王 冠，竇雪晨，張 寧，李 抄，鄧 橙，杜耀華

（軍事科學(xué)院系統(tǒng)工程研究院衛(wèi)勤保障技術(shù)研究所，天津 300161）

0 引言

隨著現(xiàn)代制藥、微電子、高分子材料等領(lǐng)域的飛速發(fā)展，由病原微生物引發(fā)的疾病種類日趨復(fù)雜，部分致病菌能在短時(shí)間內(nèi)對(duì)環(huán)境、水質(zhì)、生產(chǎn)產(chǎn)品造成污染[1]。微生物檢測刻不容緩。具有高靈敏檢測能力的數(shù)字免疫技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，并且在醫(yī)學(xué)診療等方面得到了成功應(yīng)用[2]。2014年，美國Quanterix公司將數(shù)字免疫技術(shù)與酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）方法結(jié)合，成功設(shè)計(jì)了單分子免疫陣列，將微生物檢測下限降低為原來的千分之一[3]。

在數(shù)字免疫技術(shù)誕生之前，傳統(tǒng)免疫檢測方法的原理是將抗原或抗體隨機(jī)固定在二維載體上，捕獲目標(biāo)物的效率較低且不穩(wěn)定，導(dǎo)致檢測靈敏度偏低且精密度較差[4]。此外，酶聯(lián)免疫吸附、免疫層析、化學(xué)發(fā)光等方法檢測的是樣本體系中待測目標(biāo)物與檢測試劑反應(yīng)信號(hào)的總和，并通過信號(hào)的總體強(qiáng)度來估算目標(biāo)物濃度，導(dǎo)致檢測靈敏度較低[5-6]。而數(shù)字免疫檢測方法一般在均勻液相體系下完成免疫反應(yīng)[7-8]，反應(yīng)充分且重復(fù)性好，并通過不同的技術(shù)手段將目標(biāo)物固定下來，再利用高分辨力熒光成像技術(shù)對(duì)其進(jìn)行檢測，可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的“逐個(gè)”精確計(jì)數(shù)，從而實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)定量，因此能夠達(dá)到較高的分辨力[9-11]，并在實(shí)現(xiàn)精確定量的同時(shí)提高檢測靈敏度[12-14]。

2017年，F(xiàn)arka等[10]提出了數(shù)字夾心免疫測定法，使用檢測體系為38 nL的96孔微量滴定板進(jìn)行細(xì)菌檢測，達(dá)到優(yōu)于商業(yè)ELISA的檢測靈敏度；同年，Scheler等[15]設(shè)計(jì)了ddCFU結(jié)構(gòu)來定量檢測細(xì)菌，檢測體系為3μL，可實(shí)現(xiàn)對(duì)106cfu/mL以上濃度樣本的檢測。本研究基于數(shù)字免疫技術(shù)原理，設(shè)計(jì)開發(fā)一套高靈敏度的病原微生物檢測系統(tǒng)，以105μL的試劑體系可以實(shí)現(xiàn)最低濃度為103cfu/mL樣本的檢測，可為研制新一代檢測設(shè)備提供技術(shù)支持。

1 硬件設(shè)計(jì)

本系統(tǒng)的硬件部分主要包括數(shù)字免疫流體芯片和成像檢測系統(tǒng)。其中數(shù)字免疫流體芯片用于試劑反應(yīng)與檢測，成像檢測系統(tǒng)用于獲取樣本檢測圖像。

1.1 數(shù)字免疫流體芯片設(shè)計(jì)

數(shù)字免疫技術(shù)可實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)微生物的高靈敏度定量檢測，但目前國內(nèi)針對(duì)該技術(shù)的研究較少。基于該技術(shù)所設(shè)計(jì)的自動(dòng)檢測設(shè)備一般集成多自由度精密定量移液結(jié)構(gòu)，以確保在試劑添加和樣本清洗過程中試劑體系的精確定量和最終檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此通常體積較大，制造成本較高[16]。為解決這些問題，本文設(shè)計(jì)了一種數(shù)字免疫流體芯片，以簡化樣本處理流程，同時(shí)該芯片設(shè)計(jì)增加了試劑檢測體系，便于實(shí)現(xiàn)低濃度樣本中目標(biāo)微生物的檢測。

