任國(guó)梁 董志國(guó) ， 李德盛 夏 青 柳佳玲 崔振權(quán) 梁夏菲

(1. 江蘇海洋大學(xué)， 江蘇省海洋生物資源與環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 連云港 222005; 2. 江蘇海洋大學(xué)， 江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 連云港 222005; 3. 江蘇省海洋生物技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心， 連云港 222005)

化感作用(Allelochemical)是植物或微生物向周?chē)h(huán)境中釋放化學(xué)物質(zhì)進(jìn)而影響到其他植物生長(zhǎng)的一種克生作用[1—3]。三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)是在海洋中廣泛分布的一種優(yōu)質(zhì)硅藻餌料， 常被應(yīng)用于蝦、蟹、貝的苗種餌料[4—6]。解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)是一種重要的生防芽孢桿菌(Bacillus subtilis)， 可分泌對(duì)多種真菌與細(xì)菌有抑制作用的化學(xué)物質(zhì)， 如脂類(lèi)抗生素、寡肽酶、抑菌蛋白類(lèi)及一些細(xì)胞外物質(zhì)等[7—10]。解淀粉芽孢桿菌被廣泛應(yīng)用于抑制病原菌等方面，如解淀粉芽孢桿菌BN-9對(duì)大腸桿菌具有抑制作用[11]，解淀粉芽孢桿菌G1對(duì)痢疾病原菌具有拮抗作用[12]，及對(duì)植物病毒如黃瓜花葉病毒(CMV)和甜瓜花葉病毒(MMV)的侵染等[13]。除了抑制作用， 有研究發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌FZB45具有肌醇六磷酸酶活性，可以在缺磷的條件下刺激植物生長(zhǎng)[9]。而且解淀粉芽孢桿菌微膠囊無(wú)毒， 對(duì)養(yǎng)殖水體中的理化因子的影響也在常見(jiàn)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的安全濃度范圍內(nèi)， 因此被作為水產(chǎn)養(yǎng)殖中的水質(zhì)改良劑而大面積應(yīng)用[14]。近年來(lái)， 研究大型水生植物浸取液與微藻之間的化感作用日益增多[15—18]， 但是在微生物尤其是解淀粉芽孢桿菌對(duì)海洋微藻的作用方面的研究相對(duì)較少。本文以海水中常見(jiàn)的硅藻餌料三角褐指藻為實(shí)驗(yàn)材料， 探究解淀粉芽孢桿菌及其分泌物對(duì)三角褐指藻的化感作用。

1 材料與方法

1.1 菌株獲得及其代謝物的制備

供試菌株為解淀粉芽孢桿菌B5， 由本實(shí)驗(yàn)室從對(duì)蝦養(yǎng)殖海水中直接分離、篩選、鑒定后備用。用種子培養(yǎng)基接種經(jīng)發(fā)酵后的解淀粉芽孢桿菌制備種子培養(yǎng)液， 再用發(fā)酵培養(yǎng)基接種種子培養(yǎng)液制備發(fā)酵液。

種子培養(yǎng)基: 葡萄糖、磷酸氫二鉀各2.5 g， 胰蛋白胨17 g， 氯化鈉25 g， 蒸餾水1000 mL， 121℃， 滅菌0.5h。

發(fā)酵培養(yǎng)基: 玉米粉2.9 g， 豆餅粉12.5 g， 磷酸氫二鉀1.5 g， 氯化鈉27.6 g， 蒸餾水1000 mL， 121℃，滅菌0.5h。

發(fā)酵采用16 L發(fā)酵罐。發(fā)酵條件: 裝液系數(shù)0.75， 初始pH 7.5， 接種量3%， 發(fā)酵溫度31℃， 機(jī)械攪拌轉(zhuǎn)速180 r/min， 通氣量1.2 vvm， 發(fā)酵周期36h。

代謝產(chǎn)物獲取方法: 取部分發(fā)酵產(chǎn)物在0.22 μm的微孔的條件下進(jìn)行超濾， 得到解淀粉芽孢桿菌菌液和其代謝產(chǎn)物; 另一部分不經(jīng)超濾， 為解淀粉芽孢桿菌液和代謝產(chǎn)物的混合液， 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 三角褐指藻培養(yǎng)條件

