趙海菲，楊秀玲，余坤江，王天婭，晏偉，Aimal Nawaz Khattak，田恩堂*

（1.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴州 大學(xué)，貴州 貴陽(yáng)，550025；2.貴州省思南縣板橋鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)服務(wù)中心，貴州 銅仁，565100）

芥菜型油菜（Brassica juncea，AABB，2n=36）是重要的異源四倍體油料作物和蔬菜，起源于白菜（B. rapa，AA，2n= 20）與黑芥（B. nigra，BB，2n =16）種間雜交后的染色體自然加倍。相比于甘藍(lán)型油菜，芥菜型油菜具有更優(yōu)良的抗旱[1]、抗病[2]和抗裂角等特性[3,4]。芥菜型油菜屬于常異花授粉植物，異交率達(dá)到5%～30%[5]，而其異花授粉特性及其漫長(zhǎng)的演化歷史，使得該作物衍生出豐富的遺傳類(lèi)型，根據(jù)其用途可分為：油用、葉用、根用等[6,7]。傳統(tǒng)的油菜類(lèi)型主要根據(jù)表型及用途進(jìn)行分類(lèi)[8]，而分子標(biāo)記則為傳統(tǒng)分類(lèi)提供了有力工具，如Wu 等利用161 個(gè)SRAP 多態(tài)性標(biāo)記檢測(cè)了95 份芥菜型油菜材料的遺傳多樣性，并根據(jù)結(jié)果將其明確分為三類(lèi)：菜用芥菜、春性芥菜和冬性芥菜[9]。雖然傳統(tǒng)的表型分類(lèi)結(jié)果有時(shí)候與分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果不一致[10]，但分子標(biāo)記技術(shù)仍以其檢測(cè)的客觀(guān)、準(zhǔn)確和快速深受分類(lèi)學(xué)家及育種家青睞，也是對(duì)傳統(tǒng)分類(lèi)體系的有益補(bǔ)充。

種質(zhì)資源對(duì)于任何作物的育種都是十分重要的，因?yàn)榉N質(zhì)資源往往集中在少數(shù)國(guó)家和地區(qū)，且許多種質(zhì)資源都瀕臨滅絕[11]。雖然中國(guó)是芥菜型油菜的起源中心之一，種質(zhì)資源豐富，但在芥菜型油菜重新合成[12]及雜交選育[13～15]方向的研究略有滯后。在現(xiàn)有種質(zhì)資源基礎(chǔ)上進(jìn)行拓寬，對(duì)于芥菜型油菜優(yōu)異種質(zhì)資源的挖掘、新品種選育及基礎(chǔ)研究具有較大意義。為此我們前期搜集了大量的芥菜型油菜種質(zhì)，并從中選出了34份野生芥菜型油菜微核心種質(zhì)群體（micro-core population），前期品質(zhì)分析和表型分析表明這些材料具有較大的遺傳變異[16,17]。本研究在前期工作的基礎(chǔ)上，通過(guò)34 份不同芥菜型油菜野生種質(zhì)材料間的雜交及后代選育方法，創(chuàng)制大量芥菜型油菜的衍生種質(zhì)材料。并利用ILP（intron length polymorphism，內(nèi)含子長(zhǎng)度多態(tài)性）標(biāo)記技術(shù)對(duì)野生及其衍生種質(zhì)的遺傳多樣性進(jìn)行分析。而ILP 作為新一代的分子標(biāo)記，具有較強(qiáng)的多態(tài)性、特異性、共顯性和可靠性，先后在白菜和甘藍(lán)型油菜[18]，擬南芥[19]、谷子[20]、稻谷[21]、玉米[22]、大豆[23]等主要作物的遺傳多樣性分析方面都有應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究選用34 份芥菜型油菜微核心野生種質(zhì)為材料（表1），材料間表型差異較大[16]。通過(guò)這34份野生種質(zhì)材料間的雜交和自交創(chuàng)建了一批芥菜型油菜衍生種質(zhì)材料，創(chuàng)制方法為：等量混合34 份芥菜型油菜材料的花粉，并用毛筆將混合花粉授粉到每份材料的3 個(gè)去雄花蕾上去，從而獲得了102個(gè)（3×34）雜交系。第二季，再用34個(gè)親本的混合花粉對(duì)這102 個(gè)品系各自的2 個(gè)去雄的花蕾進(jìn)行授粉，獲得了204（2×102）個(gè)雜交系。最后，通過(guò)單籽傳法將204 個(gè)雜交系自交到F5，并通過(guò)田間表型和分子標(biāo)記篩選的方法，從中選取了51 份育種材料。全部材料種植在貴州大學(xué)教學(xué)實(shí)習(xí)場(chǎng)，并采集每份材料的幼嫩葉片用于DNA的提取。

