王彩霞 賈 陽(yáng) 秦文莉 陳斌斌 王 敏 馬增嶺

(1. 溫州大學(xué)浙江省亞熱帶水環(huán)境與海洋生物資源保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 溫州 325035; 2. 溫州大學(xué)城鎮(zhèn)水污染生態(tài)治理技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心， 溫州 325035)

近年來(lái)赤潮的發(fā)生機(jī)理、生態(tài)危害及控制策略成為自然科學(xué)的研究熱點(diǎn)， 赤潮暴發(fā)經(jīng)常會(huì)引起養(yǎng)殖魚(yú)類和貝類的大量死亡， 進(jìn)而導(dǎo)致近岸水生生態(tài)系統(tǒng)的失衡[1，2]。一些能夠引發(fā)赤潮的藻種會(huì)產(chǎn)生毒素并通過(guò)食物鏈的富集作用， 對(duì)人類健康產(chǎn)生威脅。過(guò)去幾十年， 全球已報(bào)告了數(shù)千起因食用赤潮發(fā)生海域海產(chǎn)品引起的中毒事件， 且呈增加態(tài)勢(shì)[3]。

中國(guó)海洋環(huán)境質(zhì)量公報(bào)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示， 我國(guó)東海海域每年赤潮暴發(fā)次數(shù)最多、面積最大， 而東海原甲藻 (Prorocentrum donghaiense) 是最主要的赤潮原因種。東海原甲藻赤潮影響面積大(＞1000—10000 km2)， 持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)(＞30d)， 從1990年開(kāi)始幾乎每年春季都有暴發(fā)[4]。研究顯示， 東海原甲藻赤潮會(huì)引起褶皺臂尾輪蟲(chóng) (Brachionus plicatilis)和蒙古裸腹溞(Moina mongolica) 存活率下降[5]， 降低中華哲水蚤(Calanus sinicus)的產(chǎn)卵量和孵化率， 進(jìn)而導(dǎo)致浮游動(dòng)物種群數(shù)量的下降[6]。

大型海藻場(chǎng)主要位于潮間帶下區(qū)和潮下帶數(shù)米淺水區(qū)硬相海底， 而人工栽培的大型海藻則主要掛養(yǎng)在近岸水域。近年來(lái)近岸海域赤潮頻發(fā)正在引起大型海藻場(chǎng)的快速退化及養(yǎng)殖品系的損傷: 如2002年5月末在韓國(guó)南部海域發(fā)生的赤潮異彎藻(Heterosigma akashiwo)赤潮， 其消退時(shí)產(chǎn)生的大量黏液物質(zhì)(Mucilaginous material)在大葉藻(Zostera marina)構(gòu)成的海藻場(chǎng)上形成了0.3—1.0 m厚的黏液層， 從而使得該區(qū)域海藻場(chǎng)消失殆盡[7，8]; 自20世紀(jì)80年代以來(lái)經(jīng)常在日本瀨戶內(nèi)海Harima-Nada區(qū)域發(fā)生的浮動(dòng)彎角藻 (Eucampia zodiacus)赤潮常常引起該地區(qū)養(yǎng)殖的紫菜葉狀體漂白， 嚴(yán)重影響紫菜質(zhì)量， 并造成數(shù)千萬(wàn)美元的損失[9，10]; 而發(fā)生在南非西海岸、由高濃度非產(chǎn)毒的海洋原甲藻(P. micans)、新角藻(Neoceratium furca)及少量產(chǎn)毒的鏈狀亞歷山大藻(Alexandrium catenella)和漸尖鰭藻(Dinophysis acuminate)形成的“黑潮”， 在消退過(guò)程中因赤潮藻細(xì)胞腐敗形成的近岸低氧、高硫化氫環(huán)境引起了潮間帶95%的生物個(gè)體死亡， 并導(dǎo)致當(dāng)?shù)赜勺喜撕褪恍纬傻暮Ｔ鍒?chǎng)全部消失[11]。而海藻場(chǎng)一旦消失， 要靠自然恢復(fù)就變得非常困難， 即使環(huán)境條件改善也要經(jīng)歷數(shù)年時(shí)間[11，12]。

