郭 帥，熊 琪，陶 虎，楊 娟，韓世昌

(1.湖北省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所，武漢 430000；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，武漢 430000)

【研究意義】我國(guó)是世界上牛品種最多的國(guó)家，共有53個(gè)地方品種和8個(gè)培育品種[1]。近年來(lái)，由于外來(lái)品種的引進(jìn)，我國(guó)原有的地方品種資源在逐漸減少，對(duì)牛的品種篩選與繁育變得至關(guān)重要。牛的親子鑒定是牛品種篩選的重要環(huán)節(jié)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】微衛(wèi)星標(biāo)記就被認(rèn)為是表征品種遺傳多樣性的首選標(biāo)記[2]。Chaudhari等[3]利用25對(duì)熒光微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)Kenkatha和Gaolao這2個(gè)品種的牛進(jìn)行了分子鑒定，證明這2個(gè)品種間幾乎沒(méi)有遺傳分化。Acosta[4]利用30對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記評(píng)估了5個(gè)古巴牛品種的遺傳多樣性和關(guān)系，結(jié)果顯示當(dāng)?shù)嘏Ｈ褐斜３至舜罅康倪z傳變異。Novoa和Usaquén 等[5]檢測(cè)了來(lái)自哥倫比亞的178只婆羅門牛的11個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記多態(tài)性，結(jié)果顯示婆羅門牛的高度雜合性，揭示了品種起源。李芳玉[6]對(duì)云嶺牛線粒體DNA全基因組遺傳多樣性研究發(fā)現(xiàn)，云嶺牛是以云南地方黃牛為母本進(jìn)行培育的肉牛品種，包括普通牛和瘤牛2個(gè)母系起源，且以瘤牛起源為主。李榮嶺等[7]采用熒光標(biāo)記引物擴(kuò)增STR，通過(guò)全自動(dòng)基因分析儀檢測(cè)基因型，這種高通量檢測(cè)方法準(zhǔn)確、可靠，但檢測(cè)費(fèi)用昂貴。Ciampolinie 等[8]將1個(gè)由54頭荷斯坦牛與4頭意大利肉牛組成的測(cè)試組，用微衛(wèi)星DNA測(cè)定，結(jié)果顯示4頭‘意大利牛’之間的遺傳相似度較高，54頭‘荷斯坦牛’間的遺傳相似度低。吳偉等[9]利用4種微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)5個(gè)中外牛品種/群體遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)西門塔爾牛自成一類，延邊牛、韓牛為一類，南陽(yáng)牛和雜種牛為一類。張自富等[10]利用微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)研究了14個(gè)中外黃牛品種的遺傳多樣性，篩選出ILSTS005和ETH10 2個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】親子鑒定是通過(guò)分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)和醫(yī)學(xué)等技術(shù)手段，分析親代和子代的遺傳特性，從而判斷是否具有親緣關(guān)系[11-12]。親子鑒定的遺傳基礎(chǔ)是孟德?tīng)柕倪z傳定律，包括基因分離和自由組合規(guī)律。在家畜的親子鑒定中，通常使用排除法和似然法。排除法是利用各個(gè)位點(diǎn)的等位基因頻率把不是親生父親的候選父親排除的概率。似然法是通過(guò)建立候選父親和子代的似然函數(shù)，在一定置信水平下為子代找到最似親本[13]。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究中共有3頭牛，通過(guò)Sry雄性特異性基因檢測(cè)來(lái)證明這3頭牛的性別，再根據(jù)終止法測(cè)序，比對(duì)mtDNA的D-loop區(qū)的位點(diǎn)突變情況，最后根據(jù)STR位點(diǎn)基因型來(lái)確定3頭牛的親子代關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 樣品

爭(zhēng)議公牛C和嫌疑母牛A、B的外周血液樣品。

1.2 試劑

基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；瓊脂糖購(gòu)自上海貝晶生物技術(shù)有限公司。

1.3 利用mtDNA D-loop區(qū)遺傳標(biāo)記進(jìn)行牛母系血緣鑒定

采用Tris-飽和酚提取牛外周血液DNA。根據(jù)牛mtDNA的D-loop區(qū)設(shè)計(jì)引物(表1)，以牛外周血基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂凝膠電泳回收純化后，以雙脫氧鏈終止法進(jìn)行測(cè)序。Mutation Surveyor軟件(v5.0.2)分析測(cè)序結(jié)果后，判斷親權(quán)關(guān)系。以牛 Sry 基因作為雄性特異性基因設(shè)計(jì)引物，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用于性別鑒定。

PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃ 變性30 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min，4 ℃ 保存，PCR擴(kuò)增體系如表2所示。

1.4 利用微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記進(jìn)行牛單親親權(quán)鑒定