供試三角褐指藻藻種取自上海海洋大學(xué)藻種室。初始濃度為1×105cells/mL， 逐級(jí)擴(kuò)培后于5 L錐形瓶中長(zhǎng)期培養(yǎng)。自然海水取自江蘇連云港周邊海域， 經(jīng)抽濾、滅菌后使用。光照培養(yǎng)箱參數(shù)設(shè)置為: 溫度20℃， 光強(qiáng)63 μmol photons/(m2·s)， 光暗比為12h∶12h。營(yíng)養(yǎng)液為含硅的f/2培養(yǎng)液。每天定時(shí)取樣且搖動(dòng)培養(yǎng)瓶， 期間維持藻液pH在7.9—8.1。

1.3 三角褐指藻生長(zhǎng)曲線的繪制

用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)， 并換算長(zhǎng)期培養(yǎng)藻液的濃度。稀釋藻液， 使其濃度分別為原來(lái)的20%、40%、60%、80%和100%， 在663 nm波長(zhǎng)處分別測(cè)量吸光值， 繪制藻密度與吸光度的線性標(biāo)準(zhǔn)曲線，為后續(xù)計(jì)算三角褐指藻細(xì)胞數(shù)提供參考。

1.4 解淀粉芽孢桿菌對(duì)三角褐指藻的化感作用

本次實(shí)驗(yàn)所用錐形瓶規(guī)格為250 mL， 使用前均經(jīng)反復(fù)沖洗及高壓滅菌處理。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的三角褐指藻50 mL接種到200 mL新鮮培養(yǎng)液中，初始密度為每毫升1.83×106個(gè)(1.83×106ind./mL)。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行4d， 菌-藻共培條件同1.2。

實(shí)驗(yàn)設(shè)置對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組和空白組3個(gè)不同組別， 每處理三次重復(fù)。對(duì)照組只接種三角褐指藻(I組); 實(shí)驗(yàn)組分為3組， 每組先接種與對(duì)照組等量的三角褐指藻， 再分別接種數(shù)量級(jí)為109的解淀粉芽孢桿菌液(菌液組P+B)、解淀粉芽孢桿菌代謝產(chǎn)物(代謝物組P+M)、解淀粉芽孢桿菌液及代謝產(chǎn)物混合液(混合液組P+BM)， 添加量分別為100、500和1000 μL; 空白組也分為三組， 不接藻種， 分別對(duì)應(yīng)對(duì)照組添加相同劑量的解淀粉芽孢桿菌添加液。每天定時(shí)測(cè)量每組的吸光值， 計(jì)算三角褐指藻細(xì)胞濃度， 其中實(shí)驗(yàn)組藻細(xì)胞濃度計(jì)算時(shí)， 最終吸光值為對(duì)照組吸光值減去對(duì)應(yīng)空白組的吸光值。

1.5 數(shù)據(jù)處理

抑制率公式:PI(%)＝(1-N/N0)×100%。其中，N0和N分別為對(duì)照組三角褐指藻濃度和試驗(yàn)組三角褐指藻濃度;PI為抑制比例，PI=50%時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度為EC50。

數(shù)據(jù)用SPSS 23軟件做顯著性分析， 并進(jìn)行Duncan多重比較， 以P＜0.05作為差異顯著水平。

2 結(jié)果

2.1 解淀粉芽孢桿菌菌液對(duì)三角褐指藻生長(zhǎng)的影響

與對(duì)照組相比， 在前3天時(shí)P+B100、P+B500、P+B1000三組的生長(zhǎng)率沒(méi)有顯著變化， 但是三角褐指藻的藻細(xì)胞數(shù)均低于對(duì)照組， 到第4天時(shí)藻細(xì)胞數(shù)顯著低于對(duì)照組(P＜0.05， 圖1)。P+B100組抑制率呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢(shì)， P+B500與P+B1000兩組在第1天時(shí)抑制率顯著高于P+B100組， 到第2天有所下降， P+B100組抑制率在第3天開(kāi)始大幅度增加，對(duì)應(yīng)的藻細(xì)胞數(shù)增加速率放緩， P+B500組在第2至第3天抑制率顯著增加， 所對(duì)應(yīng)的藻細(xì)胞數(shù)最少(圖2)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束， P+B100、P+B500和P+B1000的三角褐指藻藻細(xì)胞數(shù)分別比對(duì)照組低28.52%、35.56%和22.36%。

圖2 添加解淀粉芽孢桿菌菌液組三角褐指藻抑制率Fig. 2 Inhibition rate of P. tricornutum added with B. amyloliquefaciens bacterial solution

