入生物有機肥稻田后，則綠彎菌門相對豐度值最高且在各時期的相對豐度值差異顯著。放線菌門的相對豐度值隨著水稻的生長發(fā)育逐步降低，成熟期最低，各個時期的相對豐度值差異顯著。此外，酸桿菌門在河蟹有機肥稻田的各個生長時期的相對豐度值均高于生物有機肥稻田且差異顯著。變形菌門在河蟹有機肥田的拔節(jié)期和抽穗期的相對豐度值都低于生物有機肥田，但到成熟期時則升至最高值但各個時期的相對豐度值差異不顯著。

2 結果與分析

2.1 2種稻田不同生育期根際土壤理化性質

通過RDA分別對2種稻田細菌群落影響因素進行分析，生物有機肥細菌群落組成的主要影響因子是pH，河蟹引入生物有機肥田后，主要影響因子則為速效鉀(AK，圖4)。

表1 2種稻田不同生育期根際土壤理化因子

2.2 2種稻田不同生育時期土壤細菌群落高通量測序統(tǒng)計分析

高通量測序結果顯示，本研究中生物有機肥田和河蟹生物有機肥田24個樣品共獲得849 065條有效序列。覆蓋度均大于0.96接近1.00，說明測序達到一定深度，基本上能覆蓋所有物種。以97%相似水平為劃分依據(jù)，2種稻田各時期獲得3177～4031個OUT(表2)。生物有機肥田成熟期的OTU數(shù)分別和分蘗期和拔節(jié)期差異顯著(P<0.05)，河蟹進入生物有機肥田后，拔節(jié)和抽穗期的OTU數(shù)有所提升，但差異不顯著(P>0.05)。

MiSeq 高通量測序所得到的原始數(shù)據(jù)(Raw Data)的雙端序列數(shù)據(jù)經(jīng) Trimmomatic軟件去雜和FLASH(1.2.11)軟件拼接后再通過QIIME(1.9.1)軟件進行質控和Usearch軟件去除嵌合體序列即得到優(yōu)質序列[13-16]。利用Uparse(version 7.1)軟件按照97%相似性對非重復序列(不含單序列)進行操作分類單元(OTU)聚類，在聚類過程中去除嵌合體，得到OTU的代表序列。采用RDP classifier(version 2.1.1)貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析，并分別在各個分類學水平上對比Silva(Release132數(shù)據(jù)庫)統(tǒng)計各樣本的群落物種組成。利用Mothur(1.30.2) 軟件計算α多樣性指數(shù)[17-19]，利用 SPSS 26.0 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。利用CANOCO 4.5進行RDA冗余分析，以獲取細菌群落結構與土壤理化性質的耦合關系。

表2 土壤細菌群落高通量測序信息統(tǒng)計分析