安徽省泛樹蛙屬物種分類歸屬初探

梅雅晴，繆永鑫，李藝迪，王陳成，孫 平，王 慧，張保衛(wèi)*

(1. 安徽大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 合肥 230601；2. 蚌埠學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，安徽 蚌埠 233030)

樹蛙科Rhacophoridae屬兩棲綱、無尾目，包括14個(gè)屬，440個(gè)物種，廣泛散布于歐亞大陸[1-2]，中國境內(nèi)共分布12個(gè)屬，77個(gè)物種[3-4].其中，泛樹蛙屬Polypedates是Tschudi于1838年以Hylaleucomystax(即現(xiàn)在的Polypedatesleucomystax)為模式種所定義的[5].泛樹蛙屬的物種指間一般無蹼，頭部皮膚多與頭骨緊貼，體背面一般為褐色型，多數(shù)種有縱條紋或“X”型斑紋[5]，屬中的物種廣泛分布于印度、婆羅洲以及東南亞等地區(qū)[2].由于泛樹蛙屬內(nèi)各物種間的差異較小，通過外表、形態(tài)差異等很難得到有效的鑒定結(jié)果，導(dǎo)致其物種歸屬以及系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系等問題一直存在爭議[6-14].在亞洲地區(qū)，部分泛樹蛙屬的物種被歸類為P.leucomystax復(fù)合體[5-6,12-13,15-16].Pan等[16]在先前研究的基礎(chǔ)上[6-7,15-20]，利用系統(tǒng)發(fā)育研究重新評估了該復(fù)合體，發(fā)現(xiàn)它在東南亞地區(qū)含有5個(gè)物種，其中有4種在中國境內(nèi)也有分布[2-3]，分別是布氏泛樹蛙P.braueri、斑腿泛樹蛙P.megacephalus、無聲囊泛樹蛙P.mutus和凹頂泛樹蛙P.impresus，它們的模式標(biāo)本產(chǎn)地分別為中國臺灣[21]、中國香港[22]、緬甸N’Chang Yang地區(qū)[23]和中國云南省普洱市[24].

1974年，四川生物研究所兩棲爬行動(dòng)物研究室在對安徽省兩棲爬行動(dòng)物的調(diào)查中，在皖西大別山和皖南黃山地區(qū)共發(fā)現(xiàn)樹蛙科物種兩種：大樹蛙R.dennysiBlanford和斑腿樹蛙R.leucomystax，其中斑腿樹蛙為安徽省的分布新紀(jì)錄[25].出版于1991年的《安徽兩棲爬行動(dòng)物志》中記載安徽省存在樹蛙科物種3種，分別為大樹蛙、斑腿樹蛙和黑點(diǎn)樹蛙P.nigropunctatus[26]，其中大樹蛙、斑腿樹蛙分布于皖西大別山和皖南黃山地區(qū)，而黑點(diǎn)樹蛙僅記錄于皖西丘陵地區(qū)分布[26-28].斑腿泛樹蛙在皖南分布廣泛，2001年唐鑫生等[29]在安徽、江西和浙江三省交界處的安徽嶺南自然保護(hù)區(qū)也有發(fā)現(xiàn).2002年，Wikinson等[15]利用線粒體標(biāo)記證實(shí)了泛樹蛙屬的有效性，因此將樹蛙和泛樹蛙區(qū)分，斑腿樹蛙相應(yīng)地更名為斑腿泛樹蛙Polypedatesmegacephalus[5,26-30].斑腿泛樹蛙此后被發(fā)現(xiàn)在大別山也是廣泛分布的優(yōu)勢種[30-32].

近年來，隨著野外調(diào)查以及對上述物種的深入研究，學(xué)者們對安徽分布的樹蛙類不斷有新的認(rèn)識.如原本分布于大別山的黑點(diǎn)樹蛙被證實(shí)為樹蛙科一新種，并被命名為安徽樹蛙Rhacophoruszhoukaiya[33].Pan等[16]在2013年通過分子系統(tǒng)發(fā)育分析對凹頂泛樹蛙的有效性進(jìn)行研究時(shí)，結(jié)果顯示安徽黃山地區(qū)可能有布氏泛樹蛙存在.鑒于此前在安徽的皖西大別山和皖南地區(qū)并無布氏泛樹蛙的報(bào)道，其物種的分布及遺傳背景現(xiàn)狀尚不清楚，因此在安徽分布的泛樹蛙屬物種有待細(xì)致研究，以確定它們在安徽的分布.筆者通過對安徽省大別山地區(qū)和皖南黃山地區(qū)泛樹蛙屬樣本的采集，結(jié)合分子系統(tǒng)發(fā)育分析等分析手段，以期厘清安徽分布的泛樹蛙屬物種，并為泛樹蛙屬物種的保護(hù)和管理等提供研究基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 樣品采集