浙江溫州海域是我國(guó)經(jīng)濟(jì)海藻羊棲菜的主產(chǎn)區(qū)， 其產(chǎn)量約占國(guó)內(nèi)羊棲菜總產(chǎn)量的90%， 產(chǎn)品遠(yuǎn)銷日本、韓國(guó); 與此同時(shí)， 該海域東海原甲藻赤潮頻發(fā)， 羊棲菜養(yǎng)殖戶深受其擾。羊棲菜富含多糖、膳食纖維素、B族維生素、褐藻酸、甘露醇及人體必需的礦物質(zhì)和微量元素， 具有重要的食用和藥用價(jià)值， 在日本被稱為“長(zhǎng)壽菜”。其具有性繁殖和無(wú)性繁殖2種生活史階段: 孢子體成熟時(shí)進(jìn)行有性繁殖; 之后枝葉即爛去， 而假根繼續(xù)保存， 待環(huán)境適合生長(zhǎng)后， 自假根處再分化出新的幼孢子體[13]。每年的4月中旬至5月中旬羊棲菜孢子體開(kāi)始成熟， 進(jìn)入生產(chǎn)采收期; 而采收時(shí)也要預(yù)留一部分長(zhǎng)勢(shì)良好、豐產(chǎn)特征明顯的成熟孢子體作為種苗， 用于采收后至6月中旬的人工育苗。羊棲菜有性繁殖過(guò)程中具有精卵同步釋放、同步受精， 合子固著、幼苗發(fā)育快及植株?duì)I養(yǎng)生長(zhǎng)快速等特點(diǎn)[14—17]。在羊棲菜有性繁殖時(shí)， 卵子和精子分別由雌雄生殖托同步釋放，在精卵結(jié)合后， 合子24h后進(jìn)入幼胚生長(zhǎng)發(fā)育階段;幼胚經(jīng)自然海區(qū)人工放養(yǎng)1.5個(gè)月左右， 相繼生長(zhǎng)發(fā)育成具有三葉體形態(tài)特征的幼孢子體(即幼苗)， 至8月份幼苗長(zhǎng)至10 cm以上時(shí)開(kāi)始夾苗掛養(yǎng)。而每年的4—8月份正是我國(guó)東海近海赤潮高發(fā)期。其在成熟期、有性生殖期及幼苗期均可能與有害赤潮發(fā)生遭遇戰(zhàn)， 這種重要生物學(xué)階段與赤潮高發(fā)期的高度重合使其成為研究有害赤潮對(duì)大型海藻抑制效應(yīng)及其機(jī)制的理想材料。

因?yàn)榇笮秃Ｔ迦斯ゐB(yǎng)殖能夠改善水體富營(yíng)養(yǎng)化水平并降低赤潮發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)， 因此其生態(tài)效應(yīng)及經(jīng)濟(jì)價(jià)值備受關(guān)注。然而， 抑制作用也是相互的[18]，赤潮作為密集海水養(yǎng)殖區(qū)內(nèi)常見(jiàn)的生態(tài)事件[19]， 有關(guān)大型海藻的生理活動(dòng)如何應(yīng)答甲藻赤潮脅迫卻很少受到關(guān)注， 尤其缺乏赤潮發(fā)生過(guò)程中， 大型海藻合子及幼苗在生長(zhǎng)發(fā)育、光合特性和產(chǎn)物累積等方面對(duì)不同赤潮生物如何應(yīng)答的研究。在實(shí)踐中也觀察到東海原甲藻赤潮侵襲羊棲菜養(yǎng)殖筏的現(xiàn)象[20]。其次已有研究表明， 米氏凱倫藻會(huì)顯著抑制羊棲菜孢子體氣囊及生殖托的光合活性[18]， 并且其對(duì)羊棲菜合子的生長(zhǎng)及光合作用的抑制作用具有濃度依賴性[20]。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)東海原甲藻也會(huì)顯著抑制羊棲菜合子的生長(zhǎng)和光合作用[21]，為了進(jìn)一步探究其化感機(jī)理， 本文研究了濃度為1.00×105cells/mL東海原甲藻活細(xì)胞懸浮液(LC)、細(xì)胞破碎液(RC)和無(wú)細(xì)胞濾液(FC)對(duì)羊棲菜合子生長(zhǎng)及光合特性影響， 并利用快速葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)曲線參數(shù)分析(JIP-test)解析了東海原甲藻化感作用對(duì)羊棲菜合子光系統(tǒng)的損傷位點(diǎn)。以期為準(zhǔn)確、客觀地評(píng)價(jià)東海原甲藻赤潮頻發(fā)對(duì)羊棲菜栽培的危害提供理論依據(jù)和科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和培養(yǎng)條件

東海原甲藻由自然資源部第二海洋研究所的陸斗定教授提供， 用滅菌的F/2培養(yǎng)基[22]進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)， 培養(yǎng)溫度為22℃， 光強(qiáng)為100 μmol photons/(m2·s)， 光暗比為 12h∶12h。培養(yǎng)液每天人工搖動(dòng)2—3次。取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞懸浮液用于實(shí)驗(yàn)。羊棲菜雌雄孢子體于2019年5月中旬從洞頭水產(chǎn)科學(xué)技術(shù)研究所的羊棲菜培育基地獲得， 這一時(shí)期羊棲菜的大部分生殖托已經(jīng)成熟并且開(kāi)始釋放生殖細(xì)胞。雌雄植株用過(guò)濾的自然海水清洗3次，然后在充氣(0.5 L/min)條件下培養(yǎng)， 其他培養(yǎng)條件與上同。培養(yǎng) 2—3d后， 取雌雄生殖托按照5∶1的數(shù)量比例在同一個(gè)塑料水槽中培養(yǎng)， 雌雄托分別釋放生殖細(xì)胞并在水體內(nèi)完成受精; 用 280 目尼龍網(wǎng)收集合子， 沖洗干凈后重新懸浮于裝有過(guò)濾海水的燒杯中; 最后將合子均勻接種到6孔細(xì)菌培養(yǎng)板中， 培養(yǎng)板海水深度約為0.5 cm， 在培養(yǎng)箱中放置2d， 待合子通過(guò)絲狀假根附著于細(xì)菌培養(yǎng)板底部后進(jìn)行共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。