1.2 方法

1.2.1 ILP 標(biāo)記 利用改良的CTAB 方法提取85份芥菜型油菜材料的基因組DNA[24,25]。然后利用262對(duì)ILP引物[26,27]檢測(cè)這些材料的基因型，其中102對(duì)引物來(lái)自擬南芥，160 對(duì)引物來(lái)自甘藍(lán)型油菜。每個(gè)PCR（20 μL）反應(yīng)體系包含1×標(biāo)準(zhǔn)PCR 緩沖液（NEB），1 U Taq 聚合酶（NEB），0.25 μmol/L 正向引物，0.25 μmol/L 反向引物，每個(gè)100 μmol/L dNTP 和50 ng 基因組DNA，總體積為20 μL。PCR 擴(kuò)增包括在94℃初始變性5 min，35 個(gè)循環(huán)包括94℃45 s，55℃45 s，72℃1 min；72℃7 min。所有PCR 產(chǎn)物均在2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分析。凝膠通過(guò)溴化乙錠染色可視化，在數(shù)字凝膠成像系統(tǒng)（UV SOLO,德國(guó)耶拿）上拍照，并將標(biāo)記信息錄入電腦。

1.2.2 數(shù)據(jù)處理 收集并鑒定有關(guān)PCR 產(chǎn)物的詳細(xì)信息。將多態(tài)性帶評(píng)分為存在（1）或不存在（0），并輸入數(shù)據(jù)庫(kù)。通過(guò)SM 系數(shù)計(jì)算品系之間的遺傳相似性，SM=（a+d）/（b+c），其中a表示品系i和j之間共有條帶，b 表示品系i 特有條帶，c 表示品系j 表示特有條帶，d 表示品系i 和j 表示共同缺失條帶。通過(guò)軟件NYSYS-pc2.1（Rohlf 2000）使用UPGM 方法對(duì)相似性矩陣進(jìn)行聚類(lèi)分析（樹(shù)狀圖）。

多樣性指數(shù)（DI）是根據(jù)每個(gè)品系中某個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)來(lái)計(jì)算的，用于評(píng)估不同品系或群體的遺傳多樣性。

其中pi表示存在（1）片段數(shù)與總片段數(shù)之間的比值，ai表示不存在（0）片段數(shù)與總片段數(shù)之間的比值，i表示條帶數(shù)。

1.2.3 含油量和蛋白質(zhì)含量測(cè)定 含油量和蛋白質(zhì)含量主要采用近紅外法（福斯新一代NIRS DS 2500F 近紅外多功能品質(zhì)快速分析儀）測(cè)定。每份材料選取3 g 左右的飽滿(mǎn)種子，并重復(fù)測(cè)定2 次，取平均值作為最終數(shù)據(jù)用于分析，結(jié)果以“%”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 多態(tài)性分析

