江西省地方蠶豆種質(zhì)資源遺傳多樣性分析及優(yōu)異資源挖掘

辛佳佳　張南峰　程華萍　戴興臨　張洋　涂玉琴　涂偉鳳　谷德平　關(guān)峰　湯潔

摘要： 利用蠶豆的22個(gè)主要農(nóng)藝性狀和8個(gè)簡(jiǎn)單重復(fù)序列（Simple sequence repeat，SSR）標(biāo)記對(duì)“第三次全國(guó)農(nóng)作物種質(zhì)資源普查與收集行動(dòng)”中收集到的57份江西省蠶豆種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析。結(jié)果表明：江西省地方蠶豆種質(zhì)資源具有豐富的遺傳多樣性，單株分枝數(shù)及單株總莢數(shù)與蠶豆籽粒的大小呈顯著負(fù)相關(guān)。農(nóng)藝性狀聚類分析將57份種質(zhì)資源分為兩大類，其中第Ⅰ類群?jiǎn)沃戤a(chǎn)量較高，可作為潛在高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)蠶豆育種材料。8個(gè)SSR標(biāo)記共擴(kuò)增出65條清晰、可識(shí)別的條帶，其中多態(tài)性條帶49條，多態(tài)率為75.38%。通過(guò)NTSYS聚類分析，在遺傳相似性系數(shù)為0.743處將57份蠶豆種質(zhì)資源分為3個(gè)類群，這些類群中不同來(lái)源的種質(zhì)相互交錯(cuò)，表明江西省蠶豆資源間的基因交流較充分。綜合以上結(jié)果，篩選出4份優(yōu)異的蠶豆資源，分別具有產(chǎn)量高、抗性強(qiáng)、高鈣高蛋白質(zhì)含量等特點(diǎn)，可作為蠶豆新品種的育種材料。研究結(jié)果可為蠶豆種質(zhì)資源的評(píng)價(jià)利用及蠶豆育種親本的選擇等提供理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 江西;蠶豆;種質(zhì)資源;簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）;遺傳多樣性

中圖分類號(hào)： S643.602.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)： 1000-4440（2022）01-0020-10

Abstract： In this study， 22 main agronomic characters and eight simple sequence repeat （SSR） markers were used to study and analyze the genetic diversity of 57 broad been germplasm resources collected in the third national investigation and collection of agricultural germplasm resources. The results showed that the local broad bean germplasm resources in Jiangxi province had rich genetic diversity， and the number of branches per plant and total pods were significantly negatively correlated with the size of broad bean seeds. The 57 broad bean germplasm resources were divided into two categories by cluster analysis， the group I had higher yield per plant and could be used for high-yield breeding. A total of 65 clear and identifiable bands were amplified by eight SSR markers， including 49 polymorphic bands， with a polymorphism rate of 75.38%. According to NTSYS cluster analysis， 57 broad bean germplasm resources could be divided into three groups at the genetic similarity coefficient of 0.743. The germplasms from different sources in these groups were interlaced， indicating that broad bean resources in Jiangxi were fully exchanged. Based on the above results， four excellent broad bean resources with high yield， strong resistance， high calcium and high protein content were screened and could be used as breeding materials for new varieties of broad bean. The research results can provide theoretical basis for the evaluation and utilization of broad bean germplasm resources and the selection of parents for broad bean breeding.

Key words： Jiangxi;broad bean;germplasm resources;simple sequence repeats （SSR）;genetic diversity

蠶豆（Vicia faba L.），別稱馬齒豆、胡豆、羅漢豆等，屬于豆科蝶形花亞科巢菜屬，為一年生或越年生草本植物[1-2]，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，蛋白質(zhì)含量高達(dá)25%～35%，且富含糖、礦物質(zhì)、維他命、鈣和鐵[3]。蠶豆既可作為傳統(tǒng)口糧，又是現(xiàn)代綠色食品和營(yíng)養(yǎng)保健食品。據(jù)統(tǒng)計(jì)，中國(guó)蠶豆種植面積占世界種植總面積的34.5%，產(chǎn)量高達(dá)1.96×103kg/hm2，總產(chǎn)量居世界第一（http：//www.fao.org）。中國(guó)蠶豆種植于秋播、春播兩大生態(tài)區(qū)，前者以西南地區(qū)、長(zhǎng)江流域?yàn)橹?，后者以西北、華北北部為主。江西省處于長(zhǎng)江中下游，具有良好的農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境，具備適宜種植蠶豆的生態(tài)條件。中國(guó)長(zhǎng)期保存的國(guó)內(nèi)外蠶豆種質(zhì)資源中有63.6%為國(guó)內(nèi)地方品種和育成品種，36.4%從國(guó)外引進(jìn)[4]。種質(zhì)資源是品種改良和選育的物質(zhì)基礎(chǔ)，是生命延續(xù)和種族繁衍的保證。種質(zhì)資源的收集、鑒定及評(píng)價(jià)是許多育種工作者和遺傳學(xué)家都非常關(guān)心的問(wèn)題[5-6]。由于蠶豆品種的改良起步比較晚，目前農(nóng)戶種植的蠶豆品種主要是一些地方品種，這在很大程度上限制了蠶豆種植面積的擴(kuò)大和產(chǎn)量的提高。搜集和評(píng)價(jià)江西省蠶豆地方種質(zhì)資源，有利于提高江西省蠶豆種質(zhì)資源的利用效率，同時(shí)加快優(yōu)異種質(zhì)資源利用的步伐。

