油菜鹽脅迫響應(yīng)miRNA及其靶基因鑒定

王越，周婷，岳彩鵬，黃進(jìn)勇，華營(yíng)鵬

（鄭州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南 鄭州，450001）

土壤鹽堿化是全球重要的環(huán)境和農(nóng)業(yè)問題。據(jù)估計(jì)，鹽脅迫可能影響全球一半的可耕地。土壤鹽脅迫嚴(yán)重抑制了作物生長(zhǎng)發(fā)育并顯著降低了作物的產(chǎn)量[1]，其主要原因是鹽脅迫會(huì)導(dǎo)致高滲透脅迫、氧化應(yīng)激、營(yíng)養(yǎng)失衡、離子毒性、生物膜紊亂，并嚴(yán)重破壞細(xì)胞分裂及關(guān)鍵代謝等過程，導(dǎo)致水勢(shì)下降，從而限制水分的吸收和細(xì)胞的擴(kuò)張[2]。為了在鹽脅迫條件下生存下來，植物已經(jīng)進(jìn)化出各種復(fù)雜的機(jī)制來緩解鹽脅迫對(duì)自身造成的損傷[3,4]。因此，了解鹽脅迫的分子機(jī)制對(duì)于提高作物耐鹽性具有重要意義[5]。

MicroRNA（miRNA）是一類由內(nèi)源基因編碼的長(zhǎng)度約為18～24 nt 的非編碼單鏈RNA 分子，在轉(zhuǎn)錄后和翻譯水平負(fù)調(diào)控基因表達(dá)[6]。越來越多的證據(jù)表明，miRNA 參與了植物對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)[6～10]，如溫度[11]、干旱[12]和鹽[13,14]脅迫。在擬南芥鹽脅迫反應(yīng)中，miR156、miR167、miR168 和miR396 等多個(gè)miRNA 存在差異表達(dá)[15]。過表達(dá)水稻miR319a的匍匐禾草（Agrostis stolonifera）表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐鹽性[16]，其原因是鹽脅迫誘導(dǎo)miR319 表達(dá)升高，導(dǎo)致至少4個(gè)miR319 的靶基因（AsPCF5、AsPCF6、AsPCF8和AsTCP14）和AsNAC60的表達(dá)下調(diào)，從而提高了植株的鹽脅迫抗性。過表達(dá)miR396和miR394的棉花和擬南芥表現(xiàn)出高度的鹽脅迫敏感性[17～19]，其原因是miR396 和miR394 可能作為一種負(fù)調(diào)控因子，分別以GRF 和LCR 等調(diào)控蛋白為靶點(diǎn)。其中GRF 抑制擬南芥的應(yīng)激反應(yīng)基因AtDREB2A的表達(dá)，增加了植物對(duì)滲透脅迫的耐受性，LCR 則以ABA 依賴性方式參與擬南芥鹽脅迫抗性反應(yīng)。鹽脅迫激活WRKY并調(diào)節(jié)植物中脅迫耐受性相關(guān)途徑越來越受關(guān)注[15]。前人研究表明，擬南芥RPD3-like 組蛋白去乙酰化酶HDA9 通過調(diào)節(jié)WRKY53 的DNA 結(jié)合能力和轉(zhuǎn)錄活性來降低擬南芥的鹽脅迫抗性[20]。近期研究發(fā)現(xiàn)蘋果中MdSPL13 與MdWRKY100啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，并正向調(diào)節(jié)MdWRKY100的表達(dá)，通過促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄，如抗氧化劑生物合成，糖代謝和脯氨酸生物合成有關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)一步維持ROS 和滲透平衡，從而增強(qiáng)鹽脅迫的耐受性[21]。植物在鹽脅迫下的生存需要對(duì)脅迫條件的快速感知和適應(yīng)。前人研究[22]表明RACK1A誘導(dǎo)的miR393 生物發(fā)生，下調(diào)了生長(zhǎng)素信號(hào)，可能以此調(diào)節(jié)擬南芥對(duì)鹽度的適應(yīng)。最近研究表明[23]通過表達(dá)TIR1，增加植物生長(zhǎng)素信號(hào)傳導(dǎo)，可能會(huì)觸發(fā)植物生長(zhǎng)素介導(dǎo)的下游途徑，以通過滲透壓調(diào)節(jié)和增加Na+外排來增強(qiáng)植物對(duì)鹽脅迫的抗性。這一發(fā)現(xiàn)使我們更好地理解miR393 介導(dǎo)生長(zhǎng)素調(diào)節(jié)的鹽脅迫反應(yīng)。上述研究結(jié)果均表明，miRNA 在植物的鹽脅迫抗性反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