如圖1（a）所示，數(shù)字免疫流體芯片由石英玻璃（上層）、有機(jī)玻璃（中層）、石英玻璃（底層）3層組成，上層打出2個(gè)圓孔作為清洗液進(jìn)入和廢液排出的通道，中部打空，將密封后的3層玻璃區(qū)域作為試劑反應(yīng)和磁吸附的密閉區(qū)域。其中中層有機(jī)玻璃厚度為1 mm，圓孔直徑為3.5 mm，兩圓孔間距為30 mm。如圖1（b）所示，將3層玻璃密封后，可形成105μL的試劑反應(yīng)區(qū)間。相對(duì)于38 nL的96孔微量滴定板[10]、ddCFU結(jié)構(gòu)的3μL[16]的檢測體系，該芯片105μL的試劑體系有利于提高檢測靈敏度。

圖1 數(shù)字免疫流體芯片設(shè)計(jì)圖

1.2 成像檢測系統(tǒng)設(shè)計(jì)

傷寒沙門氏菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌等常見致病菌的外形尺寸為1～2μm，檢測這些細(xì)菌所使用的量子點(diǎn)熒光標(biāo)記物的粒徑為100~120 nm，因此細(xì)菌在經(jīng)過免疫熒光標(biāo)記后，外形尺寸不會(huì)發(fā)生明顯變化。相對(duì)于傳統(tǒng)的免疫層析檢測，數(shù)字化免疫檢測需要更高的成像分辨力。首先使用尼康Eclipse Ti2熒光顯微鏡對(duì)樣本進(jìn)行成像性能效果評(píng)估，將106cfu/mL的樣本加入腔室厚度為30μm的細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行熒光成像。圖2分別為4×、10×和20×物鏡條件下的熒光顯微圖像，4×物鏡無法對(duì)熒光標(biāo)記后的單細(xì)菌進(jìn)行成像，10×和20×物鏡均可以實(shí)現(xiàn)單細(xì)菌熒光成像。20×物鏡的熒光圖像分辨力更高，但同時(shí)會(huì)導(dǎo)致成像視場等比例縮小，單次成像區(qū)域僅為0.6 mm×0.5 mm，而10×物鏡條件下單次成像區(qū)域?yàn)?.2 mm×0.9 mm。

圖2 不同放大率物鏡熒光顯微圖像

針對(duì)數(shù)字免疫樣本檢測需求，本文設(shè)計(jì)了中繼鏡頭，用于提高單次成像檢測區(qū)域，并縮小成像模組體積，從而為后續(xù)樣機(jī)的小型化奠定基礎(chǔ)。圖3為設(shè)計(jì)的鏡頭結(jié)構(gòu)和成像分析，該鏡頭物像共軛距離為103.6 mm，成像波長范圍為500~650 nm，物方數(shù)值孔徑為0.28 mm（與常規(guī)的10×顯微物鏡相同），物方視場為3 mm。該鏡頭可以達(dá)到常規(guī)顯微鏡10×物鏡的成像效果，但結(jié)構(gòu)相對(duì)簡化，物像共軛距離縮小約30%。

圖3 鏡頭結(jié)構(gòu)及成像分析

基于設(shè)計(jì)的中繼鏡頭，完成成像檢測系統(tǒng)設(shè)計(jì)，由中繼鏡頭、光源、攝像機(jī)、分光片、濾光片等組成，如圖4所示。光源為3 W級(jí)的大功率LED，中心波長為375 nm；相機(jī)為MV-CE200-10UC，分辨力為2 000萬像素，單像素大小為2.4μm；照明采用同軸照明方式，二色分光片將照明光源發(fā)出的入射光和樣本熒光信號(hào)發(fā)出的反射光進(jìn)行區(qū)分，避免光線重合造成干擾，并在相機(jī)前設(shè)置熒光濾光片F(xiàn)L2，用以消除照明光散射干擾。

