陳乾 秦銘 徐志云

(1.中國(guó)人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海 200433；2.海軍軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院心血管外科，上海 200433)

鈣化性主動(dòng)脈瓣疾病(calcific aortic valve disease，CAVD)是一種礦物質(zhì)代謝失調(diào)的退行性疾病，病理表現(xiàn)為主動(dòng)脈瓣的增厚和鈣鹽沉積，其病理機(jī)制類似于成骨分化。主動(dòng)脈瓣膜鈣化與動(dòng)脈粥樣硬化具有相似的病理特征，包括炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)、脂質(zhì)斑塊的沉積以及最終的鈣化等[1]。近些年來(lái)研究[2]顯示炎癥在調(diào)節(jié)主動(dòng)脈瓣鈣化和狹窄中發(fā)揮關(guān)鍵作用，表明調(diào)控瓣膜細(xì)胞免疫可能是治療CAVD的可行目標(biāo)之一。

健康主動(dòng)脈瓣瓣葉中約有15%的細(xì)胞為造血干細(xì)胞衍生細(xì)胞，其中大部分白細(xì)胞為單核/巨噬細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞，以及少量的淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞[3-4]。單核/巨噬細(xì)胞作為機(jī)體非特異性免疫細(xì)胞，在主動(dòng)脈瓣膜鈣化病理進(jìn)程中通過(guò)分泌功能和吞噬作用扮演了極其重要的作用。現(xiàn)通過(guò)總結(jié)單核/巨噬細(xì)胞與主動(dòng)脈瓣鈣化的機(jī)制研究，以為主動(dòng)脈瓣膜鈣化性病變的臨床治療提供理論基礎(chǔ)和潛在的治療方法。

1 單核/巨噬細(xì)胞的分型和功能

巨噬細(xì)胞具有多個(gè)亞型，包括M0、M1、M2、Mox和M4型巨噬細(xì)胞[5]。M0巨噬細(xì)胞為未活化的巨噬細(xì)胞，可進(jìn)一步極化為M1和M2亞型。M1巨噬細(xì)胞在脂多糖或Th1細(xì)胞因子(如γ干擾素)的刺激下激活，促進(jìn)炎癥并清除病原微生物發(fā)揮作用[6]，而M2巨噬細(xì)胞由Th2細(xì)胞因子[如白介素(interleukin，IL)-4和IL-13]激活，通過(guò)產(chǎn)生IL-10、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β等抗炎因子抑制炎癥，促進(jìn)受損組織修復(fù)發(fā)揮作用[7]。Mox巨噬細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化組織中顯著增加，其由氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)誘導(dǎo)并具有致動(dòng)脈粥樣硬化特性。M4巨噬細(xì)胞由血小板趨化因子4誘導(dǎo)，與斑塊不穩(wěn)定有關(guān)，與M1巨噬細(xì)胞一樣具有促炎作用，但缺乏吞噬能力[8]。

2 瓣膜單核/巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)機(jī)制

瓣膜組織中的巨噬細(xì)胞由血液中的單核細(xì)胞分化而來(lái)。在心動(dòng)周期中，主動(dòng)脈瓣小葉承受持續(xù)的彎曲、剪切、拉伸和壓縮應(yīng)力，從而可能導(dǎo)致瓣膜內(nèi)皮細(xì)胞活化或損傷，降低瓣膜內(nèi)皮的完整性，誘導(dǎo)黏附分子的后續(xù)表達(dá)[9]。在手術(shù)切除的鈣化心臟瓣膜表面發(fā)現(xiàn)黏附分子血管細(xì)胞黏附因子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)、細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)和E選擇素的表達(dá)增加，表明內(nèi)皮的不完整性和黏附分子的表達(dá)作為可能的機(jī)制促進(jìn)了單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)瓣膜組織[9-10]。此外，巨噬細(xì)胞在非鈣化主動(dòng)脈瓣中的浸潤(rùn)隨年齡增高而逐漸增加，這可能與年齡增長(zhǎng)導(dǎo)致的瓣膜損傷增加相關(guān)[5]。