1.2 東海原甲藻活細(xì)胞懸浮液(LC)、細(xì)胞破碎液(RC)和無(wú)細(xì)胞濾液(FC)的制備

東海原甲藻細(xì)胞懸浮液(Living Cell Suspension， LC)的制備: 取處于指數(shù)生長(zhǎng)期的東海原甲藻培養(yǎng)液， 在3000×g、 4℃下離心15min后收集細(xì)胞，重新懸浮于新鮮的F/2培養(yǎng)基中， 使其細(xì)胞濃度達(dá)到1.00×105cells/mL。我們前期的研究已經(jīng)證明此濃度的東海原甲藻會(huì)抑制羊棲菜合子的生長(zhǎng)及光合作用。東海原甲藻無(wú)細(xì)胞濾液(Cell-free Supernatant， FC)的制備: 取濃度為1.00×105cells/mL的東海原甲藻細(xì)胞培養(yǎng)液， 經(jīng)0.45 μm醋酸纖維素薄膜過(guò)濾得到東海原甲藻的無(wú)細(xì)胞濾液。東海原甲藻細(xì)胞破碎液(Ruptured Cell Suspension， RC)的制備:取濃度為1.00×105cells/mL的東海原甲藻細(xì)胞培養(yǎng)液50 mL， 在3000×g、 4℃下離心 15min， 然后將收集的藻細(xì)胞在50 mL F/2培養(yǎng)基中重懸， 用超聲細(xì)胞破碎儀(JX-650)在冰浴條件下進(jìn)行破碎。所有的活細(xì)胞懸浮液， 細(xì)胞破碎液及無(wú)細(xì)胞濾液均為現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

研究一種微藻對(duì)其共存生物的化感效應(yīng)， 主要通過(guò)微藻細(xì)胞懸浮液、細(xì)胞濾液、細(xì)胞破碎液或微藻中某些次生代謝物質(zhì)(化感物質(zhì))與其他生物共培養(yǎng)[23]。因此本文采用新鮮F/2培養(yǎng)基培養(yǎng)的羊棲菜合子作為對(duì)照組， 采用利用LC、FC及RC培養(yǎng)的羊棲菜合子作為處理組， 在半連續(xù)培養(yǎng)(每2天更換1次培養(yǎng)液)條件下進(jìn)行為期10d的共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)， 在各個(gè)共培養(yǎng)組中羊棲菜合子的密度均為35個(gè)/cm2。

1.4 羊棲菜合子生長(zhǎng)發(fā)育的測(cè)定

用ECLIPSETs2 倒置顯微鏡觀察各組中羊棲菜合子的形態(tài)， 并且每隔1天用數(shù)碼顯微相機(jī)(NikonDSRi2)對(duì)各個(gè)組別的羊棲菜合子在同一位位置進(jìn)行拍照記錄。然后用NIS-Elements D5.10 軟件統(tǒng)計(jì)羊棲菜合子的長(zhǎng)度和寬度。由于合子的形態(tài)近似于圓柱體， 故其大小根據(jù)圓柱體體積公式計(jì)算。合子的相對(duì)生長(zhǎng)速率(RGR)用如下公式計(jì)算[24]， 其中V1和V2分別為t1和t2天時(shí)合子的體積:

1.5 羊棲菜合子葉綠素a含量的測(cè)定

在不同條件下培養(yǎng)10d后， 將各處理組的羊棲菜合子從6孔細(xì)菌培養(yǎng)板上刮下， 用0.45 μm醋酸纖維素薄膜過(guò)濾后的自然海水沖洗， 至鏡檢未發(fā)現(xiàn)東海原甲藻細(xì)胞， 用差量法稱取一定量的羊棲菜合子，各個(gè)組別的羊棲菜合子均用5 mL的無(wú)水甲醇在4℃條件下過(guò)夜提取， 然后用離心機(jī)在 5000×g離心10min， 用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV530; Beckman Coulter， USA)測(cè)定上清液的吸光值。葉綠素a濃度的計(jì)算方式如下[25]:

