劉燕鋒，王鳳曉，阮冬云，唐昱，張學(xué)洪，王云霞

1.江西省人民醫(yī)院，南昌大學(xué)附屬人民醫(yī)院，江西 南昌 330006；2.江西省第五人民醫(yī)院，江西 南昌 330046

吸煙是影響健康的一大危害因素，與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系。吸煙可導(dǎo)致血管平滑?。╲ascular smooth muscle，VSM）的損傷［1］，血管平滑肌損傷進(jìn)一步導(dǎo)致血管功能紊亂。大電導(dǎo)鈣激活鉀通道（large-conductance calcium-activated potassium channels，BK 通道）廣泛分布于血管平滑肌細(xì)胞上，在血管舒縮功能調(diào)節(jié)方面起著重要作用［2-3］。本研究選取大鼠血管平滑肌細(xì)胞作為研究對象，探討吸煙對動脈血管平滑肌細(xì)胞及其BK 通道電流的影響，對吸煙引起血壓升高的具體機(jī)制進(jìn)行深入的探討。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

雄性Wistar 大鼠48 只，體質(zhì)量200±20 g，購于醫(yī)科院動物所，動物合格證號0123009，飼養(yǎng)于清潔級動物房。

1.2 實驗器材及試劑

1.2.1實驗儀器小動物恒溫系統(tǒng)，小動物無創(chuàng)血壓測量系統(tǒng)（上海奧爾科特生物科技有限公司），倒置熒光顯微鏡，膜片鉗放大器（Axopatch 200B）及DigiData 1200B 型數(shù)/模（或模/數(shù)）轉(zhuǎn)換器（Axon，美國），03-D 玻璃微電極拉制儀。

1.2.2實驗試劑透明質(zhì)酸酶、膠原酶、二硫蘇糖醇、木瓜蛋白酶、牛血清白蛋白（Sigma，美國）；乙二醇二乙醚二胺四乙酸、N-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸（Germany），余試劑均為國產(chǎn)分析純。酶液Ⅰ：木瓜蛋白酶，1.75 mg/mL；二硫蘇糖醇，1.75 mg/mL；白蛋白，2.5 mg/mL。酶液Ⅱ：膠原酶Ⅰ，2.5 mg/mL；透明質(zhì)酸酶，2.5 mg/mL；白蛋白，2.5 mg/mL。電極內(nèi)液：KCl，40 mmol/L；K2Asp（天門冬氨酸鉀），100 mmol/L；MgCl2，1 mmol/L；EGTA，0.1 mmol/L；ATPNa2，4 mmol/L；HEPES（N-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸），10 mmol/L。電極外液：NaCl，134 mmol/L；KCl，6 mmol/L；MgCl2，1 mmol/L；CaCl2，2 mmol/L；HEPES，10 mmol/L；葡萄糖，10 mmol/L。

1.3 大鼠模型建立與分組

煙霧暴露動物模型的建立：雄性Wistar 大鼠48只，按隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組、煙霧暴露組，每組24 只，根據(jù)煙霧暴露時間，各組每個時間點6只大鼠。煙霧暴露組大鼠置于實驗性大鼠被動吸煙箱內(nèi)進(jìn)行模型制作，方案為：每天在特定時間使大鼠接受煙霧暴露1 次，每次暴露于10 支香煙的煙霧中，每次點燃2 支香煙，共分5 次點燃。香煙為市面上常規(guī)出售的香煙，焦油含量為13 mg/支，尼古丁含量為1.2 mg/支，分別煙霧暴露0、4、8、12 周，對照組除不進(jìn)行煙霧暴露之外，其余處理相同。血壓測定采用無創(chuàng)血壓測量分析系統(tǒng)，每天于8:00-14:00 測定大鼠血壓水平，每只大鼠在安靜狀態(tài)下測血壓3 次，取平均值。煙霧暴露組大鼠血壓從第6 周開始升高，第12 周煙霧暴露組大鼠血壓較對照組血壓值增加40 mm Hg 以上，表明大鼠煙霧暴露所致高血壓模型的建立成功。

1.4 血壓測量方法

將大鼠尾動脈測壓儀開啟預(yù)熱20 min，進(jìn)行大鼠血壓信號標(biāo)測。據(jù)大鼠體量將其裝入固定盒內(nèi)固定后，尾部插入加壓套近尾根部,使鼠尾剛好處于脈搏傳感器的“脈搏信號傳感片”上方，使鼠尾壓迫傳感片緊貼尾動脈,待大鼠脈搏穩(wěn)定后進(jìn)行血壓測量。