根據(jù)泛樹蛙屬物種在安徽省內(nèi)的分布與生境特點(diǎn)，自2013年4月至2016年4月，在皖西地區(qū)和皖南地區(qū)共選取5個(gè)采樣點(diǎn)，采集泛樹蛙屬物種共18只個(gè)體，其中皖西大別山地區(qū)11只(鷂落坪國家級自然保護(hù)區(qū)7只、天馬國家級自然保護(hù)區(qū)1只、金寨縣金剛臺1只、太湖縣彌陀鎮(zhèn)2只)，皖南黃山地區(qū)7只，均采集自黃山風(fēng)景區(qū)周邊地區(qū).所采集的樣品取部分肌肉組織保存于95%的乙醇溶液中用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，研究中所有標(biāo)本都存放于安徽大學(xué)生物標(biāo)本館內(nèi).

1.2 DNA提取、擴(kuò)增和測序

肌肉組織樣品用蛋白酶K消化，并利用酚-氯仿法抽提DNA[34].參考Kuraishi等[6]和Pan等[16]對泛樹蛙屬系統(tǒng)發(fā)育的研究，選取12S rRNA、16S rRNA基因片段作為遺傳標(biāo)記，并使用了兩對擴(kuò)增引物：Rha12S-F: 5’-AAAAGAGCTAACCCGTCTCTGT-3’；Rha12S-R: 5’-CGGTCTGAACTCAGATCACG-3’；Rha16S-F: 5’-GAT ATT AGT CGG CGT TAA GCG TG-3’；Rha16S-R：5’-GCT GCC TTC AGG CCC AC-3’[33,35].PCR反應(yīng)體系如下：總體積為50 μL，其中DNA模板1 μL，上下游引物(0.2 μmol) 各1 μL，2×EasyTaqPCR SuperMix(+dye)25 μL，雙蒸水ddH2O 22 μL.PCR反應(yīng)設(shè)置為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，54 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，共35循環(huán)，最后一循環(huán)保溫10 min，4 ℃保存?zhèn)溆?利用未加模板DNA的反應(yīng)液作為空白對照，以避免實(shí)驗(yàn)過程中的污染.

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，隨后送至通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司進(jìn)行純化處理后，使用ABI3730 automatic DNA測序儀進(jìn)行雙向測序.

1.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

使用SeqMan軟件對測序結(jié)果進(jìn)行拼接，并輔以人工校對以去除堿基誤判等錯(cuò)誤，并將整理好的測序結(jié)果上傳至GenBank，登錄號見附錄表1.基于Kuraishi等[6]和Pan等[16]此前對泛樹蛙屬系統(tǒng)發(fā)育的研究，并結(jié)合安徽省泛樹蛙屬鑒定所面臨的情況，從GenBank中共選擇并下載了泛樹蛙屬10個(gè)物種的52條相關(guān)序列(12S rRNA，16S rRNA)進(jìn)行整合分析.其中布氏泛樹蛙序列16個(gè)；斑腿泛樹蛙序列4個(gè)；無聲囊泛樹蛙序列2個(gè)；凹頂泛樹蛙序列1個(gè)；P.leucomystax序列5個(gè)；P.otilophus，P.colletti，P.maculatus，P.macrotis序列各1個(gè)，以及在Kuraishi[6]研究中，來自Malaysia的一個(gè)未知物種P.sp序列2個(gè).在 MEGA 6.0[36]中Clustalx1.81將筆者研究得到的測序結(jié)果與來自GenBank的泛樹蛙屬各物種的同源序列進(jìn)行比對，并通過手動(dòng)調(diào)整使同源基因的序列長度保留一致.最終得到基因片段的序列長度為1 972 bp，其中12S片段長度為591 bp，16S片段長1 381 bp(附錄表1).