3 瓣膜組織及體液中單核/巨噬細(xì)胞的分布

巨噬細(xì)胞是主動(dòng)脈瓣細(xì)胞免疫的重要組成部分，在所有免疫細(xì)胞中占比最高[8]。在健康主動(dòng)脈瓣膜中，纖維層、海綿層和心室層均有巨噬細(xì)胞分布，其中海綿層中巨噬細(xì)胞的比例相對(duì)較高，這可能與海綿層浸潤(rùn)的微血管網(wǎng)絡(luò)有關(guān)[5]。而與健康瓣膜相比，鈣化主動(dòng)脈瓣膜中M0、M1浸潤(rùn)增加，M2浸潤(rùn)明顯減少[5，11]。此外，Mox巨噬細(xì)胞在鈣化主動(dòng)脈瓣膜中的比例明顯高于健康瓣膜，然而其激活的機(jī)制和在主動(dòng)脈瓣鈣化機(jī)制中的作用仍有待進(jìn)一步研究[5]。

Schwartzenberg等[12]的研究表明，循環(huán)血中單核細(xì)胞的計(jì)數(shù)隨著主動(dòng)脈瓣狹窄嚴(yán)重程度的增加逐漸減少。然而中間單核細(xì)胞作為一種具有炎性特征的單核細(xì)胞亞群，當(dāng)嚴(yán)重主動(dòng)脈瓣狹窄存在時(shí)，其外周血水平顯著升高，這可能與機(jī)體慢性炎癥和顯著的血流動(dòng)力學(xué)紊亂相互作用的結(jié)果相關(guān)[13]。

4 先天性二葉主動(dòng)脈瓣鈣化與巨噬細(xì)胞

臨床流行病學(xué)研究[14]表明，同正常三葉主動(dòng)脈瓣人群相比，先天性二葉主動(dòng)脈瓣(congenital bicuspid aortic valve，CBAV)人群更容易進(jìn)展為瓣膜狹窄。二尖瓣中增加的剪切應(yīng)力可能會(huì)調(diào)節(jié)瓣膜內(nèi)的炎癥過(guò)程[15]。在組織學(xué)中發(fā)現(xiàn)，CBAV人群的M1巨噬細(xì)胞密度相對(duì)較高，M2巨噬細(xì)胞密度相對(duì)較低，這與瓣膜組織中巨噬細(xì)胞集落刺激因子表達(dá)降低導(dǎo)致M1巨噬細(xì)胞向M2巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化降低有關(guān)，而M1巨噬細(xì)胞的持續(xù)浸潤(rùn)可能有助于CBAV的鈣化[16]。此外，CBAV中新血管生成、小葉內(nèi)出血也是導(dǎo)致CBAV鈣化快速進(jìn)展的重要原因[17]。單核/巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)導(dǎo)致的炎癥還會(huì)刺激病理性血管生成過(guò)程，導(dǎo)致鈣化瓣膜變性的進(jìn)展[18]。

5 單核/巨噬細(xì)胞通過(guò)分泌功能誘導(dǎo)瓣膜鈣化

5.1 細(xì)胞因子

瓣膜間質(zhì)細(xì)胞(valvular interstitial cells，VICs)在未受刺激的巨噬細(xì)胞來(lái)源的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)下，其成骨分化進(jìn)程明顯加快。在M1巨噬細(xì)胞來(lái)源的條件培養(yǎng)基中這一作用被進(jìn)一步增強(qiáng)，這與M1巨噬細(xì)胞通過(guò)分泌多種促炎細(xì)胞因子，進(jìn)而轉(zhuǎn)換VICs的表型有關(guān)[19]。Liu等[2]發(fā)現(xiàn)高脂飲食飼養(yǎng)的ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈瓣巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)增強(qiáng)，并伴隨著VICs向肌成纖維細(xì)胞分化的增加。M1巨噬細(xì)胞分泌的炎性因子如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、IL-1β能夠促進(jìn)瓣膜肌成纖維細(xì)胞失活，并促進(jìn)其增殖[19]。TNF-α是一種重要的炎癥微環(huán)境介質(zhì)，巨噬細(xì)胞通過(guò)分泌TNF-α上調(diào)VICs中Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)2的水平，從而加劇瓣膜炎癥以及接下來(lái)的成骨進(jìn)程，并通過(guò)激活核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)來(lái)上調(diào)骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogenetic protein 2，BMP2)的表達(dá)并促進(jìn)VICs的鈣化[20]。Yu等[21]證明TNF-α可通過(guò)BMP2-Dlx5途徑加速主動(dòng)脈瓣的鈣化。M1巨噬細(xì)胞分泌的IL-6促進(jìn)了Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runt-related transcription factor 2，RUNX2)核定位和BMP2的表達(dá)，促進(jìn)失活的瓣膜肌成纖維細(xì)胞向成骨細(xì)胞樣細(xì)胞進(jìn)行表型轉(zhuǎn)化[22-23]。IL-18主要在巨噬細(xì)胞中表達(dá)，尤其是在嚴(yán)重鈣化區(qū)域高表達(dá)，可以有效促進(jìn)VICs的肌成纖維細(xì)胞分化[24]。IL-18促進(jìn)了主動(dòng)脈瓣葉中巨噬細(xì)胞的紅細(xì)胞吞噬作用和紅細(xì)胞降解，而紅細(xì)胞降解產(chǎn)物可促進(jìn)VICs的成骨分化和鈣沉積[25]。IL-17由Th17細(xì)胞釋放，在動(dòng)脈粥樣硬化病理機(jī)制中扮演重要作用[26]。在主動(dòng)脈瓣炎癥模型中，IL-17與巨噬細(xì)胞中的IL-17受體的結(jié)合促進(jìn)了巨噬細(xì)胞NF-κB通路激活，并誘導(dǎo)了VICs的肌成纖維細(xì)胞樣分化[2]。