2.2 解淀粉芽孢桿菌代謝產(chǎn)物對(duì)三角褐指藻生長(zhǎng)的影響

在第1至第4天P+M100、P+M500和P+M1000三組藻細(xì)胞數(shù)均顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)， 到第3天P+M1000組藻細(xì)胞數(shù)與其他三組相比迅速降低， 表現(xiàn)出很好的抑制性， 隨著解淀粉芽孢桿菌代謝產(chǎn)物添加量增加， 三角褐指藻生長(zhǎng)率隨之減少， P+M1000組在第3天發(fā)現(xiàn)藻細(xì)胞數(shù)降低的現(xiàn)象(圖3)。P+M100、P+M500和P+M1000三組在第1天抑制率增長(zhǎng)迅速，在第2至第3天3組抑制率的增長(zhǎng)均放緩， 在第3至第4天P+M100和P+M500兩組抑制率有所下降，P+M1000抑制率迅速升高(圖4)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束， P+M100、P+M500和P+M1000的三角褐指藻藻細(xì)胞數(shù)分別比對(duì)照組低11.80%、41.20%和56.69%。

圖3 添加解淀粉芽孢桿菌代謝物組三角褐指藻生長(zhǎng)曲線Fig. 3 Growth curve of P. tricornutum with the metabolite group of B. amyloliquefaciens

圖4 添加解淀粉芽孢桿菌代謝物組三角褐指藻抑制率Fig. 4 Inhibition rate of P. tricornutum in the metabolite group of B. amyloliquefaciens

2.3 解淀粉芽孢桿菌及代謝產(chǎn)物混合液對(duì)三角褐指藻生長(zhǎng)的影響

與對(duì)照組相比， P+BM100、P+BM500和P+BM1000三組三角褐指藻均生長(zhǎng)緩慢， 在第1至第2天P+BM1000藻細(xì)胞數(shù)呈下降趨勢(shì)， P+BM100和P+BM500藻細(xì)胞數(shù)第1至第3天呈緩慢增長(zhǎng)的態(tài)勢(shì)，在第3至第4天則開(kāi)始降低， P+BM1000組則明顯低于其他三組(圖5)。P+BM100、P+BM500和P+BM1000三組對(duì)三角褐指藻均表現(xiàn)出了較好的抑制性， 但都沒(méi)有超過(guò)50%， 在第2天時(shí)P+BM1000組抑制率超過(guò)50%達(dá)到了51.32%。到第3天時(shí)P+BM500和P+BM1000兩組對(duì)三角褐指藻的抑制率均超過(guò)50%， 分別達(dá)到了54.87%與65.05%(圖6)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束， P+BM100、P+BM500和P+BM1000三組的藻細(xì)胞數(shù)分別比對(duì)照組低了37.32%、54.93%和64.96%。

圖5 添加混合液組三角褐指藻生長(zhǎng)曲線Fig. 5 Growth curve of P. tricornutum with mixed solution group

圖6 添加混合液組三角褐指藻抑制率Fig. 6 Inhibition rate of P. tricornutum in mixed solution group

2.4 相同條件下不同添加物對(duì)三角褐指藻生長(zhǎng)的影響

添加解淀粉芽孢桿菌菌液、代謝產(chǎn)物以及混合物三組三角褐指藻細(xì)胞數(shù)均低于對(duì)照組， 添加物的量的不同對(duì)藻細(xì)胞數(shù)的數(shù)量也有影響。除P+B100組外， 其余各組藻細(xì)胞數(shù)均隨著添加物的量的增加而減少。添加物的量相同時(shí)， 除P+M100組外， 其余實(shí)驗(yàn)組均表現(xiàn)為解淀粉芽孢桿菌菌液、代謝產(chǎn)物、混合物依次減少的現(xiàn)象(圖7)。而三者對(duì)三角褐指藻的抑制率則同三角褐指藻的藻細(xì)胞數(shù)相反(圖8)， 除P+B500組外， 其余實(shí)驗(yàn)組抑制率均隨添加物的增加而增加， 且P+BM500、P+M1000和P+BM1000三組對(duì)三角褐指藻的抑制率均達(dá)到50%以上， 分別為54.87%、56.67%和65.05%。

圖7 添加不同物質(zhì)組三角褐指藻細(xì)胞數(shù)Fig. 7 Number of P. tricornutum cells with different substance groups

圖8 添加不同物質(zhì)組三角褐指藻抑制率Fig. 8 Inhibition rate of P. tricornutum with different substance groups