式中，A652、A665和A750分別表示上清液在波長(zhǎng)為652、665和750 nm 處的吸光度值。

1.6 羊棲菜合子光合活性的測(cè)定

羊棲菜合子的最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)和相對(duì)電子傳遞速率(rETR)采用多激發(fā)波長(zhǎng)葉綠素?zé)晒鈨x(Heinz Walz GmbH， Effeltrich， Germany)測(cè)定。測(cè)定前將羊棲菜合子重懸于3 mL的過(guò)濾海水中， 暗適應(yīng)15min。而后在梯度光照(PAR)水平下測(cè)定rETR-I曲線， 每個(gè)光強(qiáng)梯度間隔20s。rETR-I曲線各光合參數(shù)的計(jì)算參照根據(jù) Eilers和Peeters[26]的公式:

式中， a、b、c為校準(zhǔn)參數(shù)。表觀光合作用效率(α)、最大相對(duì)電子傳遞速率(rETRmax)和半飽和光強(qiáng)(Ik)用參數(shù)a、b和 c表示為:

1.7 快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線分析(JIPtest)

羊棲菜合子暗適應(yīng)15min后， 通過(guò)多激發(fā)波長(zhǎng)葉綠素?zé)晒鈨x(Heinz Walz GmbH， Effeltrich， Germany)測(cè)其快速葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)曲線(OJIPcurves)。快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線有O、J、I和P等相， 在該熒光曲線上O點(diǎn)是熒光值最小的點(diǎn)， P點(diǎn)是熒光值最大的點(diǎn)[27]， 這些點(diǎn)反應(yīng)了光合生物進(jìn)行光合作用時(shí)PSⅡ中光量子在傳遞過(guò)程中的狀態(tài)， 該傳遞過(guò)程可以簡(jiǎn)單地描述為質(zhì)體醌QA的還原過(guò)程， 過(guò)程如下: 首先O點(diǎn)是快速光曲線熒光最低點(diǎn)， 該點(diǎn)熒光值為Fo， 在該點(diǎn)時(shí)PSⅡ電子傳遞受體則處于氧化態(tài); 熒光曲線上升至J點(diǎn)和I點(diǎn)， 該過(guò)程是光化學(xué)反應(yīng)階段， 此時(shí)質(zhì)體醌QA接受電子， 被還原為和Q2A-， 電子也傳遞到次級(jí)醌受體QB; 當(dāng)QB從接受電子， 形成Q2B-時(shí)， QA完全進(jìn)入還原狀態(tài)，此時(shí)PSⅡ反應(yīng)中心完全關(guān)閉， 熒光曲線也上升到P點(diǎn)， 即熒光值達(dá)到最高(Fm)[28]。另外為了方便比較不同樣品的快速光曲線及相關(guān)熒光參數(shù)， 原始OJIP熒光曲線可通過(guò)下列公式標(biāo)準(zhǔn)化為相對(duì)可變熒光:

快速熒光曲線包含大量關(guān)于PSII反應(yīng)中心原初光化學(xué)反應(yīng)的信息， 通過(guò)對(duì)曲線熒光參數(shù)的分析，可以反映環(huán)境脅迫對(duì)羊棲菜合子產(chǎn)生的影響。本研究主要通過(guò)以下參數(shù)對(duì)合子的OJIP曲線進(jìn)行分析:VJ是在J點(diǎn)的相對(duì)可變熒光， 代表照光2ms時(shí)活性反應(yīng)中心關(guān)閉的程度;Mo是OJIP曲線的初始斜率， 代表QA被還原的最大速率，VJ和Mo分別通過(guò)以下公式計(jì)算:

式中，F(xiàn)2ms和F300ms代表熒光曲線在2和300ms 時(shí)的熒光值。用以下幾個(gè)參數(shù)來(lái)代表量子產(chǎn)額或能量分配比率: 最大光量子產(chǎn)率(φpo=Fv/Fm);ψo(hù)代表了在反應(yīng)中心捕獲的激子中用來(lái)推動(dòng)電子傳遞到電子傳遞鏈中超過(guò) QA的其他電子受體的激子占用來(lái)推動(dòng) QA還原激子的比率， 即照光2ms 時(shí)有活性的反應(yīng)中心的開(kāi)放程度;φEo， 代表反應(yīng)中心吸收的光能用于電子傳遞的量子產(chǎn)額， 即反應(yīng)中心吸收的光能將電子傳遞到電子傳遞鏈中超過(guò) QA的其他電子受體的概率。以上參數(shù)的計(jì)算方式分別如下:

以下幾個(gè)比活性參數(shù)表示羊棲菜合子單位PSⅡ反應(yīng)中心的活性: 單位反應(yīng)中心吸收的光能(ABS/RC)， 單位反應(yīng)中心捕獲的用于還原QA的能量(TRo/RC)， 單位反應(yīng)中心捕獲的用于電子傳遞的能量(ETo/RC)， 單位反應(yīng)中心熱耗散的能量(DIo/RC)表達(dá)式分別如下:

性能指數(shù)(Performance Index，PI)能夠較好地反映從激子到最后還原PSⅠ和最終電子受體這個(gè)過(guò)程的能量變化， 是應(yīng)激情況下光合生物總體活力的指標(biāo)[29]。PI由3個(gè)參數(shù)構(gòu)成: PSⅡ反應(yīng)中心的密度(RC/ABS)， 光子捕獲性能(PTR)， 被捕光子激發(fā)電子傳遞的性能(PET)， 表達(dá)式分別如下[30]:

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

所有的測(cè)定結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(n≥3)，數(shù)據(jù)采用 Excel 和 SPSS 進(jìn)行整理和統(tǒng)計(jì)分析， 使用 Origin9.0(OriginLab， USA)作圖。用單因素方差分析(One-way ANOVA， Duncan)進(jìn)行不同處理間的差異性分析， 差異顯著水平為P=0.05。

2 結(jié)果

2.1 東海原甲藻對(duì)羊棲菜合子發(fā)育的影響

受精后， 羊棲菜合子會(huì)進(jìn)行持續(xù)的減數(shù)分裂，經(jīng)1—2h相繼發(fā)育至64倍體或128倍體， 進(jìn)入幼胚生長(zhǎng)發(fā)育階段， 并在24h分生出透明的絲狀假根， 將合子固著于基質(zhì)上。圖1展示了合子(幼胚)在10d中形態(tài)的變化， 在不同共培養(yǎng)方式下， 合子均由最初的近橢圓形沿長(zhǎng)軸逐漸伸長(zhǎng)并發(fā)育成柱狀體。在培養(yǎng)6d后， 各處理組的合子形態(tài)保持正常， LC、RC和 FC處理組的合子在培養(yǎng) 6d后體積開(kāi)始明顯小于對(duì)照組(圖1)。此外， 在10d培養(yǎng)結(jié)束時(shí)各組合子大小依次為: 對(duì)照組＞RC組＞LC組＞FC組， 各組合子的平均體積分別為: 31.83×10-3、22.55×10-3、19.94×10-3和18.17×10-3mm3(圖2A)， 對(duì)應(yīng)的相對(duì)生長(zhǎng)速率分別為0.20 、0.13、0.12和0.12/d(圖2B)。與對(duì)照組相比， LC、RC和FC處理組合子的體積分別下降了37.37%、29.15%和 42.93% (圖2A)， 相對(duì)生長(zhǎng)速率分別下降了 41.23%、34.63%和42.02%(圖2B)。從合子體積和相對(duì)生長(zhǎng)速率的變化可以看出， LC、RC和FC處理對(duì)合子的生長(zhǎng)皆有顯著的(P＜0.05)抑制作用(圖2)， 其中FC及LC處理對(duì)合子抑制程度接近且均大于RC組。

2.2 東海原甲藻對(duì)羊棲菜合子色素含量的影響

在培養(yǎng)10d后， 在對(duì)照組、LC、RC和FC處理組中合子的葉綠素a的含量分別為 579.60、501.82、562.91和262.15 μg/g 鮮重(圖3)， 在3種處理方式下培養(yǎng)的合子的色素含量均顯著(P＜0.05)低于對(duì)照組(圖3)。與對(duì)照組相比， 在LC、RC和FC處理組合子的葉綠素a含量分別降低了13.42%、2.88%和54.77%， 對(duì)羊棲菜合子葉綠素a的抑制強(qiáng)度依次為FC＞LC＞RC。

2.3 東海原甲藻對(duì)羊棲菜合子光合活性的影響

圖4展示了不同處理方式下培養(yǎng)10d后羊棲菜合子的快速光曲線(RLCs， 圖4A)， 及由該曲線得到的表觀光合作用效率(α， 圖4B)和最大相對(duì)電子傳遞速率(rETRmax， 圖4C)。對(duì)照組、LC處理組、RC處理組和FC處理組羊棲菜合子的α分別為0.22、0.20、0.23和 0.20 electrons/photon; 對(duì)應(yīng)的最大相對(duì)電子傳遞速率分別為139.44、107.18、131.30和63.36 μmol electrons/(m2·s)。與對(duì)照組相比，LC和FC處理下合子的表觀光合作用效率分別降低了9.13%和7.10%， 而RC處理下則提高了5.88%;LC、RC和FC處理下合子的最大相對(duì)電子傳遞速率分別降低了23.14%、5.84%和54.57%; 即各處理組對(duì)羊棲菜合子最大相對(duì)電子傳遞速率和表觀光合作用效率的抑制強(qiáng)度依次為FC＞LC＞RC。