圖4 成像檢測系統(tǒng)組成圖

2 算法設(shè)計(jì)

信號(hào)處理算法采用MATLAB編程編寫。該算法對(duì)系統(tǒng)掃描所得到的熒光信號(hào)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，通過噪點(diǎn)去除、熒光點(diǎn)篩選、信號(hào)增強(qiáng)等操作，達(dá)到對(duì)熒光信號(hào)準(zhǔn)確提取的效果。首先進(jìn)行灰度處理，將原本的RGB三重?cái)?shù)據(jù)進(jìn)行簡化。然后對(duì)圖像進(jìn)行二值化操作，其原理是將圖像上像素點(diǎn)的灰度值設(shè)置為0或255，也就是令整個(gè)圖像呈現(xiàn)出明顯的黑白效果，將256個(gè)亮度等級(jí)的灰度圖像通過適當(dāng)?shù)拈撝颠x取實(shí)現(xiàn)對(duì)圖像的進(jìn)一步處理，并且數(shù)據(jù)量的減少能更清晰地凸顯出待測目標(biāo)的輪廓。腐蝕算法通過去除最外圍邊界點(diǎn)，令邊界向內(nèi)部收縮，可實(shí)現(xiàn)隨機(jī)噪點(diǎn)的去除，具體操作為：用3×3的結(jié)構(gòu)元素掃描圖像的每一個(gè)像素，用結(jié)構(gòu)元素與其覆蓋的二值圖像進(jìn)行“與”操作，如果二者都為1，則該像素值設(shè)置為1，否則為0。膨脹算法是將與物體接觸的所有背景點(diǎn)合并到該物體中，從而實(shí)現(xiàn)從邊界向外部擴(kuò)張的過程，一方面可填補(bǔ)物體中的空洞，另一方面可還原腐蝕后的特征點(diǎn)，具體操作為：用3×3的結(jié)構(gòu)元素掃描圖像的每一個(gè)像素，用結(jié)構(gòu)元素與其覆蓋的二值圖像進(jìn)行“與”操作，如果都為0，則該圖像的像素值為0，否則為1。算法具體流程如圖5所示。

圖5 算法具體流程圖

3 實(shí)驗(yàn)流程

實(shí)驗(yàn)操作具體流程如圖6所示。先將反應(yīng)試劑加入流體芯片中，并在芯片上層小孔中分別連接進(jìn)樣和排樣軟管。再將流體芯片置于觀測臺(tái)上，控制底部磁鐵垂直上升至觀測臺(tái)底，實(shí)現(xiàn)對(duì)夾心免疫復(fù)合物的吸附。單片機(jī)驅(qū)動(dòng)蠕動(dòng)泵勻速轉(zhuǎn)動(dòng)，從左側(cè)將清洗液緩緩?fù)迫朊荛]反應(yīng)區(qū)，控制清洗液輸入速度適中，既保持夾心免疫復(fù)合物的均勻分布，又能夠?qū)⒎磻?yīng)區(qū)的雜質(zhì)清洗干凈。清洗后的廢液經(jīng)右側(cè)軟管排出。該清洗過程重復(fù)3次。

圖6 實(shí)驗(yàn)流程圖

在此實(shí)驗(yàn)流程的基礎(chǔ)上，針對(duì)系統(tǒng)掃描成像控制需求，編程實(shí)現(xiàn)樣本自動(dòng)化沖洗和熒光計(jì)數(shù)檢測。整體實(shí)驗(yàn)流程如圖7所示。添加試劑后，將磁鐵平移至芯片底部進(jìn)行吸附，通過單片機(jī)驅(qū)動(dòng)蠕動(dòng)泵的方式加入清洗液對(duì)反應(yīng)區(qū)間進(jìn)行清洗，再將磁鐵移開令試劑靜置，該步驟重復(fù)3次；隨后打開激發(fā)光源進(jìn)行熒光圖像采集；為了防止燈光直射令熒光信號(hào)淬滅，在每次采集后將激發(fā)光源關(guān)閉，調(diào)整視角后再將其重新打開，按此步驟分區(qū)域成像15次，以完成對(duì)反應(yīng)區(qū)的全面成像。