3 討論

化感作用是植物或者微生物向周?chē)h(huán)境中釋放代謝產(chǎn)物從而影響與它臨近的植物或微生物的生長(zhǎng)[19]。研究表明， 水生植物與微生物之間的化感作用可以對(duì)水域生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)造成影響， 過(guò)去近30年中， 許多研究學(xué)者對(duì)“藻-菌”相互關(guān)系進(jìn)行探索， “藻-菌”相互關(guān)系一直是海洋微藻研究方面的熱點(diǎn)[20—24]。解淀粉芽孢桿菌作為一類(lèi)重要的生防微生物， 不僅對(duì)植物生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用， 其在生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物還可抑制藻類(lèi)生長(zhǎng)。朱芝秀等[25]在對(duì)解淀粉芽孢桿菌的研究中發(fā)現(xiàn)， 從鯽腸道分離得到一株解淀粉芽孢桿菌菌株JX001對(duì)嗜水氣單胞菌具有較好的抑制作用。許波[26]在進(jìn)行一株芽孢桿菌溶藻活性物質(zhì)的分離及結(jié)構(gòu)分析的研究中發(fā)現(xiàn)， 解淀粉芽孢桿菌A對(duì)銅綠微囊藻905A具有溶藻性， 同時(shí)發(fā)現(xiàn)T1芽孢桿菌是一株擁有高效殺藻作用的菌株， 具有較強(qiáng)的溶藻活性。李成果[27]研究發(fā)現(xiàn)， 芽孢桿菌的抑菌物質(zhì)伊枯草菌具有抑制植物A病原菌孢子生長(zhǎng)的作用， 解淀粉芽孢桿菌L3不僅對(duì)西瓜枯萎病發(fā)生具有防控作用， 同時(shí)對(duì)西瓜的生長(zhǎng)具有明顯的促生作用。本研究在實(shí)驗(yàn)室中探究了解淀粉芽孢桿菌及其代謝產(chǎn)物對(duì)三角褐指藻生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明， 解淀粉芽孢桿菌、其代謝產(chǎn)物和兩種混合液均表現(xiàn)出了抑制三角褐指藻生長(zhǎng)的特性， 解淀粉芽孢桿菌對(duì)三角褐指藻的抑制作用不明顯， 代謝產(chǎn)物和兩種的混合液對(duì)三角褐指藻表現(xiàn)出了明顯的抑制效果。

本研究在培養(yǎng)介質(zhì)中， 添加解淀粉芽孢桿菌代謝產(chǎn)物組與添加混合液組明顯抑制了三角褐指藻的生長(zhǎng)， 說(shuō)明解淀粉芽孢桿菌及其代謝產(chǎn)物有抑制作用且存在一個(gè)閾值， 在這個(gè)閾值之下， 存在著濃度效應(yīng)， 濃度越高抑制作用越明顯。這與于靚等的研究結(jié)果一致， 他們認(rèn)為解淀粉芽孢桿菌T1所產(chǎn)生的溶藻活性物質(zhì)在一定藻細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)， 抑藻效果隨著T1無(wú)菌濾液濃度的增加而顯著加強(qiáng)[28]。在同等的濃度下， 添加解淀粉芽孢桿菌組不如其他兩組抑制作用明顯， 添加混合液組與添加代謝產(chǎn)物組所顯示出的抑制作用遠(yuǎn)強(qiáng)于添加解淀粉芽孢桿菌組，添加混合液組的抑制作用又比添加代謝產(chǎn)物組更強(qiáng)， 由此說(shuō)明解淀粉芽孢桿菌與其代謝產(chǎn)物對(duì)三角褐指藻的抑制作用可以疊加， 二者同時(shí)存在時(shí)抑制效果最強(qiáng)。而這兩組表現(xiàn)出的抑制效果沒(méi)有特別大的差異。由此說(shuō)明解淀粉芽孢桿菌代謝產(chǎn)物在對(duì)三角褐指藻產(chǎn)生的抑制效果中起主要作用。

綜上所述， 解淀粉芽孢桿菌對(duì)三角褐指藻沒(méi)有明顯的抑制作用， 但其高濃度的代謝產(chǎn)物與兩者混合液可有效的抑制三角褐指藻的生長(zhǎng)， 并存在著一個(gè)閾值， 在這個(gè)閾值之下， 具有濃度效應(yīng)， 濃度越高抑制效果越明顯， 解淀粉芽孢桿菌與其代謝產(chǎn)物對(duì)三角褐指藻的抑制作用可以疊加， 二者同時(shí)存在時(shí)抑制效果最強(qiáng)。