構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹時(shí)，以P.otilophus，P.colletti為外群進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析.采用貝葉斯推斷法(BI)和最大似然法(ML)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系的構(gòu)建，以確定各個(gè)新采集樣本的物種歸屬.構(gòu)建貝葉斯系統(tǒng)發(fā)生樹(BI)時(shí)，首先在PartitionFinder 2[37]中依據(jù)赤池信息準(zhǔn)則(AIC)選擇最適模型(GTR+I+G)后在MrBayes 3.2[38]中進(jìn)行建樹.運(yùn)算的代數(shù)設(shè)置為10,000,000，直至最小的誤差值小于0.01，運(yùn)算中每經(jīng)歷1 000代的運(yùn)算進(jìn)行1次采樣并保存樹圖，其中25%的老化結(jié)果被舍棄，將剩下的樹構(gòu)建成50%嚴(yán)格一致樹，并計(jì)算每個(gè)節(jié)點(diǎn)的后驗(yàn)概率.最大似然樹(ML)則通過RaxML軟件進(jìn)行構(gòu)建，選取GTRCAT作為模型，運(yùn)算代數(shù)為1 000代，以此估計(jì)樹圖各節(jié)點(diǎn)的支持率.研究中生成的樹文件采用Figtree v1.4.2[39]軟件打開，并進(jìn)行相應(yīng)的編輯.

此外，研究中還運(yùn)用MEGA 6.0基于Kimura 2-parameter (K-2-p)對研究中所涉及的各物種之間進(jìn)行了遺傳距離的計(jì)算與分析.

2 結(jié)果與分析

貝葉斯系統(tǒng)發(fā)生樹(圖1)結(jié)果表明，除外群外，樹圖主要分為了8個(gè)支系(CladeA～H)，分別對應(yīng)于布氏泛樹蛙P.braueri、無聲囊泛樹蛙P.mutus、凹頂泛樹蛙P.impresus、斑腿泛樹蛙P.megacephalus、P.leucomystax、P.sp.Malaysia、P.macrotis、P.maculatus，并且每一支都得到了較高后驗(yàn)概率的支持.Clade A支系包含了研究中所有來自GenBank的布氏泛樹蛙序列(臺灣、云南、廣西、四川、安徽、福建、浙江、江西)，其中Pan等[16]2013年采集自黃山地區(qū)的布氏泛樹蛙樣品(序列登錄號AB564282)也歸為該支.不僅如此，研究中所采集的泛樹蛙屬所有個(gè)體(DB1-11、HS12-18)都聚在這一支系之中.代表布氏泛樹蛙的這一支與無聲囊泛樹蛙P.mutus(Clade B，樣品來自廣西)互為姐妹群.斑腿泛樹蛙P.megacephalus(Clade D)在系統(tǒng)樹中和P.leucomystax(Clade E，分布于馬來西亞等東南亞國家)相聚后再和凹頂泛樹蛙P.impresus(Clade C，來自老撾)相聚合，這三者構(gòu)成一個(gè)較大的支系，和上述的“布氏泛樹蛙-無聲囊泛樹蛙”(Clade A+Clade B)支系形成姐妹群關(guān)系.上述物種在系統(tǒng)樹中，再依次與P.sp.Malaysia(Clade F)，P.macrotis(Clade G)，P.maculatus(Clade H)相聚，構(gòu)成完整的系統(tǒng)發(fā)育樹.整體來看，系統(tǒng)發(fā)生分析的結(jié)果也與Pan等[16]的結(jié)果有非常相似的樹形拓?fù)浣Y(jié)構(gòu).另外，基于最大似然法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹和BI建樹結(jié)果有著相同的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(文中未予展示).