1.5 主動脈形態(tài)學(xué)檢測

以肝素抗凝，戊巴比妥鈉麻醉后，將大鼠斷頭處死，取出主動脈，于主動脈弓處選取血管組織，置入4%多聚甲醛中固定24 h，隨后行石蠟包埋，切片，HE 染色。光鏡下觀察對照組及煙霧暴露12周時大鼠血管形態(tài)變化。

1.6 大鼠主動脈血管平滑肌細(xì)胞的分離

在實驗第0、4、8、12 周，分離大鼠主動脈平滑肌細(xì)胞：戊巴比妥鈉麻醉大鼠，取出胸主動脈,游離出血管中膜，依次放入酶液Ⅰ、酶液Ⅱ中進(jìn)行消化，酶液I 消化時間為25 min，酶液Ⅱ為15 min，高倍鏡下觀察細(xì)胞懸液，每個視野可找到4～5 個膜完整且折光性好細(xì)胞，即可終止酶解，將細(xì)胞懸液放置于4 ℃冰箱保存。

1.7 膜片鉗全細(xì)胞BK 電流記錄方法

采用垂直玻璃微電極拉制儀兩步法拉制玻璃微電極，電極尖端阻抗4～7 MΩ,電極經(jīng)拉制拋光后入液電阻4～7 MΩ,封接電阻＞1 GΩ，內(nèi)充電極內(nèi)液，NaOH 調(diào)pH 值至7.4。將分離出的VSMC 保存于無鈣臺氏液中，細(xì)胞懸液加于灌流槽中，待細(xì)胞貼壁后，電極外液1～2 mL/min 灌流15～20 min。電極入液，鉗制平滑肌細(xì)胞，負(fù)壓破膜，使細(xì)胞內(nèi)液與電極內(nèi)液完全相通，建立全細(xì)胞記錄后，使用pCLAMP 軟件（pCLAMP 9.0，Axon Instruments，USA）記錄細(xì)胞膜電容（Cm），隨后以放大器（Axopatch 200B，AxonInstruments，USA）的慢電容補(bǔ)償和串聯(lián)電阻補(bǔ)償，保持鉗制電位為-60 mV，給細(xì)胞施加去極化方法刺激，頻率0.2 Hz，持續(xù)時間為400 ms，從-50 mV 去極化至+70 mV，以激發(fā)外向鉀電流,觀察到電流基本穩(wěn)定后，記錄電流。電流記錄在室溫條件（25 ℃）下進(jìn)行。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

以SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用重復(fù)資料測量的方差分析方法來分析大鼠血壓隨時間的變化趨勢，采用pCLAMP 9.0 軟件對膜片鉗記錄數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)和圖形轉(zhuǎn)換，計量資料以表示，行t檢驗，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 煙霧暴露對大鼠血壓的影響

本實驗通過建立煙霧暴露動物模型，觀察煙霧暴露對大鼠血壓的影響。實驗結(jié)果表明（見圖1），煙霧暴露組第8～12 周血壓，較對照組明顯增高（P＜0.05）。

圖1 煙霧暴露對大鼠血壓的影響（n=6）

2.2 血管形態(tài)學(xué)變化

顯微鏡下可見對照組大鼠主動脈內(nèi)皮完整，中膜平滑肌細(xì)胞排列規(guī)則（圖2-A）。煙霧暴露組大鼠主動脈壁增厚，內(nèi)皮細(xì)胞下基質(zhì)變厚，中膜的平滑肌層增厚，平滑肌細(xì)胞整體變短小（圖2-B），提示煙霧暴露使動脈平滑肌增生。

圖2 大鼠主動脈血管結(jié)構(gòu)的光鏡觀察（HE×100倍）：A.對照組；B.煙霧暴露組

2.3 煙霧暴露對大鼠平滑肌細(xì)胞BK 通道電流密度的影響

在全細(xì)胞模式下，將膜電位鉗制在-60 mv，階躍刺激從-50 mv 開始，以10 mv 階躍去極化至+70 mv，持續(xù)400 ms，誘發(fā)出大鼠主動脈平滑肌細(xì)胞BK 電流（見圖3）。在實驗第0、4、8、12 周，使用全細(xì)胞膜片鉗記錄對照組及煙霧暴露組大鼠主動脈平滑肌細(xì)胞鈣激活鉀通道電流密度，煙霧暴露組BK 通道電流密度隨著煙霧暴露持續(xù)時間的增加而逐漸減低，對照組BK 通道電流密度無明顯變化。