本研究依托“第三次全國(guó)農(nóng)作物種質(zhì)資源普查與收集行動(dòng)”項(xiàng)目，共收集了57份江西省地方蠶豆種質(zhì)資源，對(duì)其主要農(nóng)藝性狀進(jìn)行觀察及測(cè)定，并結(jié)合簡(jiǎn)單重復(fù)序列（Simple sequence repeat，SSR）分子標(biāo)記技術(shù)，綜合研究其遺傳多樣性，以期為蠶豆種質(zhì)資源的評(píng)價(jià)利用及新品種的選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為“第三次全國(guó)農(nóng)作物種質(zhì)資源普查與收集行動(dòng)”項(xiàng)目中收集到的江西省地方蠶豆種質(zhì)資源，共計(jì)57份，種質(zhì)資源的編號(hào)、種質(zhì)名稱及收集地點(diǎn)見(jiàn)表1。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 田間農(nóng)藝性狀調(diào)查 根據(jù)“第三次全國(guó)農(nóng)作物種質(zhì)資源普查與收集行動(dòng)”項(xiàng)目安排，江西省蠶豆種質(zhì)資源調(diào)查主要選擇在永修縣、修水縣、分宜縣、橫峰縣、銅鼓縣、安福縣等27個(gè)作物種質(zhì)資源豐富的農(nóng)業(yè)縣進(jìn)行，田間管理參考當(dāng)?shù)啬Ｊ?，田間性狀的記載參照《蠶豆種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》[7]，調(diào)查內(nèi)容包括生長(zhǎng)習(xí)性、生育天數(shù)、花旗瓣顏色、株高、分枝數(shù)、單株產(chǎn)量、粒型、粒色、百粒質(zhì)量等信息，每份材料選取5株進(jìn)行性狀調(diào)查，其中數(shù)量性狀以其平均值作為最終數(shù)值[8-9]。

在質(zhì)量性狀賦值方面，花旗瓣顏色賦值如下：1=白，4=淺紅，5=紫紅;粒形賦值如下：2=窄厚，3=中厚，5=闊厚，6=闊薄;粒色賦值如下：1=白，4=黃，7=淺綠，8=綠;臍色賦值如下：1=褐，3=黑;粒型賦值如下：1=小粒型，2=中粒型，3=大粒型。

1.2.2 基因組DNA提取 取約0.5 g新鮮葉片，采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取基因組DNA[10]，用紫外核酸測(cè)定儀測(cè)定提取的DNA含量和純度，用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行DNA質(zhì)量檢測(cè)，將DNA含量統(tǒng)一稀釋到50 ng/μl，在-20 ℃低溫下長(zhǎng)期保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 SSR引物與PCR擴(kuò)增 SSR引物參照中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所張紅巖[11]的研究結(jié)果，本研究利用表型差異較大的蠶豆材料，對(duì)文獻(xiàn)中記載的17對(duì)高效SSR引物進(jìn)行進(jìn)一步篩選，挑選出條帶清晰、多態(tài)性高、穩(wěn)定性好的核心引物，淘汰擴(kuò)增結(jié)果中帶型不易辨認(rèn)的引物，共篩選到8對(duì)高效SSR核心引物（表2）。PCR擴(kuò)增總體積為10.0 μl，其中包括5.0 μl 2×Taq Mastermix、0.5 μl上游引物、0.5 μl下游引物、1.0 μl模板、3.0 μl ddH2O。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s，最佳溫度下退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用8%變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，采用銀染法進(jìn)行染色[12]。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析 采用Excel 2003計(jì)算蠶豆農(nóng)藝性狀的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差、變異系數(shù)及多樣性指數(shù)（H′）等，其中多樣性指數(shù)采用Shannon-Wiener法[13]計(jì)算，公式：H′=-∑Pi×lnPi，式中：Pi為某性狀第i級(jí)變異類型出現(xiàn)的頻率。聚類分析采用SPSS 19.0，聚類方法采用Ward法（離差平方和法）[14]。