油菜(AnAnCnCn,2n=4x=38)是世界上重要的油料作物之一，起源于其二倍體祖先Brassica rapa(ArAr, 2n=2x=20)和Brassica oleracea(CoCo, 2n=2x=18)的自發(fā)雜交[24]。目前，在擬南芥以及甘藍(lán)型油菜等作物中，已有一些耐鹽性相關(guān)的基因被克隆與鑒定。如脯氨酸合成的關(guān)鍵基因P5CS1[25]，通過緩解滲透脅迫來參與油菜鹽脅迫響應(yīng)；控制油菜離子穩(wěn)態(tài)的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因BnNHX1[26]，可在液泡中隔離Na+和K+，并通過維持Na+/K+穩(wěn)態(tài)并增強(qiáng)滲透和抗氧化調(diào)節(jié)能力，賦予轉(zhuǎn)基因油菜耐鹽性。還有諸多轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控耐鹽性，如WRKY家族[27]，NAC家族[28]等。盡管前人已經(jīng)對(duì)油菜的鹽脅迫抗性展開了系列研究，但由于油菜基因組龐大復(fù)雜，耐鹽機(jī)制中許多問題仍有待探索。

本研究的目的是鑒定油菜生長(zhǎng)發(fā)育過程中對(duì)響應(yīng)鹽脅迫的miRNA 及其核心靶基因并研究其在鹽脅迫中發(fā)揮的作用。本研究在200 mmol·L-1NaCl（T）和無鹽處理對(duì)照（C）條件下培養(yǎng)油菜，分別從地上部（S）和根（R）中取樣，提取總RNA 后構(gòu)建了12個(gè)miRNA 文庫(kù)。通過使用高通量測(cè)序技術(shù)分析了12個(gè)miRNA測(cè)序文庫(kù)，最終鑒定到了穩(wěn)定差異表達(dá)的26個(gè)miRNA，并根據(jù)與相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜的比較預(yù)測(cè)了它們的靶基因。這些鑒定到的差異表達(dá)miRNA 及其核心靶基因有助于深入了解植物鹽脅迫抗性的分子機(jī)制，并為油菜鹽脅迫抗性的遺傳改良提供了優(yōu)異的基因資源。

1 材料與方法

1.1 植物材料及試驗(yàn)設(shè)置

油菜種子為中雙11，由鄭州大學(xué)黃進(jìn)勇教授提供，在25℃黑暗條件下催芽約24 h，挑選露白一致的油菜種子均勻擺放在鋪有濾紙的育苗盤中，放于溫室25℃±3℃培養(yǎng)架上培養(yǎng)，幼苗長(zhǎng)到5 cm 左右選取生長(zhǎng)一致的健壯幼苗，移栽到盛有適量霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液的黑色塑料盆中水培生長(zhǎng)，每5 d 更換一次營(yíng)養(yǎng)液[29]。試驗(yàn)在光照培養(yǎng)室中進(jìn)行，生長(zhǎng)環(huán)境設(shè)定如下：光照強(qiáng)度150 μmol/（m2·s），室溫24℃（白天）/22℃（夜晚），光照周期16 h（光照）/8 h（黑暗），相對(duì)濕度60%。

全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序是在種子萌發(fā)7 d 后，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的油菜幼苗，將其培養(yǎng)在不含NaCl的條件下生長(zhǎng)10 d，隨后轉(zhuǎn)移到含200 mmol·L-1NaCl 的溶液中培養(yǎng)12 h 直至取樣。處理組和對(duì)照組油菜幼苗分別取其地上部和根部，每個(gè)部位均包含3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2 mRNA文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序

mRNA 文庫(kù)構(gòu)建、測(cè)序詳情以及本文所用的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)參考本課題組已經(jīng)發(fā)表的文章[30]。本文中重點(diǎn)分析油菜鹽脅迫響應(yīng)的miRNA及其靶基因。