2.4 東海原甲藻對(duì)羊棲菜合子快速熒光動(dòng)力學(xué)曲線(OJIP)的影響

東海原甲藻處理10d后羊棲菜合子的初始快速熒光動(dòng)力學(xué)曲線以對(duì)數(shù)形式展示在圖5A中， 從該圖可以看出3種處理下羊棲菜合子的整體熒光值均小于對(duì)照組。為了方便各組間進(jìn)行比較， 將初始熒光曲線進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化， 得到相對(duì)可變熒光曲線(圖5B)，展示從50μs到1s之間各組熒光的變化情況。從圖5B中可以看出各處理組中各點(diǎn)的相對(duì)可變熒光(Vt)均大于對(duì)照組， 說(shuō)明處理組中合子的電子傳遞受阻。

圖5 東海原甲藻處理10d后羊棲菜合子的初始快速熒光動(dòng)力學(xué)曲線(OJIP; A)和標(biāo)準(zhǔn)化的快速熒光動(dòng)力學(xué)曲線(B)Fig. 5 Effects of P. donghaiense treatments on the original (A)and normalized OJIP curves (B) of S. fusiforme zygotes after 10 days treatments with P. donghaiense

2.5 JIP-test分析結(jié)果

在圖6展示的是與PSⅡ受體側(cè)量子產(chǎn)率相關(guān)的部分熒光參數(shù)。與對(duì)照組相比， FC處理組的VJ值提高了29.49%; 各處理組的Mo值沒(méi)有顯著差異;LC及FC處理組的φPo均顯著低于對(duì)照組， 分別降低了17.24%和35.81%; 與對(duì)照組相比， FC處理組的φo值顯著低于對(duì)照組， 降低了48.57%; FC處理組的φEo顯著低于對(duì)照組， 降低了64.89%。

圖6 由東海原甲藻處理10d后羊棲菜合子的快速光曲線得到的與能量分配相關(guān)參數(shù) (VJ， Mo， φPo， ψo(hù)， φEo)分析Fig. 6 Analysis of selected JIP-test parameters (VJ， Mo， φPo， ψo(hù)，φEo) derived from the chlorophyll fluorescence transients of S.fusiforme zygotes after 10 days treatments with P. donghaiense

圖7展示了東海原甲藻處理10d后羊棲菜合子的幾組比光合活性參數(shù)。參數(shù)ABS/RC表示反應(yīng)中心的表面積， FC處理組的ABS/RC值與對(duì)照組相比顯著(P＜0.05)提高， 增加了16.02%。TRo/RC值反映了反應(yīng)中心的活性， 該值在LC、RC和FC處理組中均顯著(P＜0.05)降低， 與對(duì)照組相比分別降低了13.86%、14.15%和26.20%。與反應(yīng)中心電子傳遞相關(guān)的參數(shù)ETo/RC值在FC處理組中顯著(P＜0.05)上升， 與對(duì)照組相比提高了71.36%。與熱耗散相關(guān)的DIo/RC值在各處理組中也呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)， 其中在FC處理組中顯著(P＜0.05)提高， 增加了66.89%(圖7)。

圖8展示了東海原甲藻處理10d后羊棲菜合子光合性能指數(shù)(PI)及其各參數(shù)的變化情況。從圖8A可以看出， 不同處理下羊棲菜合子的PI值均低于對(duì)照組(P＜0.05)， 其中FC處理組降低了76.89%。此外，與對(duì)照組相比， 與光合作用光反應(yīng)階段相關(guān)的PTR值在LC、RC和FC處理組中均顯著降低(P＜0.05)，分別降低了31.08%、19.56%和54.84%。PET及RC/ABS值在各組中沒(méi)有顯著差異(P＞0.05)。從圖8B中還可以看出， 對(duì)于LC、RC和FC處理組中PI值的降低， 暗反應(yīng)部分(PET值)的貢獻(xiàn)率最大。

3 討論

當(dāng)前研究結(jié)果表明， 東海原甲藻的活細(xì)胞懸浮液， 細(xì)胞破碎液及無(wú)細(xì)胞濾液均會(huì)對(duì)羊棲菜合子的生長(zhǎng)、色素合成及光合活性產(chǎn)生抑制作用， 但是不同處理方式對(duì)羊棲菜合子的抑制程度有差異?；凶饔迷谏锵嗷プ饔弥g的重要性已廣為人知，已有報(bào)道很多微藻會(huì)通過(guò)化感作用抑制其他共存藻類的生長(zhǎng)甚至導(dǎo)致細(xì)胞裂解死亡[31]。在本研究中， 東海原甲藻活細(xì)胞懸浮液處理組及無(wú)細(xì)胞濾液處理組中羊棲菜合子的生長(zhǎng)(圖1和圖2) 及光合活性(圖4—8)均被顯著抑制， 細(xì)胞破碎液處理組中羊棲菜合子葉綠素a的含量(圖3)與對(duì)照組相比變化不顯著。這表明東海原甲藻細(xì)胞分泌到培養(yǎng)液中的化感物質(zhì)能夠?qū)ρ驐撕献拥纳L(zhǎng)及光合作用產(chǎn)生抑制作用。Poulin等[32]的研究表明短凱倫藻(Karenia brevis)分泌到共培養(yǎng)液中的化感物質(zhì)能夠破壞競(jìng)爭(zhēng)對(duì)象細(xì)胞膜的完整性及光合作用過(guò)程進(jìn)而對(duì)競(jìng)爭(zhēng)者的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用。此外， Shang等[20]的研究結(jié)果表明羊棲菜合子的生長(zhǎng)和光合活性可以被米氏凱倫藻(K. mikimotoi)分泌的化感活性物質(zhì)所抑制， 并且該抑制作用與米氏凱倫藻細(xì)胞濃度呈正相關(guān)。