SSR引物的多態(tài)性及聚類分析。選擇條帶清晰的PCR條帶，人工讀帶，無(wú)條帶的記為0，有條帶的記為1，采用NTSYS 2.1軟件分析57個(gè)供試蠶豆種質(zhì)間的遺傳相似性系數(shù)，聚類分析使用UPGMA法[15]，用SHAN繪制樹(shù)狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 農(nóng)藝性狀多樣性分析

2.1.1 主成分分析 對(duì)57份蠶豆種質(zhì)資源的17個(gè)數(shù)量性狀進(jìn)行主成分分析，結(jié)果見(jiàn)表3、表4。根據(jù)特征值大于1的原則，篩選到5個(gè)主成分，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到73.174%。主成分1的特征值為5.040，貢獻(xiàn)率為29.650%，該成分中單株總莢數(shù)的特征值最大，為0.890，其次是有效枝數(shù)、單株產(chǎn)量、單株分枝數(shù)、株高，特征值分別為0.882、0.864、0.863、0.696，這些都會(huì)影響單株產(chǎn)量，所以第1主成分視為產(chǎn)量因子。主成分2的特征值為3.001，方差貢獻(xiàn)率為17.655%，其中粒長(zhǎng)、粒寬、莢寬、莢長(zhǎng)的特征值較大，分別為0.820、0.783、0.482、0.616，這些都與蠶豆籽粒的大小有關(guān)，因此第2主成分為蠶豆粒型因子;單株分枝數(shù)、有效枝數(shù)、單株總莢數(shù)的特征值均為負(fù)值，分別為-0.066、-0.090、-0.129，說(shuō)明單株分枝數(shù)與總莢數(shù)會(huì)限制蠶豆籽粒的大小，因而在選育蠶豆新品種時(shí)，應(yīng)權(quán)衡高產(chǎn)與粒型，作出合適的選擇。主成分3的特征值為1.636，方差貢獻(xiàn)率為9.625%，對(duì)該成分影響較大的是生育天數(shù)、單株粒數(shù)、初花節(jié)位、初莢節(jié)位。根據(jù)性狀數(shù)值和特征值的綜合表現(xiàn)，隨著生育天數(shù)的增加，植株對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收得到增強(qiáng)，初花節(jié)位與初莢節(jié)位也表現(xiàn)出增高趨勢(shì)。主成分4的特征值為1.540，方差貢獻(xiàn)率為9.057%，對(duì)主成分4影響最大的是粒厚。主成分5的特征值為1.222，方差貢獻(xiàn)率為7.188%，對(duì)主成分5影響較大的是每花序的花朵數(shù)，特征值為-0.474，每個(gè)花序的花朵數(shù)量越多，蠶豆籽粒的粒長(zhǎng)、粒寬、粒厚越小。通過(guò)主成分分析不難發(fā)現(xiàn)，這些性狀中單株分枝數(shù)、有效枝數(shù)、單株總莢數(shù)、單株產(chǎn)量、粒長(zhǎng)、粒寬、粒厚為主要特征向量，可作為后續(xù)蠶豆新品種選育過(guò)程中親本評(píng)價(jià)的重要標(biāo)準(zhǔn)。

2.1.2 遺傳多樣性分析 對(duì)57份蠶豆材料的22個(gè)主要農(nóng)藝性狀進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果見(jiàn)表5、表6。57份蠶豆材料的生育天數(shù)為101.00～146.00 d，平均生育天數(shù)為137.04 d;平均株高為97.81 cm，序號(hào)為51的株高最高（130.00 cm），序號(hào)為57的株高最矮（50.00 cm）;平均單株總莢數(shù)為54.37個(gè)，平均單株粒數(shù)為74.44粒;平均單株產(chǎn)量為61.06 g，序號(hào)為10的單株產(chǎn)量最?。?3.93 g），序號(hào)為55的單株粒數(shù)、單株產(chǎn)量均最大（單株粒數(shù)為229.00粒，單株產(chǎn)量為219.29 g）。22個(gè)農(nóng)藝性狀在不同種質(zhì)間存在明顯差異，遺傳多樣性指數(shù)為0.356～2.046，粒寬的遺傳多樣性指數(shù)最大，為2.046，粒色的遺傳多樣性指數(shù)最小，為0.356。其中最高莖枝節(jié)數(shù)、單株分枝數(shù)、有效枝數(shù)、單株總莢數(shù)、單株粒數(shù)、莢長(zhǎng)、莢寬、粒長(zhǎng)、粒寬和粒厚的遺傳多樣性指數(shù)偏高，范圍為1.867～2.046，說(shuō)明不同材料之間的產(chǎn)量差異較大，可為篩選高產(chǎn)型優(yōu)異種質(zhì)資源提供可靠依據(jù)。