1.3 sRNA文庫(kù)的構(gòu)建和測(cè)序

使用TRIzol法提取油菜總RNA，用Nanophotometer?分光光度計(jì)（IMPLEN, CA, USA）檢測(cè)RNA 純度，使用Qubit?RNA 檢測(cè)試劑盒在Qubit?2.0 熒光計(jì)（Life Technologies, CA, USA）中檢測(cè)其濃度。為了評(píng)估RNA 的完整性，使用Agilent Bioanalyzer 2000 system（Agilent Technologies,CA,USA）的RNA Nano 6000 檢測(cè)試劑盒測(cè)定RNA 的完整性值。隨后使用Illumina?的NEBNext?Multiplex 小RNA 文庫(kù)制備試劑盒（NEB，USA）構(gòu)建小RNA 文庫(kù)，將索引代碼添加到每個(gè)樣本的屬性序列中，每個(gè)樣品共使用約3.0 μg RNA。在miRNA 的3'和5'端添加特定的索引代碼，然后使用M-MuLV 逆轉(zhuǎn)錄酶（RNase H-）作為催化劑合成第一鏈cDNA。使用LongAmp Taq 2× Master Mix、Illumina 小RNA 引物和index 接頭引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 產(chǎn)物經(jīng)8%聚丙烯酰胺凝膠電泳純化，回收140～160 bp 的DNA 片段。使用Agilent Bioanalyzer 2100 system（Agilent Technologies,CA，USA）對(duì)文庫(kù)質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估。隨后使用TruSeq SR Kit v3-cBOt-HS（Illumina）在cBot 集群生成系統(tǒng)上對(duì)索引代碼樣本進(jìn)行聚類。集群生成后，在Illumina Hiseq 2500平臺(tái)上對(duì)庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，生成50 bp的單端reads。

1.4 數(shù)據(jù)過濾和讀取

測(cè)序完成后，首先對(duì)原始reads 進(jìn)行過濾，去除reads中的3’接頭序列、由于接頭自連等原因?qū)е聸]有插入片段的reads、剪切3’端測(cè)序質(zhì)量較低的堿基（質(zhì)量值小于20）、含未知堿基N 的reads、長(zhǎng)度過短的reads（＜18 nt）和長(zhǎng)度過長(zhǎng)的reads（＞32 nt）以及含有poly A 尾的reads。計(jì)算數(shù)據(jù)的Q20、Q30和GC 含量，以便進(jìn)一步分析。然后，將高質(zhì)量的sRNA 標(biāo)記通過Bowtie 無錯(cuò)配的方式對(duì)比到油菜參考序列上，分析其在油菜參考基因組（中雙11）上的表達(dá)和分布。

1.5 miRNA分類，靶基因預(yù)測(cè)及其差異表達(dá)分析

對(duì)過濾后的reads 進(jìn)行分類，分析sRNA 數(shù)據(jù)的組成，選擇篩選18～32 nt的reads 作為后續(xù)分析的有效性數(shù)據(jù)，并進(jìn)行該區(qū)間sRNA 長(zhǎng)度分布的統(tǒng)計(jì)[31]。參照miRBase 20.0，使用mirdeep2 和srna-tolls-cli獲得潛在的miRNA 并繪制二級(jí)結(jié)構(gòu)。使用自定義腳本獲得miRNA 計(jì)數(shù)和堿基偏置。整合miREvo 和miRdeep2，通過探索不加注釋的小RNA 標(biāo)簽的二級(jí)結(jié)構(gòu)、Dicer 裂解位點(diǎn)和最小自由能，預(yù)測(cè)新的miRNA。psRobot 中通過psRobot_tar 對(duì)miRNA 的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)。miRNA 表達(dá)水平通過每百萬轉(zhuǎn)錄量（TPM）來估計(jì)。使用DESeq R 軟件包（1.8.3）將校正后的p值設(shè)為0.05 作為鑒別差異表達(dá)miRNA 的閾值。差異表達(dá)的miRNA 及其靶基因通過Wallenius non-central hyper-geometric distribution 進(jìn)行GO分析。利用KEGG（http://www. kegg. jp/）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)miRNA 及其靶基因的代謝途徑富集進(jìn)行分析[30,32]，并使用KOBAS 來檢測(cè)KEGG 通路中miRNA 及其靶基因的富集情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 sRNA序列分析