圖3 煙霧暴露時間與大鼠平滑肌細(xì)胞膜BK通道電流密度的關(guān)系（n=6）

2.4 BK 電流密度-電壓（I/V）曲線測定

電壓鉗模式下，將膜電位鉗制在-60 mV，階躍刺激從-50 mV 開始，以10 mV 階躍去極化至+70 mV，持續(xù)400 ms，根據(jù)激活電位及相應(yīng)的電流密度可得到I/V 曲線圖（圖4）。煙霧暴露組大鼠BK 通道電流密度在不同的時間點（0、4、8、12 周），不同的刺激電壓，電流變化的趨勢也不同（P＜0.05）。

圖4 大鼠主動脈平滑肌細(xì)胞BK電流密度-電壓（I/V）曲線（n=6）

3 討論

吸煙是導(dǎo)致血管相關(guān)疾病的重要原因之一，煙草煙霧中的有害物質(zhì)可造成血管舒縮功能異常［4］。以往關(guān)于吸煙對血管功能影響的研究，多集中于血管內(nèi)皮功能［5-6］。本實驗建立煙霧暴露大鼠模型，探討煙草煙霧暴露對大鼠血管平滑肌功能的直接影響。在我們的實驗中觀察到，煙霧暴露12 周，大鼠血管壁出現(xiàn)局部增厚，內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)部分基質(zhì)變厚，平滑肌層增厚，提示煙霧暴露會導(dǎo)致血管平滑肌增生。有研究表明，血管平滑肌細(xì)胞增殖可以影響大鼠血壓水平［7］。同時，我們監(jiān)測大鼠血壓發(fā)現(xiàn)，第6 周開始，煙霧暴露組大鼠的血壓水平開始升高，并隨著煙霧暴露時間的延長而持續(xù)升高，提示煙霧暴露可能通過調(diào)節(jié)血管平滑肌舒縮功能而影響大鼠血壓水平。

血管平滑肌細(xì)胞在調(diào)節(jié)血管舒縮狀態(tài)中起到?jīng)Q定性的作用。在動脈平滑肌細(xì)胞膜上，BK 通道對血管舒縮功能的調(diào)節(jié)作用最為重要［8-9］。研究表明大鼠在長期寒冷刺激的環(huán)境下，胸主動脈平滑肌細(xì)胞BK 通道的活性下降［10-11］。BK 通道改變會直接影響血管張力。細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高時，BK 通道被激活，產(chǎn)生鉀離子外流，從而導(dǎo)致細(xì)胞超極化，反饋性地抑制鈣離子通道開放，從而使血管擴(kuò)張［12］。使用BK 通道特異性阻滯劑Iberiotoxin 阻滯BK 電流后，動脈明顯收縮，因此BK 通道對動脈血管張力也具有重要的調(diào)節(jié)作用［13］，煙草煙霧所致的血管張力及血壓水平的變化是否是導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞BK 通道電流改變的結(jié)果尚不清楚。

有報道提出，煙霧暴露可以通過激活電壓依賴性Ca2+通道及誘導(dǎo)肌漿網(wǎng)內(nèi)Ca2+釋放，增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+的濃度［14］，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高時導(dǎo)致BK 通道開放，形成自發(fā)性一過性K+外流，引起細(xì)胞超極化使血管擴(kuò)張，從而使肌張力盡量維持在一定水平［15］。在實驗中，我們觀察到煙霧暴露組大鼠血管平滑肌細(xì)胞鈣離子鉀通道電流及電流密度從第4 周時開始減低，且隨著煙霧暴露的時間延長而持續(xù)降低，同時血壓持續(xù)上升。結(jié)果表明，在長期煙霧暴露的條件下，血管平滑肌細(xì)胞BK 通道功能受損，對血管舒縮功能的反饋性調(diào)節(jié)作用減弱，從而使血壓隨煙霧暴露時間的延長而持續(xù)升高。

本實驗研究結(jié)果表明，煙霧暴露時，血管平滑肌細(xì)胞增殖，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度隨煙霧暴露時間的延長而升高，從而導(dǎo)致機(jī)體血壓的升高；而BK Ca2+通道電流作為一種調(diào)節(jié)血管舒張的反饋性的保護(hù)因素，隨煙霧暴露時間的延長而減低，血管舒縮功能障礙，進(jìn)一步導(dǎo)致機(jī)體血壓升高。因此，在吸煙人群中，盡量阻斷或者減少香煙毒素對血管平滑肌BK的損傷，可能有助于降低吸煙人群高血壓的發(fā)病率，為吸煙人群心血管并發(fā)癥的防治提供了新的思路。