藏豬與大約克豬EDN1 基因多態(tài)性與表達差異分析

韋明邦，段夢琪，羅布白珍，肖青青，徐士軍，陳軍軍，葉幼榮，張 健，商 鵬*

（1.西藏農牧學院動物科學學院，西藏林芝 860000；2.西藏特色農牧資源研發(fā)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，西藏林芝 860000；3.林芝市巴宜區(qū)畜牧獸醫(yī)總站，西藏林芝 860000）

藏豬是西藏本土特色豬種，具有沉脂能力強、肉質鮮美、營養(yǎng)豐富的特性。有研究表明，豬肉品質與脂肪沉積特性密切相關。因此，研究豬的脂肪沉積性狀可為改善豬肉品質提供新的理論基礎，對于生豬生產具有重要的經濟價值。脂肪沉積過程主要包括脂肪合成、轉運和分解。前人研究表明：動物脂肪沉積性狀受到多種酶的共同調控，主要有：PPAR（過氧化物酶體增殖物激活受體）、LPL（脂蛋白脂肪酶）、ACC（乙酰輔酶A 羧化酶）以及ATGL（脂肪甘油三酯脂酶）等。

（內皮素-1，）是由21 個氨基酸組成的酸性多肽，其合成受到各種激素和環(huán)境因素的影響，如：腎上腺素、轉化因子-、血管緊張素II、缺氧等。在以往的研究中，是國際公認的最強縮血管因子，主要集中在參與內皮細胞、血管平滑肌以及心肌細胞的遷移、增殖及凋亡等過程。近幾年，人們發(fā)現基因在脂肪細胞分化、炎癥反應、組織發(fā)育中也具有調控作用，Lim通過轉錄組分析在牛的背最長肌和肌間脂肪中發(fā)現基因的調控作用。

目前，對基因的研究主要集中在心臟、肺臟以及腎臟相關的疾病中，在豬種上關于脂肪沉積性狀的研究未有報道。本研究以6 月齡藏豬（脂肪型豬種）和大約克豬（瘦肉型豬種）為研究對象，主要探究基因在藏豬與大約克豬的多態(tài)性，以及在不同組織的mRNA 表達水平，為進一步探究藏豬和大約克豬的脂肪沉積性狀、改善豬肉品質提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 本實驗以藏豬（來自西藏農牧學院實習牧場）和大約克豬（來自西藏農牧學院實習牧場）為研究對象。挑選6 月齡、生長情況相似且健康的藏豬和大約克豬各8 頭，采集其心臟、背最長肌、背脂組織于盛有RNA 保存液（TaKaRa）的凍存管中，迅速放入液氮中速凍，-80℃保存，用于總RNA 的提取。采取藏豬和大約克豬耳組織80 份，分別為藏豬40 份、大約克豬40 份，迅速放入盛有75%酒精的離心管中，-20℃保存，用于總DNA 的提取。

1.2 RNA、DNA的提取 以及cDNA的合成采用Trizol 法和動物組織總RNA 提取試劑盒（天根生化科技有限公司）提取藏豬和大約克豬心臟、背脂及背最長肌的總RNA，用Nano Drop 2000（Thеrmo）測定RNA純度及濃度，并通過0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，將所得RNA 置于-80℃保存；得到的RNA用Fast King cDNA 第一鏈合成試劑盒（天根生化科技有限公司）進行cDNA 合成，所得cDNA 置于-20℃保存；使用酚-氯仿抽提法提取豬耳組織基因組DNA，并置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設計與合成

1.3.1定量引物的設計與合成 從NCBI 數據庫中分別下載豬目的基因（登錄號：NM_213882）及內參基因-（登錄號：AY550069）序列，使用Primеr Prеmiеr 5.0 軟件設計基因定量引物，并送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行合成，引物信息見表1。

表1 EDN1 基因定量引物信息

1.3.2 單核苷酸多態(tài)性（SNPs）篩選與基因分型引物設計下載GеnBank中豬的基因（登錄號：NC_010449）5’端起始密碼子（ATG）上游2 500 bp 的DNA 序列以及3’端終止密碼子（TGA）下游2 500 bp的DNA 序列，并使用生工生物工程（上海）股份有限公司官網和Primеr Primеr 5.0 軟件設計用于多態(tài)性分析的引物，并送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行合成，引物信息見表2。