圖1 東海原甲藻對(duì)羊棲菜合子形態(tài)的影響Fig. 1 Effects of P. donghaiense treatments on morphology of S. fusiforme zygotes

圖2 東海原甲藻處理10d后羊棲菜合子的體積(A)和相對(duì)生長(zhǎng)速率(B)的變化Fig. 2 Effects of P. donghaiense treatment on volume (A) and relative growth rate (B) of Sargassum fusiforme zygotes after 10 days’ treatments with P. donghaiense

圖3 東海原甲藻處理10d后羊棲菜合子葉綠素a含量的變化Fig. 3 The effect of P. donghaiense treatments on chlorophyll a contents of Sargassum fusiforme zygotes after 10 days treatments with P. donghaiense

圖4 東海原甲藻處理10d后羊棲菜合子的光合作用(P)-光強(qiáng)(I)響應(yīng)曲線(A)、表觀光化學(xué)效率(B)和最大相對(duì)電子傳遞速率(C)Fig. 4 Effects of P. donghaiense treatments on the rETR (P)versus irradiance (I) curves (A)， the apparent photosynthetic efficiency (α; B) and the maximal electron transport rate (rETRmax;C) and of Sargassum fusiforme zygotes after 10 days treatments with P. donghaiense

細(xì)胞破碎液處理組由于細(xì)胞破碎會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物的大量釋放， 本應(yīng)包含更多的化感物質(zhì)， 從而導(dǎo)致羊棲菜合子受到更大的抑制， 但是該處理組中羊棲菜合子在生長(zhǎng)及光合活性方面受到的抑制程度卻沒(méi)有活細(xì)胞懸浮液處理組及無(wú)細(xì)胞濾液處理組大。這應(yīng)該是由于東海原甲藻細(xì)胞破碎使細(xì)胞中化感物質(zhì)釋放的同時(shí)， 藻細(xì)胞中能夠促進(jìn)羊棲菜合子生長(zhǎng)的大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)也釋放出來(lái)， 從而在很大程度上抵消了化感物質(zhì)的抑制作用[20]。已有研究表明東海原甲藻細(xì)胞中包含苯丙氨酸、賴氨酸和組氨酸等豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)， 且這些物質(zhì)可以刺激其他微藻的生長(zhǎng)[33]。此外， 大型海藻對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)具有很強(qiáng)的同化能力， 在沿海地區(qū)常用來(lái)降低水體的富營(yíng)養(yǎng)化[34]。因此， 細(xì)胞破碎液處理組中羊棲菜合子在受到化感物質(zhì)抑制的同時(shí)也能夠吸收東海原甲藻破碎而釋放的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)用于生長(zhǎng)。如Doblin等[35]的研究顯示鏈狀裸甲藻的生長(zhǎng)可以被低分子量的有機(jī)物質(zhì)促進(jìn)， 并提出鏈狀裸甲藻對(duì)這些物質(zhì)的吸收可能是由于有機(jī)物質(zhì)在細(xì)胞表面細(xì)菌和細(xì)胞外肽酶的作用下降解從而被細(xì)胞吸收。

已有研究針對(duì)石莼(Ulva lactuca)[36]及強(qiáng)壯前溝藻(Amphidinium carterae)[37]的光合特性進(jìn)行JIPtest分析， 結(jié)果表明利用JIP-test分析能夠很好地反映PSII反應(yīng)中心的活性狀態(tài)[38]。從對(duì)羊棲菜合子葉綠素a快速熒光動(dòng)力學(xué)曲線的JIP-test分析結(jié)果來(lái)看， 東海原甲藻活細(xì)胞懸浮液、細(xì)胞破碎液及無(wú)細(xì)胞濾液處理組羊棲菜合子的最大光化學(xué)產(chǎn)量(Fm)值均顯著降低， 表明東海原甲藻分泌的化感物質(zhì)能夠抑制羊棲菜合子的最大量子產(chǎn)率(圖6)。從抑制效果來(lái)看， 無(wú)細(xì)胞濾液處理組及活細(xì)胞懸浮液處理組的抑制程度大于細(xì)胞破碎液處理組， 這與各處理組對(duì)羊棲菜合子生長(zhǎng)及色素含量的抑制效果一致。此外， Shang等[20]的研究顯示羊棲菜合子的Fm可以被米氏凱倫藻分泌的化感物質(zhì)所抑制， 而米氏凱倫藻和東海原甲藻都是在我國(guó)東海長(zhǎng)江口廣泛分布的有害赤潮種。