采用Tris-飽和酚法提取牛尾靜脈血DNA。選定的位點(diǎn)除了BM1824、BM2113、INRA023、ETH10、ETH225、SPS115、TGLA227、TGLA122這8個(gè)作牛的親權(quán)鑒定必須包括在內(nèi)的“國(guó)際標(biāo)記組”外，參考賀建寧[14]的研究結(jié)果，增加了有豐富等位基因、高多態(tài)性特點(diǎn)的INRA037、INRA032、CSSM66、TGLA53和HAUT275個(gè)STR位點(diǎn)。合成13個(gè)STR位點(diǎn)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并于AB 3130xl 遺傳分析儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳分離、收集熒光信號(hào)、自動(dòng)分析PCR 產(chǎn)物的長(zhǎng)度，運(yùn)用GeneMarker軟件(v2.2.0)自動(dòng)分析各等位基因的基因型。

2 結(jié)果與分析

2.1 線粒體D-loop區(qū)檢測(cè)結(jié)果

牛A、牛B和牛C的線粒體D-loop區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)表明，擴(kuò)增產(chǎn)物約1000 bp，條帶單一，無(wú)非特異性擴(kuò)增條帶(圖1)。Sry雄性特異性基因檢測(cè)結(jié)果(圖1)顯示，只有牛C的Sry雄性特異性基因可以形成擴(kuò)增條帶，表明牛A和牛B為雌性個(gè)體，與送檢樣品標(biāo)注相符。

mtDNA的D-loop區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收純化后，用雙脫氧鏈終止法測(cè)序，并進(jìn)行序列比對(duì)。與參照序列(AY337535)相比，牛B、牛C的mtDNA D-loop區(qū)雙脫氧鏈終止法測(cè)序結(jié)果共檢測(cè)到47個(gè)突變，牛A共檢測(cè)到46個(gè)突變(表3)，其中牛B mtDNA D-loop區(qū)的47個(gè)位點(diǎn)與牛C突變方式完全一致，而牛A的291A>G這個(gè)位點(diǎn)與參照序列(AY337535)相同，不同于牛C。以上mtDNA D-loop區(qū)測(cè)序分析結(jié)果表明，牛B與牛C是來(lái)源于同一母系的個(gè)體。

表1 牛mtDNA的D-loop區(qū)鑒定使用的引物

表2 PCR擴(kuò)增體系

圖1 牛A、牛 B和牛C的mtDNA D-loop區(qū)及Sry基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoresis of mtDNA D-loop region and Sry gene PCR products of cow A,cow B and cow C

表3 被鑒定對(duì)象mtDNA D-loop區(qū)測(cè)序結(jié)果與參照序列(AY337535)的比對(duì)情況

表4 13個(gè)位點(diǎn)等位基因的基因型

2.2 微衛(wèi)星標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果

13個(gè)STR位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物均有條帶(圖2)。3件送檢樣本的BM1824、BM2113、INRA023、ETH10、ETH225、INRA037、INRA032、CSSM66、SPS115、TGLA53、TGLA227、TGLA122、HAUT27基因座中均檢出基因型(即等位基因片段后者大于前者)。利用AB 3130xl 遺傳分析儀對(duì)13個(gè)位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳分離。牛B和牛C的BM1824位點(diǎn)符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律(圖3)，而牛A與牛C在這個(gè)位點(diǎn)不符合(因?yàn)榕基因型片段小于等于牛C，牛A基因型片段比牛C大)。牛B和牛C在13個(gè)STR位點(diǎn)的基因型全部符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律(表4)，牛A和牛C在1號(hào)染色體的BM1824位點(diǎn)、2號(hào)染色體的BM2113位點(diǎn)、3號(hào)染色體的INRA023位點(diǎn)、10號(hào)染色體的INRA037位點(diǎn)、11號(hào)染色體的INRA032位點(diǎn)、16號(hào)染色體的TGLA53位點(diǎn)和26號(hào)染色體的HAUT27位點(diǎn)不符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律。

圖2 牛A、牛 B和牛C的1～13個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoresis of PCR products of 1-13 microsatellite markers in cow A,cow B and cow C

3 討 論

mtDNA(mitochondrial DNA)又稱線粒體DNA，是重要的遺傳標(biāo)記，是細(xì)胞中唯一的核外基因組DNA[15]。線粒體以母系遺傳方式遺傳，不受染色體重組的影響，可彌補(bǔ)微衛(wèi)星因發(fā)生重組影響基因頻率和基因型頻率，最終導(dǎo)致鑒定率降低的不足。同時(shí)，線粒體拷貝數(shù)多，每個(gè)細(xì)胞含有10～1000個(gè)線粒體，多數(shù)線粒體內(nèi)含有多拷貝的mtDNA，因此對(duì)mtDNA的檢測(cè)比核基因組DNA(nDNA)的靈敏性高，具有更高的檢出率[16]。但是線粒體DNA存在結(jié)構(gòu)多樣性，且單獨(dú)使用線粒體DNA測(cè)序技術(shù)作為分子標(biāo)記存在一定的缺陷[17]。