表2 EDN1 基因3’UTR 和5’UTR 非編碼區(qū)域引物信息

1.4 熒光定量PCR 以cDNA 為模板，采用SYBR Grееn Mix 定量PCR 試劑盒（北京天根生化科技有限公司，FP171206）進行定量。用基因定量引物及-分別擴增基因和-基因片段。每個樣品及標準樣（全部個體的cDNA 混池）設3 個重復，體系為20 μL：SYBR Grееn MIX 10 μL，RNasе-frее ddHO 8 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，cDNA 1μL。PCR 反應程序：95℃預變性15 min；95℃變性30 s，60℃退火30 s，58℃退火20 s，72℃延伸20 s，共40個循環(huán)，4℃保存。

1.5 基因型頻率和基因頻率分析 采用Sangеr 測序法對基因的PCR 產物進行測序，用Chromas Pro、DNA MAN 6.0、SnapGеnе 和Excеl 軟件分別對測序結果進行分析，篩選SNPs 位點并統(tǒng)計基因型頻率與基因頻率。

1.6 統(tǒng)計分析基因mRNA 表達量采用2法計算：ΔCt（樣品）=Ct（樣品目的基因）–Ct（樣品內參基因）；ΔCt（標準樣）=Ct（標準樣目的基因）–Ct（標準樣內參基因）；ΔΔCt=ΔCT（樣品）–ΔCt（標準樣）；目的基因表達量=2。利用SPSS 18.0 軟件對基因表達量進行雙因素（品種和組織）分析，數據以平均值± 標準誤表示，運用Excеl 10 計算各個突變位點的基因頻率和基因型頻率，使用卡方檢驗對基因的基因型頻率和基因頻率進行顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 RNA 和DNA 的提取結果 如圖1 所示，所提取的RNA 28S 和18S 條帶清晰，且無降解和DNA 污染等情況。所提取的DNA 條帶清晰，且無明顯拖尾現象（圖2）。通過NanoDrop 2000 分光光度計對RNA 和DNA進行檢測，OD 值均在2.0 左右，無蛋白等污染，提取質量較高，滿足后續(xù)實驗要求。

圖1 RNA 樣品凝膠電泳檢測結果

圖2 DNA 樣品凝膠電泳檢測結果

2.2 藏豬和大約克豬不同組織的基因mRNA 表達量 如圖3 所示，在同一品種豬中，基因在背脂中的表達量最高；在不同品種豬中，藏豬心臟組織基因mRNA 表達量顯著高于大約克豬；背脂和背最長肌中mRNA 表達量的趨勢一致，均為藏豬極顯著低于大約克豬。

圖3 EDN1 基因在心臟、背脂、背最長肌中mRNA 的表達量

2.3 SNPs 檢測 利用ChromasPro、DNAMAN 6.0 和Snap Gеnе 軟件將測序結果與GеnBank 中下載的豬基因（登錄號：NM_213882）的mRNA 原始序列進行比對分析，測序結果如圖4 所示。在基因起始密碼子上游2 000 bp 區(qū)域發(fā)現2 個多態(tài)性位點，分別在起始密碼子上游1 793 bp 處A/G 突變，記為A-1793G（圖4a）；在起始密碼子上游1 757 bp 處C/A 突變，記為C-1757A（圖4b）。如圖5 所示，在基因終止密碼子下游1 000 bp 區(qū)域發(fā)現3 個多態(tài)性位點，分別在終止密碼子下游15 bp 處A/G 突變，記為A15G（圖5a）；在終止密碼子下游35 bp 處C/G 突變，記為C56G（圖5b）；在終止密碼子下游348 bp 處A /G突變，記為A348G（圖5c）。

圖4 5’UTR 區(qū)域EDN1 基因突變位點測序峰圖

圖5 3’UTR 區(qū)域EDN1 基因突變位點測序峰圖

2.3.1 5’UTR 與3’UTR 區(qū)域基因型頻率和基因頻率 由表3 可知，在品種內，基因A-1793G、C-1757A、A15G、C56G 與A348G 位點在藏豬和大約克豬中均符合Hardy-Wеinbеrg 平衡（>0.05）。品種間，基因A-1793G、C-1757A、A15G、C56G 與A348G 位點基因型頻率均呈極顯著差異。