根據(jù)系統(tǒng)發(fā)生分析結(jié)果(圖1)，筆者采集自大別山區(qū)與皖南山區(qū)的泛樹蛙樣品可歸為兩個(gè)大的支系，整體來看，和來自華東地區(qū)(浙江、福建、江西、安徽)的布氏泛樹蛙樣品(圖1中No.12～16)系統(tǒng)關(guān)系較為密切.上述樣品相聚形成一個(gè)大的支系后，再與來自臺灣個(gè)體相聚(圖1中No.10～11).相比之下，他們和采集自云南、廣西和四川等地的樣品(圖1中No.1～9)系統(tǒng)關(guān)系相對較遠(yuǎn).筆者所采集的所有樣品都與斑腿泛樹蛙(序列登錄號AB564283，AB728034，A8728091，EU215550)的系統(tǒng)位置相去甚遠(yuǎn).從遺傳距離看，筆者所采集到的18個(gè)泛樹蛙樣品之間的遺傳距離為0～0.011，而在Clade A 中，遺傳距離的變化為0.028～0.035.另外，這18個(gè)樣本與研究中的4個(gè)斑腿泛樹蛙的遺傳距離為0.042～0.149(附錄表2).上述結(jié)果均表明，筆者在皖西大別山區(qū)和皖南黃山地區(qū)所采集的18只樣本均應(yīng)為布氏泛樹蛙，而不是之前認(rèn)為的斑腿泛樹蛙.

研究中所使用的布氏泛樹蛙樣品分布點(diǎn)用綠色三角形標(biāo)識(1/2/5/6-云南，3/4-廣西，7/8/9-四川，10/11-臺灣，12-安徽，13-江西；14-福建；15/16-浙江)；紫色圓點(diǎn)為斑腿泛樹蛙分布點(diǎn)(1-泰國、2-香港、3-海南、4-廣東)；星號則代表該研究中所采集的樣品來源，其中紅色為大別山區(qū)，黃色為皖南山區(qū).圖1 基于線粒體12SrRNA、16S rRNA基因以貝葉斯法構(gòu)建的泛樹蛙屬10個(gè)物種系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討 論

據(jù)記載，安徽省樹蛙科物種共有4種，分別是樹蛙屬的大樹蛙、安徽樹蛙，泛樹蛙屬的斑腿泛樹蛙、布氏泛樹蛙[5,16,26].其中大樹蛙被記載分布于霍山、金寨、涇縣、祁門、青陽、東至[26]；安徽樹蛙目前在大別山安徽境內(nèi)高海拔地區(qū)皆有分布[33].據(jù)記載，斑腿泛樹蛙分布于黃山、九華山以及大別山地區(qū)[26-32]，而布氏泛樹蛙近年才在黃山有記錄[16].從目前的相關(guān)資料[5,12-14,25-31]來看，斑腿泛樹蛙和布氏泛樹蛙在形態(tài)、繁殖方式、生活方式上都很接近，僅依靠形態(tài)學(xué)很難獲得準(zhǔn)確的鑒別結(jié)果.筆者通過在皖南山區(qū)和大別山區(qū)的系統(tǒng)調(diào)查取樣，利用分子系統(tǒng)學(xué)的研究手段，通過與泛樹蛙屬的相關(guān)近緣物種進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)研究中采自皖南山區(qū)和大別山區(qū)所有泛樹蛙樣品都應(yīng)是布氏泛樹蛙.

通過對文獻(xiàn)的總結(jié)，發(fā)現(xiàn)布氏泛樹蛙的分布范圍較廣，目前在廣西、廣東、云南、四川、貴州以及與安徽相鄰的浙江、江西、福建等省均有分布[4-6,16,19,41].此外，Pan等[16]在2013年的研究表明布氏泛樹蛙在安徽皖南山區(qū)有分布.而斑腿泛樹蛙則分布于西南地區(qū)的云南、廣西、海南、四川、貴州等省份[4-6,16,40-41]，空間分布與安徽省距離甚遠(yuǎn).因此筆者認(rèn)為，安徽省范圍內(nèi)可能并無斑腿泛樹蛙分布，此前所記載的斑腿泛樹蛙[25-32]應(yīng)該是對布氏泛樹蛙的誤判.研究的結(jié)果還提示布氏泛樹蛙在安徽省范圍內(nèi)的分布廣泛，它在大別山區(qū)以及皖南山區(qū)均為常見物種[5,25-32].

根據(jù)文中對布氏泛樹蛙的譜系地理關(guān)系分析，我國的布氏泛樹蛙很可能起源于云南、廣西、四川一帶，并逐漸向我國東南部(浙江、江西、安徽、福建)擴(kuò)散，并在此南下到達(dá)臺灣、北向越過長江到達(dá)大別山地區(qū).作為廣泛分布的泛樹蛙類物種，布氏泛樹蛙的種群遺傳特征和譜系地理發(fā)生過程值得進(jìn)一步研究.