IL-37是一種潛在的炎癥抑制因子，能夠通過(guò)NF-κB和Notch通路抑制M1巨噬細(xì)胞極化，并激活M2巨噬細(xì)胞，從而發(fā)揮抗炎作用，延緩CAVD的鈣化過(guò)程[27-28]。而鈣化瓣膜中發(fā)現(xiàn)IL-37的表達(dá)較低，IL-37調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化和減輕瓣膜炎癥的功能減弱，這可能與主動(dòng)脈瓣鈣化機(jī)制相關(guān)[27]。TLR7在人主動(dòng)脈瓣CAVD發(fā)病過(guò)程中上調(diào)，并與M2巨噬細(xì)胞共定位，在TLR7配體刺激下，巨噬細(xì)胞釋放抗炎細(xì)胞因子IL-10，并促進(jìn)主動(dòng)脈瓣膜組織釋放TNF-α和粒巨噬細(xì)胞集落刺激因子等[29]。

5.2 胞外囊泡

巨噬細(xì)胞除了直接釋放炎癥因子作用于VICs外，也可通過(guò)分泌胞外囊泡的方式參與瓣膜鈣化的進(jìn)程。Li等[30]的研究表明，M1通過(guò)衍生的胞外囊泡將miR-214遞送至VICs并隨后下調(diào)VICs的Twist相關(guān)蛋白1，從而促進(jìn)主動(dòng)脈瓣膜鈣化的進(jìn)展。從單核細(xì)胞釋放的外泌體TNF-α可能促進(jìn)VICs中黏附分子表達(dá)的上調(diào)，促進(jìn)瓣膜炎癥的產(chǎn)生[20]。

5.3 基質(zhì)分解

巨噬細(xì)胞在早期主動(dòng)脈瓣疾病中發(fā)揮蛋白水解活性，在主動(dòng)脈瓣鈣化中發(fā)揮重要作用。在炎癥主動(dòng)脈瓣膜中，巨噬細(xì)胞衍生的組織蛋白酶S和其他彈性分解酶參與細(xì)胞外基質(zhì)的降解，而降解產(chǎn)物的釋放可能會(huì)招募更多的巨噬細(xì)胞，進(jìn)一步加重瓣膜炎癥[31]。瓣膜細(xì)胞外基質(zhì)的重塑可能導(dǎo)致瓣膜功能障礙，由此產(chǎn)生的流動(dòng)模式的變化可能誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞活化為肌成纖維細(xì)胞[9]。Joghetaei等[32]的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)劑(CD147)在鈣化主動(dòng)脈瓣中的巨噬細(xì)胞表達(dá)，并激活鈣化性主動(dòng)脈瓣狹窄中金屬基質(zhì)蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)來(lái)誘導(dǎo)蛋白水解，從而促進(jìn)單核細(xì)胞遷移，加速瓣膜炎癥和鈣化。雙糖鏈蛋白聚糖作為一種胞外基質(zhì)蛋白聚糖，在細(xì)胞外基質(zhì)水解后通過(guò)TLR2和TLR4在培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞中誘導(dǎo)VICs中ICAM-1和單核細(xì)胞趨化蛋白1的表達(dá)[33]。巨噬細(xì)胞分泌的IL-1和TNF-α能夠刺激肌成纖維細(xì)胞表達(dá)MMP-1和MMP-2，從而調(diào)節(jié)鈣化性主動(dòng)脈瓣狹窄中細(xì)胞外基質(zhì)的重塑[34]。