圖7 整體實(shí)驗(yàn)流程圖

4 性能測試

4.1 材料

傷寒沙門氏菌[北京生命科學(xué)研究所CMCC（B）50071]，營養(yǎng)肉湯（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司），AS316011型氨基磁珠（洛陽惠爾納米科技有限公司），F(xiàn)M610C型量子點(diǎn)標(biāo)記物（北京納諾金生物科技有限公司）。SPX-100B-Z型生化培養(yǎng)箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），tbbl-1玻璃涂布棒（海門維平實(shí)驗(yàn)器材廠），HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州越新儀器制造有限公司）。

4.2 檢測樣本制備方法

本實(shí)驗(yàn)基于數(shù)字免疫技術(shù)原理，以傷寒沙門氏菌為樣本，選取具備特異性吸附能力的磁珠和具有熒光染色能力的量子點(diǎn)試劑制備3層夾心免疫復(fù)合物，以此作為檢測系統(tǒng)性能評(píng)價(jià)的樣本。

以10倍為梯度制備102~105cfu/mL濃度的4組傷寒沙門氏菌菌液，并取磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）制備對(duì)照組。將90μL菌液、PBS分別和10μL氨基磁珠、5μL量子點(diǎn)試劑加入流體芯片中，于37℃條件下反應(yīng)30 min。

取102~105cfu/mL濃度的4組傷寒沙門氏菌菌液，每組各200μL進(jìn)行平板培養(yǎng)：無菌環(huán)境下取菌液滴加在固體培養(yǎng)基表面，使用玻璃涂布棒將其涂抹均勻，置于37℃的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h并計(jì)數(shù)。在實(shí)驗(yàn)過程中，同步制備2個(gè)平行樣，平板計(jì)數(shù)結(jié)果取平均值。

將芯片內(nèi)反應(yīng)后的試劑進(jìn)行3次沖洗后再進(jìn)行檢測。視野范圍為3 mm×2 mm，選取10~15個(gè)視野并對(duì)視野中的熒光點(diǎn)進(jìn)行計(jì)數(shù)，將計(jì)數(shù)結(jié)果求取平均值后，轉(zhuǎn)化成單位為cfu/mL的數(shù)值。

4.3 系統(tǒng)性能評(píng)價(jià)

在成像方面，首先使用USAF 1951標(biāo)準(zhǔn)分辨率板[如圖8（a）所示]對(duì)本系統(tǒng)的成像分辨力進(jìn)行測試，圖8（b）為圖8（a）中心區(qū)域放大的效果，其分辨力為228 lp/mm；其次利用網(wǎng)格分劃板對(duì)系統(tǒng)成像的視場進(jìn)行測試，結(jié)果如圖9（a）所示，網(wǎng)格間距為0.2 mm，因此單次成像視場為3 mm×2 mm；最后，針對(duì)實(shí)際樣本進(jìn)行熒光檢測，結(jié)果如圖9（b）所示，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)單個(gè)細(xì)菌熒光的成像。

圖8 標(biāo)準(zhǔn)分辨率板成像測試

圖9 樣本成像結(jié)果

對(duì)本系統(tǒng)進(jìn)行樣本測試后，部分檢測圖像如圖10所示。PBS的檢測結(jié)果為67 cfu/mL，與本系統(tǒng)102cfu/mL及以下濃度樣本檢測結(jié)果較接近，因此無法證明102cfu/mL及以下濃度樣本可被準(zhǔn)確檢測。最終，確定本系統(tǒng)可準(zhǔn)確檢測的范圍為103~105cfu/mL。