在某些脅迫條件下， PSⅡ反應(yīng)中心會(huì)部分甚至全部失活， 從而導(dǎo)致單個(gè)活性反應(yīng)中心吸收的光能增加， 但大部分被捕獲光能不能用來(lái)推動(dòng)電子傳遞，而是轉(zhuǎn)化為熱能耗散掉[28，39]。在本研究中， 無(wú)細(xì)胞濾液處理組、活細(xì)胞懸浮液處理組及細(xì)胞破碎液處理組中羊棲菜合子的ABS/RC及DIo/RC參數(shù)比對(duì)照組顯著升高， 而參數(shù)TRo/RC顯著降低(圖7B)， 該結(jié)果表明東海原甲藻處理導(dǎo)致了羊棲菜合子PSⅡ部分反應(yīng)中心失活， 并且用于電子傳遞將QA還原為Q-A的能量減少， 從而使大部分能量轉(zhuǎn)化為熱能耗散掉。這證明了東海原甲藻所分泌的化感物質(zhì)可以通過(guò)使羊棲菜合子活性反應(yīng)中心失活從而對(duì)其光合作用產(chǎn)生抑制作用。

圖7 東海原甲藻處理10d后羊棲菜合子每PSⅡ反應(yīng)中心(/RC)的能量通量變化Fig. 7 Fast chlorophyll transients energy flux ratios per RC of S.fusiforme zygotes after 10 days treatments with P. donghaiense

光合性能參數(shù)PI包含的3個(gè)參數(shù)(PTR、PET和RC/ABS)， 可以反映光合生物光合機(jī)構(gòu)的狀態(tài)[40]。其中捕光性能參數(shù)PTR的降低表示RCs產(chǎn)生了持續(xù)性損傷進(jìn)而導(dǎo)致RCs的失活[41]。在本研究中， 與對(duì)照組相比， 各處理組的PI值、PET值及PTR均出現(xiàn)了降低(圖8A)， 其中無(wú)細(xì)胞濾液處理組的PI值顯著降低(P＜0.05)， 而PET對(duì)PI降低的貢獻(xiàn)最大(圖8B)， 該結(jié)果表明東海原甲藻抑制了羊棲菜合子的光合活性， 而主要的抑制作用發(fā)生在PSⅡ的暗反應(yīng)階段。此外，PTR值的降低也表明東海原甲藻對(duì)羊棲菜合子PSⅡ活性反應(yīng)中心具有抑制作用。

圖8 東海原甲藻處理10d后羊棲菜合子光合性能指數(shù)(PI)及其參數(shù)(PTR、PET 和RC/ABS)變化(A)及各性能指數(shù)相對(duì)于對(duì)照組降低的比率(B)Fig. 8 Changes in PI and its components of Sargassum fusiforme zygotes after 10 days treatments with Prorocentrum donghaiense(A)， and the ratios relative to the mono-cultured ones (B)

4 結(jié)論

細(xì)胞密度為1.00×105cells/mL下的東海原甲藻活細(xì)胞懸浮液、細(xì)胞破碎液和無(wú)細(xì)胞濾液均能顯著抑制羊棲菜合子的生長(zhǎng)、光合作用及葉綠素a的合成， 其中無(wú)細(xì)胞濾液對(duì)羊棲菜合子的抑制作用最強(qiáng)， 其次是活細(xì)胞懸浮液， 再次是細(xì)胞破碎液。這表明東海原甲藻能夠通過(guò)向細(xì)胞外釋放化感物質(zhì)對(duì)羊棲菜合子產(chǎn)生抑制作用， 而細(xì)胞破碎液中可能含有某些能夠刺激羊棲菜合子生長(zhǎng)的物質(zhì)， 從而在一定程度上抵消了化感物質(zhì)的抑制作用。JIPtest分析結(jié)果表明東海原甲藻分泌的化感物質(zhì)主要抑制了PSⅡ中的電子傳遞， 即通過(guò)抑制被捕光子激發(fā)電子傳遞的效率(PET)來(lái)抑制羊棲菜合子的光合作用。此外， 化感物質(zhì)還能引起PSⅡ的部分RCs失活， 從而使大量的激發(fā)能轉(zhuǎn)化為熱能耗散掉， 進(jìn)一步降低了羊棲菜合子的光合活性。