本文選用85份芥菜型油菜資源為研究材料，其中包含34 份微核心野生種質(zhì)材料及其衍生的51 份種質(zhì)材料。34 份野生種質(zhì)中，有22 份油用芥菜；有12 份菜用芥菜（表1）。就種子顏色而言，23 份材料（67.6%）為栗色，7 份材料（20.6%）為黑色，3 份材料（8.8%）是黃色，1 份材料是灰黃色（表1）。這51份衍生種質(zhì)均來(lái)自于34 份野生種質(zhì)間混合授粉以及后續(xù)的自交和選擇。利用262 對(duì)ILP 引物檢測(cè)了85份材料的基因型，共獲得305個(gè)多態(tài)性標(biāo)記，其中大多數(shù)引物（224 對(duì)，占85.5%）僅產(chǎn)生一條多態(tài)性條帶，34 對(duì)引物（13.0%）產(chǎn)生了兩條多態(tài)性條帶，2對(duì)引物（引物名稱(chēng)：At3g52990 和PIP1848）產(chǎn)生3 條多態(tài)性條帶，而PIPR68 和At1g72890 分別產(chǎn)生了4條與5條多態(tài)性條帶。

表1 34份芥菜型油菜野生種質(zhì)材料Table 1 34 B.juncea accessions used in this study

2.2 聚類(lèi)分析

利用305 個(gè)ILP 多態(tài)性標(biāo)記計(jì)算出85 份材料遺傳相似系數(shù)，結(jié)果顯示遺傳相似系數(shù)（GSC）在0.250（OP256-OP332）到0.990（OP3-OP12）之間不等，并使用NTSYS-PC 2.1 軟件的UPGMA 方法構(gòu)建聚類(lèi)圖（圖1）。由圖1 可知，樹(shù)狀圖顯示在GSC 值為0.496處可劃分為兩個(gè)類(lèi)群。第Ⅰ類(lèi)群包含42份材料（49.4%），分別包括18 份野生種質(zhì)和24 份衍生種質(zhì)材料，其中18 份野生種質(zhì)材料又包括10 份油用和8 份菜用材料，GSC 平均值為0.510，范圍在0.260 到0.990 之間。第Ⅱ類(lèi)群包括43 份材料（50.6%），分別包括16 份野生種質(zhì)和27 份衍生種質(zhì)，其中16份野生種質(zhì)材料又包括4份油用及12份菜用材料，GSC 平均值為0.520，范圍在0.250 到0.990 之間。野生種質(zhì)及其衍生種質(zhì)以混合的方式聚集在一起，表明這些衍生種質(zhì)親本來(lái)源的廣泛性。

圖1 85份芥菜型油菜野生株系（W）和衍生株系（OP）的聚類(lèi)分析Fig.1 Dendrogram of 85 lines in B.juncea parental lines（W）and the derivative lines（OP）

2.3 多樣性指數(shù)分析

為了評(píng)估野生種質(zhì)及其衍生種質(zhì)間的差異性，引入了多樣性指數(shù)DI。由圖2可知野生種質(zhì)及其衍生種質(zhì)兩組間的總體分布頻率相似，這些品系的大多數(shù)DI 值集中在0.48 至0.50 之間。衍生種質(zhì)DI值在0.34 到0.50 之間不等，平均值為0.48，野生種質(zhì)親本品系DI 值在0.39～0.50 之間，平均值為0.47，相比之下，衍生種質(zhì)的DI值略高于親本系。

圖2 34份野生種質(zhì)和51份衍生種質(zhì)新品系的多樣性指數(shù)（DI）分布Fig.2 Frequency distribution of the diversity index（DI）for 34 parental wild lines and 51 derivative lines

2.4 含油量和蛋白質(zhì)含量變異分析

野生及衍生種質(zhì)材料的含油量和蛋白質(zhì)含量表現(xiàn)出了豐富的遺傳變異，由表2可知，野生種質(zhì)含油量分布在29.95%～42.47%之間，平均含油量為36.74%；蛋白質(zhì)含量范圍分布在16.04%～24.09%之間，平均含量為19.92%。衍生種質(zhì)含油量分布在32.26%～46.25%之間，平均含油量為41.12%；蛋白質(zhì)含量范圍分布在21.93%～32.63%之間，平均含量為26.96%。衍生材料中，含油量前三的材料是：OP340（46.25%），OP45（45.92%）和OP356（45.40%）；蛋白質(zhì)含量最高的材料是：OP224（32.63%），OP182（32.14%）和OP74（32.00%）。對(duì)野生及其衍生種質(zhì)材料的種子含油量及蛋白質(zhì)含量分別進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明二者含油量與蛋白質(zhì)含量之間均呈現(xiàn)極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為-0.612與-0.899。