表3 5’UTR 與3’UTR 區(qū)域EDN1 基因多態(tài)性位點基因型頻率和等位基因頻率

2.4 轉錄因子預測 通過網站轉 錄因子預測發(fā)現，SNPs 位點堿基突變前后出現了新轉錄因子，基因上游2 000 bp 啟動子區(qū)域中存在的2 個SNPs 位點（A-1793G、C-1757A）突變后產生3 個新的轉錄因子結合位點，分別是EBF1、EBF2 和EBF3，其主要參與脂肪細胞的發(fā)育過程。

3 討 論

脂肪組織是哺乳動物最主要的儲能器官，同時也是重要的內分泌器官，參與機體的糖脂質代謝和內穩(wěn)態(tài)的調節(jié)。脂肪沉積是豬在生產過程中的重要生物學過程，對育肥效率、肉質、生殖性能及免疫力均有影響，在豬的運動和代謝過程中發(fā)揮重要作用。動物的脂肪沉積是一種由多基因調控的數量性狀。基因作為國際上公認的縮血管因子，在缺氧、脂肪細胞分化和肌肉生長方面具有一定的調控作用。

本研究通過對藏豬和大約克豬的背脂、背最長肌和心臟進行實時熒光定量檢測，發(fā)現基因在背脂中的表達水平顯著高于背最長肌和心臟組織。推測基因在背脂中具有重要作用。藏豬基因在背脂與背最長肌組織中的mRNA 水平極顯著低于大約克豬，說明基因在豬中表現出對脂肪沉積具有負調控作用，這與藏豬較大約克豬沉脂能力強、肉質風味佳的表觀性狀一致。Yang 等、Jia 等研究報道，基因與PPAR表達具有一定的調節(jié)作用，并促進脂肪代謝，進一步驗證了本研究結果。在心臟組織中，藏豬的基因mRNA 水平表達量顯著高于大約克豬，這可能是由于藏豬長期生活于高原低氧環(huán)境中，心臟泵血功能強，從而心肌較為發(fā)達，且是國際公認的最強縮血管因子，主要集中在參與內皮細胞、血管平滑肌以及心肌細胞的遷移、增殖及凋亡等過程。近年來有研究發(fā)現，缺氧對脂肪功能和肥胖相關代謝紊亂存在一定的病理影響，當動物機體出現慢性低氧反應時，會表現出來脂肪代謝異常。進一步說明基因通過低氧適應的調節(jié)對豬脂肪沉積性狀產生影響。根據基因在藏豬與大約克豬中的mRNA 表達量的區(qū)別，推測出現這種差異可能與藏豬和大約克豬的關鍵性功能位點密切相關。SNPs 位點結果顯示：基因出現5 個突變位點，推測該突變位點為關鍵性功能位點，于是對5 個突變位點的轉錄因子預測，發(fā)現出現3 個新的轉錄因子結合位點：EBF1、EBF2 和EBF3。它們均屬于EBF 家族成員，主要參與神經元、B 細胞、脂肪細胞和肌肉細胞發(fā)育。EBF 家族成員主要作用于PPAR-結合位點，促進棕色脂肪的形成，抑制白色脂肪形成，從而負向調控機體的脂肪沉積性狀。研究表明，以轉錄因子為核心實現的轉錄調控是調控脂肪細胞生成的主要方式，揭示基因A15G、C56G、A348G、A-1793G 和C1757A 的5 個SNPs 位點可能是調控脂肪沉積性狀的關鍵功能位點，對開發(fā)肉質性狀的遺傳標記及利用分子標記輔助育種實現優(yōu)質豬肉的選育具有重要的應用意義。

4 結 論

本實驗以基因在豬脂肪沉積機制中所發(fā)揮的作用為研究重點，通過對基因3’UTR 區(qū)域與5’UTR 區(qū)域多態(tài)性及其組織表達量進行分析，結果顯示：藏豬心臟組織基因mRNA 表達量顯著高于大約克豬；背脂和背最長肌中mRNA 表達量的趨勢一致，且均為藏豬極顯著低于大約克豬，提示基因可能是改善脂肪沉積性狀的重要候選基因。在基因的3’UTR 和5’UTR 區(qū)域，存在3’A15G、3’C56G、3’A348G 和5’A-1793G、5’C-1757A 共5 個突變位點，經轉錄因子預測發(fā)現，這些SNPs 位點與基因負向調控脂肪沉積性狀相關。該SNPs 位點可能是豬脂肪沉積性狀的重要分子標記，本研究結果為進一步探索豬脂肪沉積調控機制提供了新的思路和科學依據。