根據(jù)本次送檢樣品的檢測(cè)結(jié)果，基本可以排除牛A與牛C具有親子關(guān)系的可能性。鑒于牛B和牛C的 mtDNA D-loop區(qū)47個(gè)位點(diǎn)的突變方式完全相同，該方法檢測(cè)結(jié)果只能說(shuō)明牛B與牛C有母系血緣關(guān)系，其親子關(guān)系還必須通過(guò)常染色體STR來(lái)確定。

STR本研究共選定為位點(diǎn)除了BM1824、BM2113、INRA023、ETH10、ETH225、SPS115、TGLA227、TGLA122這8 個(gè)作牛的親權(quán)鑒定必須包括在內(nèi)的“國(guó)際標(biāo)記組”外，還增加了INRA037、INRA032、CSSM66、TGLA53和HAUT27這5個(gè)STR位點(diǎn)。其中INRA037位點(diǎn)等位基因數(shù)為14，多肽信息含量為0.671；INRA032等位基因?yàn)?，多肽信息含量為0.537；CSSM66等位基因數(shù)為11，多肽信息含量為0.734；TGLA53等位基因數(shù)為18，多肽信息含量為0.881；HAUT27等位基因數(shù)為11，多肽信息含量為0.737。王均輝等[18]研究發(fā)現(xiàn)，秦川牛的平均多肽信息含量為0.7686，平均雜合度為0.7959。王敏強(qiáng)等[19]研究發(fā)現(xiàn)，魯西黃牛平均多肽信息含量為0.797，平均雜合度為0.820；渤海黑牛的平均多肽信息含量為0.798，平均雜合度為0.821；秦川牛的平均多肽信息含量為0.795，平均雜合度為0.819。遺傳連鎖分析顯示，多肽信息含量大于0.7的微衛(wèi)星位點(diǎn)為最理想的選擇標(biāo)記，所以本實(shí)驗(yàn)中13個(gè)STR可以作為進(jìn)一步連鎖分析的候選遺傳標(biāo)記和個(gè)體鑒定。母牛B和公牛C在13個(gè)STR基因座均符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律[12]，相對(duì)親權(quán)概率(RCP)為99.99%，母牛B是公牛C的生物學(xué)母本的幾率大于99.99%；母牛A和公牛C之間有7個(gè)STR基因座不符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律，因此，排除母牛A與公牛C具有親子關(guān)系的可能性。

圖3 1號(hào)染色體BM1824位點(diǎn)毛細(xì)管電泳結(jié)果Fig.3 Results of capillary electrophoresis at bm1824 site on chromosome 1

吳繼法等[20]在研究中選用了36個(gè)STR位點(diǎn)，采用熒光多重PCR，對(duì)涼山半細(xì)毛羊進(jìn)行親子鑒定，得到的累積非父概率為99.999 999%。賈名威等[21]研究顯示，采用6個(gè)STR位點(diǎn)，得到奶牛的累積非父排除率98.827%，肉牛累積非父排除率99.578。其結(jié)果低于國(guó)內(nèi)外親子鑒定的標(biāo)準(zhǔn)。本研究所檢測(cè)的13個(gè)基因座既可以達(dá)到國(guó)內(nèi)外親子鑒定的精確度要求，又做到實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)便，成本較低，更加適應(yīng)生產(chǎn)實(shí)際。這13個(gè)基因座具有高遺傳多態(tài)性，在同一模板濃度下，各位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)遺傳分析儀分析，得到的檢測(cè)峰信號(hào)較強(qiáng)且峰型好。本研究采用的STR復(fù)合擴(kuò)增[22]、熒光標(biāo)記、毛細(xì)管電泳檢測(cè)[23]、GeneMarker軟件[24]分析的方法優(yōu)點(diǎn)較多，比如高分辨率、高準(zhǔn)確度、速度快等，表明這種方法在動(dòng)物遺傳研究中有很強(qiáng)的實(shí)用性[25]。

4 結(jié) 論

根據(jù)mtDNA D-loop基因分型結(jié)果，確定牛B與牛C具有母系血緣關(guān)系，排除牛A與牛C存在母系血緣關(guān)系。根據(jù)DNA遺傳標(biāo)記分型結(jié)果，確定牛B是牛C的生物學(xué)母親；排除牛A是牛C的生物學(xué)母親，說(shuō)明該方法用于牛親子鑒定具有可靠性。