表2 野生及衍生種質(zhì)材料含油量與蛋白質(zhì)含量統(tǒng)計(jì)表Table 2 Information of oil and protein contents in parental wild lines and their derived lines

3 討論與結(jié)論

基于外顯子區(qū)域構(gòu)建的ILP 型標(biāo)記具有較強(qiáng)的重復(fù)性、可靠性及多態(tài)性，該類(lèi)型的標(biāo)記也是首次用于芥菜型油菜的遺傳多樣性分析。本研究利用多態(tài)性的ILP 標(biāo)記將85 份種質(zhì)材料劃分成兩個(gè)群體，每個(gè)群體內(nèi)野生種質(zhì)和衍生種質(zhì)混合分布，說(shuō)明新創(chuàng)種質(zhì)與其親本材料來(lái)源的親緣關(guān)系。而新創(chuàng)種質(zhì)具有更大的遺傳變異范圍，也為利用混合授粉方法拓寬芥菜型油菜種質(zhì)基礎(chǔ)提供了證據(jù)。此外，聚類(lèi)結(jié)果可以為這些種質(zhì)材料未來(lái)的雜交及新品種選育和基礎(chǔ)研究提供重要的遺傳信息。例如，我們課題組根據(jù)本研究中獲得的芥菜型油菜種質(zhì)“貴定苦油菜”和“余豐榨菜”之間具有較大遺傳差異的特點(diǎn)（GSC=0.44），構(gòu)建了一個(gè)芥菜型油菜重組自交系群體，該群體的后代表現(xiàn)出了較大的表型變異。同時(shí)，我們也發(fā)現(xiàn)9 種蔬菜型芥菜和25 種油籽芥菜并未按照傳統(tǒng)分類(lèi)聚入兩個(gè)群體中，而是混合聚在一起，說(shuō)明按照傳統(tǒng)的應(yīng)用分類(lèi)與遺傳聚類(lèi)的分類(lèi)可能存在不一致性。芥菜型油菜傳統(tǒng)分類(lèi)更多的是考慮材料的實(shí)際用途，而非考慮遺傳差異，因此在傳統(tǒng)分類(lèi)和基于分子標(biāo)記的遺傳分類(lèi)二者之間可能會(huì)出現(xiàn)差異,如Fu 等也曾報(bào)道了傳統(tǒng)分類(lèi)與基于芥菜型油菜的分子標(biāo)記的遺傳差異之間結(jié)果的不一致性[8]。

混合授粉法是近些年多親本材料選育方法的延伸，本研究通過(guò)兩輪混合授粉及后代選育方法，選出了51份性狀較好的育種株系，這些材料在含油量和蛋白質(zhì)含量上表現(xiàn)出了優(yōu)于親本的特性。衍生種質(zhì)含油量和蛋白質(zhì)含量的提升，主要是因?yàn)槠渚酆狭硕鄠€(gè)親本的優(yōu)異等位基因，如中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所通過(guò)聚合多個(gè)含油量?jī)?yōu)異等位基因選育出超過(guò)60%含油量的甘藍(lán)型油菜新品系。野生及其衍生種質(zhì)分別進(jìn)行相關(guān)性分析顯示，含油量和蛋白質(zhì)含量均呈現(xiàn)極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，這點(diǎn)與前期研究結(jié)果一致[28]。目前，我國(guó)正在大力開(kāi)展種質(zhì)資源的搜集、保護(hù)與利用工作，尤其對(duì)于那些瀕危野生資源意義重大。而本研究的開(kāi)展則著眼于有限種質(zhì)資源的利用，即可以通過(guò)種質(zhì)資源間雜交結(jié)合表型篩選的途徑獲得優(yōu)異新資源。本研究的開(kāi)展對(duì)于芥菜型油菜育種與基礎(chǔ)研究具有一定參考價(jià)值。