2.1.3 基于農(nóng)藝性狀的聚類分析 采用Ward系統(tǒng)聚類法建立聚類樹(shù)狀圖，由圖1可以看出，57份蠶豆種質(zhì)資源可分成2大類群，其中第Ⅰ類群包含17份種質(zhì)資源，這個(gè)類群的主要特點(diǎn)是單株分枝數(shù)較多、單株產(chǎn)量較高（表7）。除此之外，第Ⅰ類群蠶豆的花旗瓣顏色均為紅色，粒色均為淺綠色。第Ⅱ類群包含40份種質(zhì)資源，占整個(gè)種質(zhì)資源的70.2%，這個(gè)類群的主要特征是單株分枝數(shù)較少，單株產(chǎn)量較低，且花旗瓣顏色與粒色具有較高的多樣性。

2.2 基于SSR分子標(biāo)記的遺傳多樣性分析

2.2.1 SSR標(biāo)記的遺傳多樣性分析 用8對(duì)核心引物對(duì)57份蠶豆種質(zhì)資源進(jìn)行擴(kuò)增、檢測(cè)，共擴(kuò)增出65條清晰可識(shí)別的條帶，其中多態(tài)性條帶有49條，多態(tài)率為75.38%，8對(duì)核心引物擴(kuò)增的片段大多集中在200～750 bp（圖2）。各個(gè)SSR位點(diǎn)的多態(tài)信息含量（PIC）為0.42～0.84，平均PIC為 0.69（表8），表明這8對(duì)核心引物具有豐富的多態(tài)性，可用于供試材料的遺傳多樣性分析。

2.2.2 SSR標(biāo)記的聚類分析 用NTSYS 2.1對(duì)電泳譜帶進(jìn)行聚類分析，得到聚類樹(shù)狀圖（圖3）。由圖3可以看出，57份蠶豆種質(zhì)資源的遺傳相似性系數(shù)為0.480～0.980，其中序號(hào)為16的蠶豆種質(zhì)與序號(hào)為56的蠶豆種質(zhì)之間的遺傳相似性系數(shù)最小，為0.480，表明這2份蠶豆種質(zhì)資源間的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，而序號(hào)為44的蠶豆種質(zhì)與序號(hào)為49的蠶豆種質(zhì)的遺傳相似性系數(shù)最大，為0.980，表明這2份蠶豆種質(zhì)資源間的親緣關(guān)系最近。在遺傳相似性系數(shù)為0.743處，將57份蠶豆種質(zhì)資源分成3大類群，第Ⅰ類群包括48份蠶豆種質(zhì)資源，第Ⅱ類群只有14號(hào)蠶豆種質(zhì)資源，說(shuō)明序號(hào)為14的蠶豆種質(zhì)與類群Ⅰ中的48份種質(zhì)之間存在較大差異。第Ⅲ類群包括8份蠶豆種質(zhì)資源，這些種質(zhì)中除了序號(hào)為42的蠶豆種質(zhì)的花旗瓣顏色是紫紅色，其他7份種質(zhì)的花旗瓣顏色均為淺紅色。盡管第Ⅲ類群的種質(zhì)均來(lái)自贛北地區(qū)，但總體聚類結(jié)果顯示，不同來(lái)源的種質(zhì)間相互交錯(cuò)，表明江西省蠶豆種質(zhì)資源間的基因交流較為充分。