為了探究油菜鹽脅迫條件下miRNA 的調(diào)控機(jī)制，提取了在200 mmol·L-1鹽濃度下生長(zhǎng)的油菜總RNA 并進(jìn)行了小RNA 測(cè)序。使用Illumina 測(cè)序技術(shù)，在對(duì)照組地上部（control shoot,CS）、處理組地上部（treatment shoot，TS）、對(duì)照組根部（control root,CR）和處理組根部（treatment root, TR）小RNA 文庫(kù)中分別獲得約35 704 556、40 977 538、45 958 866 和41 322 651 條raw reads（表1）。對(duì)raw reads 進(jìn)行過濾后，單個(gè)樣品的clean reads 比率、Q20、Q30以及GC含量分別在90%、98%以及39%以上?？偣搏@得了164 070 484個(gè)clean reads（表2）。

表1 油菜文庫(kù)小RNA測(cè)序結(jié)果Table 1 Results of sRNA sequencing of B.napus library

在本研究的轉(zhuǎn)錄組中，小RNA 序列長(zhǎng)度在18～32 nt 范圍內(nèi)，最豐富的是21～24 nt（圖1A）。這些小RNA 由已知的miRNA、預(yù)測(cè)的miRNA、核糖體RNA（rRNAs）、轉(zhuǎn)移核糖核酸（tRNAs）、核小RNA（sn-RNAs）、核仁小RNA（snoRNAs）、反作用小干擾RNA（TAS）和未知的片段組成（表2）。本研究發(fā)現(xiàn)，在總的小RNA 中有6.68%～14.34%是已知的miRNA，而73.91%～80.86%是未知的miRNA。未知的miRNA數(shù)量如此之多，表明在油菜中仍有很多的miRNA 有待鑒定。從地上部和根中分別鑒定出2897 和2435個(gè)miRNA（圖1B），其中，不論在地上部還是根中，已知的miRNA 數(shù)量總是少于預(yù)測(cè)的新的miRNA。最豐富的miRNA 序列長(zhǎng)度為24 nt（12.91%），其次是21 nt（8.40%）和23 nt（8.85%）（圖1A），這些長(zhǎng)度與被子植物中典型的miRNA 分布相似。樣品中長(zhǎng)度為24 nt的miRNA 首位堿基以“U”為主，這符合miRNA首位堿基偏向“U”的特征（圖1C，D）。

表2 小RNA注釋分類Table 2 Annotation classification of small RNA

圖1 不同處理?xiàng)l件下油菜地上部和根中miRNA堿基長(zhǎng)度分布（A）、數(shù)量（B）、首位堿基偏好性（C）、各位點(diǎn)堿基偏好性（D）Fig.1 Base length distribution of miRNAs(A),numbers of miRNAs(B),preference distribution of the first base of different length miRNAs(C),base preference distribution of miRNAs(D)in shoots and roots of B.napus under different treatments

2.2 油菜中保守miRNA及新miRNA的鑒定

為了鑒定油菜地上部和根中的保守miRNA，將小RNA 序列與miRBase 數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的植物miRNA序列進(jìn)行比較。通過BLASTN搜索和進(jìn)一步的序列分析，共發(fā)現(xiàn)了26 個(gè)miRNA 家族中的91 個(gè)miRNA。最大的miRNA 家族miR169 有10 個(gè)成員（圖2）。從文庫(kù)中可以看出，這些miRNA 家族的豐度存在明顯差異。為了比較它們表達(dá)水平，計(jì)算了12 個(gè)文庫(kù)中每個(gè)miRNA 的每百萬讀次的平均轉(zhuǎn)錄量（TPM）[33,34]。TPM 標(biāo)準(zhǔn)化后，bna-miR395f 的表達(dá)水平最低，而bna-miR171f的相對(duì)表達(dá)水平最高，其次是bna-miR166b 和bna-miR169j。為了識(shí)別新的miRNA，使用miREvo 和miRDeep2 程序預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)和Dicer 裂解位點(diǎn)，并測(cè)量最小自由能?？偣矎?2 個(gè)文庫(kù)中預(yù)測(cè)了2116 個(gè)新miRNA。新的成熟miRNA的長(zhǎng)度為18～24 nt，約60%為24 nt。