6 Notch1突變?cè)诰奘杉?xì)胞誘導(dǎo)瓣膜鈣化中的作用

患者Notch1突變與CAVD發(fā)病率的升高具有明顯相關(guān)性。Notch1信號(hào)表達(dá)不足可驅(qū)動(dòng)巨噬細(xì)胞在主動(dòng)脈瓣的浸潤(rùn)和成熟并驅(qū)動(dòng)鈣化進(jìn)程。Raddatz等[35]的研究表明，Notch1突變導(dǎo)致巨噬細(xì)胞暴露的增加可引起信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)剪接的急劇變化，導(dǎo)致抑制性STAT3β剪接產(chǎn)物的減少并促進(jìn)鈣化進(jìn)程。而STAT3β能夠結(jié)合RUNX2抑制其作為轉(zhuǎn)錄因子的功能從而緩解鈣化進(jìn)程[36]。

7 單核/巨噬細(xì)胞的脂質(zhì)清理作用與瓣膜鈣化

鈣化瓣膜中存在ox-LDL，并且它們與巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞共定位，表明瓣膜炎癥過(guò)程與氧化修飾脂質(zhì)的存在密切相關(guān)[37]。單核細(xì)胞與VICs共培養(yǎng)時(shí)，可促進(jìn)VICs表達(dá)ICAM-1、VCAM-1、單核細(xì)胞趨化蛋白-1等黏附分子，進(jìn)而脂蛋白在瓣膜內(nèi)皮細(xì)胞下積聚，并被修飾成ox-LDL。在動(dòng)脈粥樣硬化病變區(qū)域中巨噬細(xì)胞攝取ox-LDL并形成泡沫細(xì)胞，而在高膽固醇血癥引起的瓣膜硬化中，募集的巨噬細(xì)胞同樣吞噬脂質(zhì)，形成泡沫狀外觀并釋放TNF-α[10，37]。脂質(zhì)滲入和泡沫細(xì)胞形成后主動(dòng)脈瓣膜內(nèi)會(huì)出現(xiàn)成骨細(xì)胞樣細(xì)胞并開(kāi)始鈣化進(jìn)程[38]。

8 單核/巨噬細(xì)胞與其他免疫細(xì)胞在瓣膜鈣化中的作用

單核/巨噬細(xì)胞同其他免疫細(xì)胞之間存在相互作用，在主動(dòng)脈瓣鈣化進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。單核細(xì)胞可衍生為樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)，并聚集在主動(dòng)脈瓣狹窄病變區(qū)域，在主動(dòng)脈瓣狹窄中發(fā)揮調(diào)節(jié)功能，然而其具體的作用機(jī)制需要進(jìn)一步的研究[10]。在狹窄的主動(dòng)脈瓣中，瓣膜內(nèi)存在B細(xì)胞，并被證明與狹窄的嚴(yán)重程度相關(guān)[39]。B細(xì)胞可被巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞衍生的DCs分泌的B細(xì)胞激活因子等細(xì)胞因子所活化，從而促進(jìn)其自身的存活、成熟和增殖[10，40]。在活化巨噬細(xì)胞和DCs呈遞的作用下，B細(xì)胞可能通過(guò)驅(qū)動(dòng)T細(xì)胞活化，促進(jìn)Th1細(xì)胞致動(dòng)脈粥樣硬化表型激活，且B細(xì)胞的積累以及與巨噬細(xì)胞的相互作用可能與瓣膜的進(jìn)行性增厚和鈣化相關(guān)[39]。

9 小結(jié)

CAVD的患病率很高，嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量，目前尚無(wú)高效的非手術(shù)治療策略或預(yù)防方法，而手術(shù)治療面臨著費(fèi)用昂貴、并發(fā)癥多等問(wèn)題。單核/巨噬細(xì)胞在瓣膜鈣化中扮演重要的作用，然而實(shí)驗(yàn)性高脂血癥動(dòng)物中單核/巨噬細(xì)胞的消耗并不能阻止主動(dòng)脈瓣病變的形成，并表現(xiàn)出病變區(qū)域脂質(zhì)和膠原含量增加，瓣膜厚度增加[41]。因此，針對(duì)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和極化并改變其表型以適應(yīng)瓣膜微環(huán)境，以及靶向抑制巨噬細(xì)胞炎性因子的釋放，可能是對(duì)抑制瓣膜鈣化進(jìn)程具有效果的治療手段。