2.3 江西省蠶豆優(yōu)異種質(zhì)資源的挖掘

根據(jù)以上結(jié)果，同時(shí)結(jié)合品質(zhì)分析、抗病性分析、產(chǎn)量分析等進(jìn)行深入鑒定評(píng)價(jià)，從57份種質(zhì)資源中篩選出4份優(yōu)異資源。樓下蠶豆（采集序號(hào)為29，圖4A）于萬(wàn)年縣蘇橋鄉(xiāng)樓下村采集，該種質(zhì)的蛋白質(zhì)含量最高，達(dá)29.5%，兼具較高的鈣含量（1.820 g/kg），營(yíng)養(yǎng)豐富，是優(yōu)質(zhì)食用型蠶豆資源;江邊蠶豆（采集序號(hào)為41，圖4B）于上高縣翰堂鎮(zhèn)江邊村采集，該種質(zhì)稈高，莖粗，抗倒伏能力較強(qiáng)，對(duì)赤斑病的抗性很好，發(fā)病率只有5%，且發(fā)病癥狀輕微，其他種質(zhì)資源的發(fā)病率為10%～40%，可作為潛在的高抗優(yōu)異蠶豆育種材料;同興蠶豆（采集序號(hào)為5，圖4C）于永修縣吳城鎮(zhèn)同興村采集，該種質(zhì)葉片顏色深綠、葉面光滑、花色鮮艷且呈深紫色、株型美觀、易種植，可作盆景供觀賞;張村蠶豆（采集序號(hào)為55，圖4D）于婺源縣鎮(zhèn)頭鎮(zhèn)張村村采集，該種質(zhì)開(kāi)花多、結(jié)莢密、粒大飽滿、色澤亮、產(chǎn)量高，單株粒數(shù)達(dá)229粒，單株產(chǎn)量達(dá)219.29 g，可作為高產(chǎn)優(yōu)異的蠶豆育種材料。

3 結(jié)論與討論

現(xiàn)代育種離不開(kāi)豐富的種質(zhì)資源[16-17]而地方品種經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間特定環(huán)境及農(nóng)戶的定向選擇[18]，留下了很多優(yōu)異性狀。廣泛收集蠶豆種質(zhì)資源，對(duì)其農(nóng)藝性狀進(jìn)行觀察與分析，并進(jìn)行精準(zhǔn)鑒定與遺傳多樣性分析，從而了解蠶豆種質(zhì)資源的多樣性及其性狀之間的關(guān)系，既可為后續(xù)加強(qiáng)蠶豆種質(zhì)資源的有效利用提供材料基礎(chǔ)，又可為蠶豆新品種的選育提供參考[19]。

本研究利用22個(gè)主要農(nóng)藝性狀對(duì)57份江西省地方蠶豆種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明，57份江西省地方種質(zhì)資源的農(nóng)藝性狀變異范圍較大，變異系數(shù)為4.55%～53.17%，變異系數(shù)最小的是生育天數(shù)，變異系數(shù)最大的是單株粒數(shù)。變異系數(shù)能夠反映性狀間的變異程度，變異系數(shù)越大，說(shuō)明性狀間存在越豐富的變異類型，越具有改良潛力[20]。從試驗(yàn)結(jié)果看，蠶豆單株粒數(shù)的變異系數(shù)最大，可通過(guò)相關(guān)改進(jìn)技術(shù)（品種選育、栽培、溫度、光照度）等較大程度地提高總粒數(shù)，而生育天數(shù)的變異系數(shù)最小，可以通過(guò)育種手段加以改變，但獲得理想目標(biāo)性狀的難度較大[21]。因此，在高產(chǎn)蠶豆品種選育過(guò)程中，首先應(yīng)該注重單株粒數(shù)的提高，之后再考慮其他性狀。

農(nóng)藝性狀聚類分析將57份蠶豆種質(zhì)資源分成兩大類群：第Ⅰ類群包含17份種質(zhì)資源，第Ⅱ類群包含40份種質(zhì)資源，類群Ⅰ的單株產(chǎn)量較類群Ⅱ顯著增加。SSR標(biāo)記聚類的結(jié)果表明，供試蠶豆種質(zhì)資源的遺傳關(guān)系與地理來(lái)源間的相關(guān)性不大，這與多數(shù)前人的研究結(jié)果[22]一致。本研究分別通過(guò)主要農(nóng)藝性狀和SSR分子標(biāo)記2種方法對(duì)江西省地方57份蠶豆種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，兩者的聚類結(jié)果并不完全一致，這種情況在其他作物如辣椒[23]、梅花[24]、紅三葉[25]中也曾有報(bào)道，原因可能有2個(gè)：一方面，蠶豆的農(nóng)藝性狀容易受外界環(huán)境的影響，導(dǎo)致鑒定結(jié)果可能會(huì)出現(xiàn)一定的偏差;另一方面，挑選的8對(duì)核心引物所在的SSR位點(diǎn)與所調(diào)查的農(nóng)藝性狀可能并不存在一定關(guān)聯(lián)[26]。

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（責(zé)任編輯：徐 艷）