圖10 不同濃度下不同視野的實(shí)驗(yàn)圖像

對(duì)平板培養(yǎng)后的培養(yǎng)基內(nèi)菌落數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，組別間取平均值，作為檢測效率評(píng)估的重要參考，最終得到原菌液平板培養(yǎng)結(jié)果分別為3.5×103、2.1×104以及1.1×105cfu/mL，反應(yīng)后的計(jì)數(shù)結(jié)果分別為3.3×103、1.9×104以及1.0×105cfu/mL。

將實(shí)驗(yàn)所得到的反應(yīng)結(jié)果和對(duì)應(yīng)濃度原菌液平板培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)行比值處理，可計(jì)算出檢測效率分別為94.28%、90.47%以及90.90%，證明本系統(tǒng)對(duì)于傷寒沙門氏菌能夠?qū)崿F(xiàn)高效率、高靈敏度的檢測。

5 討論

本研究針對(duì)微生物檢測的需求，基于數(shù)字免疫技術(shù)設(shè)計(jì)了可實(shí)現(xiàn)高靈敏度檢測的數(shù)字免疫檢測系統(tǒng)：設(shè)計(jì)并制備了數(shù)字免疫流體芯片，簡化了樣本前處理的操作流程；針對(duì)熒光顯微成像要求，設(shè)計(jì)了熒光成像中繼鏡頭，相對(duì)常規(guī)熒光顯微鏡，擴(kuò)大了單次檢測成像視野，并縮小了體積；利用單片機(jī)驅(qū)動(dòng)蠕動(dòng)泵實(shí)現(xiàn)試劑自動(dòng)添加和清洗，簡化了操作流程；利用MATLAB設(shè)計(jì)圖像提取算法，完成了對(duì)熒光信號(hào)的準(zhǔn)確提取。采用傷寒沙門氏菌作為檢測樣本，對(duì)系統(tǒng)性能進(jìn)行評(píng)價(jià)，檢測靈敏度為3.5×103cfu/mL。

Farka等[10]設(shè)計(jì)的96孔微量滴定板樣本檢測體系為38 nL，Scheler等[15]設(shè)計(jì)的ddCFU樣本檢測體系為3μL，兩者均無法實(shí)現(xiàn)對(duì)低濃度樣本的準(zhǔn)確檢測。本研究設(shè)置的105μL的試劑體系可以實(shí)現(xiàn)最低濃度為103cfu/mL樣本的檢測，降低了樣本檢測濃度下限，有利于提高檢測靈敏度。Yang等[8]對(duì)于傷寒沙門氏菌的檢測靈敏度為1.14×105cfu/mL，夏詩琪等[9]對(duì)沙門氏菌進(jìn)行了檢測，實(shí)驗(yàn)時(shí)間為8 h。本研究設(shè)計(jì)的系統(tǒng)檢測時(shí)間縮短至30 min，檢測靈敏度提升至3.5×103cfu/mL。

但本研究依舊存在一些不足：（1）僅選擇了1種細(xì)菌作為檢測樣本，雖然進(jìn)行了多批次大量數(shù)據(jù)的采集，但是仍然不能完全排除單一樣本對(duì)系統(tǒng)性能評(píng)價(jià)結(jié)果的影響。（2）MATLAB屬于比較陳舊的方法，在應(yīng)用方面尚有提升空間。

總之，本系統(tǒng)可對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行準(zhǔn)確捕捉，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)傷寒沙門氏菌的高靈敏度檢測。與現(xiàn)有的數(shù)字免疫檢測系統(tǒng)相比，本系統(tǒng)降低了成本，提高了檢測靈敏度，在微生物檢測及定量分析檢測領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。在上述工作的基礎(chǔ)上，下一步將開展基于多色量子點(diǎn)標(biāo)記的病原微生物數(shù)字免疫檢測方法研究，以實(shí)現(xiàn)未知病原的多靶標(biāo)同步檢測，并對(duì)算法進(jìn)行分析優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)熒光信號(hào)的更精準(zhǔn)采集。