圖2 油菜地上部和根中每個(gè)miRNA家族的保守miRNA數(shù)量Fig.2 Number of conserved miRNAs of each miRNA family in shoots and roots of B.napus

2.3 不同鹽處理下油菜miRNA的差異表達(dá)分析

為了確定miRNA 的表達(dá)與鹽脅迫的關(guān)系，對(duì)miRNA 的表達(dá)量進(jìn)行了分析，篩選出了表達(dá)量相對(duì)較高的15個(gè)miRNA，并分析它們?cè)谟筒说厣喜亢透械谋磉_(dá)情況（圖3A）。使用fold-change 進(jìn)行計(jì)算，將處理組地上部和根部中miRNA 的表達(dá)與對(duì)照組地上部和根部中miRNA 表達(dá)進(jìn)行比較，規(guī)定|fold change|≥2 且p＜0.05 條件下的miRNA 在鹽脅迫條件下存在表達(dá)差異[35,36]。

與CS文庫(kù)中的表達(dá)相比，TS文庫(kù)中有9個(gè)miRNA 表達(dá)下調(diào)，6 個(gè)miRNA 表達(dá)上調(diào)（圖3B），與CR文庫(kù)中的表達(dá)相比，TR 文庫(kù)中有25 個(gè)miRNA 表達(dá)下調(diào)，13 個(gè)miRNA 表達(dá)上調(diào)（圖3C）。這些差異表明，鹽脅迫影響著這些miRNA的表達(dá)。

圖3 不同處理下差異表達(dá)量前15的miRNA在地上部和根中所占的比例（A），地上部處理組和對(duì)照組之間差異表達(dá)miRNA的表達(dá)量（B）和根部處理組和對(duì)照組之間差異表達(dá)miRNA的表達(dá)量（C）Fig.3 Proportion of miRNA in shoots and roots of the top 15 with differential expression under different treatments(A),differential expressions of miRNA between treatment shoot and control shoot(B),and differential expressions of miRNA between control root and treatment root(C)

2.4 差異表達(dá)miRNA的靶基因數(shù)量分析

為了進(jìn)一步解釋miRNA 在鹽脅迫反應(yīng)中的作用，我們對(duì)miRNA 的靶基因進(jìn)行了分析，并統(tǒng)計(jì)了每個(gè)差異表達(dá)miRNA 的靶基因數(shù)目，其中靶基因數(shù)目最多的是bna-miR156d，bna-miR156e和bnamiR156f，分別都含有85個(gè)受調(diào)控的靶基因（圖4）。

圖4 差異表達(dá)miRNA的靶基因數(shù)量Fig.4 Numbers of target genes of miRNAs

2.5 miRNA靶基因GO注釋和KEGG分析

在CS 和TS 小RNA 文庫(kù)中，鑒定出17 個(gè)差異表達(dá)的miRNA，共含有93 個(gè)靶基因；其中已知miRNA的靶基因有89 個(gè)，新miRNA 的靶基因有4 個(gè)。在CR 和TR 小RNA 文庫(kù)中，鑒定出38 個(gè)差異表達(dá)的miRNA，共含有684個(gè)預(yù)測(cè)靶基因，其中已知miRNA的靶基因有544 個(gè)，新miRNA 的靶基因有140 個(gè)。大多數(shù)的預(yù)測(cè)靶基因編碼的一些與脅迫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，其中包括SPL、LAC、UBC、NFY以及其它蛋白質(zhì)如AGO2、超氧化物歧化酶等。為了了解miRNA 的生物學(xué)功能，所有推測(cè)的靶基因都通過Blast2GO 軟件進(jìn)行了GO 功能分類，以進(jìn)一步探討miRNA在響應(yīng)鹽脅迫中的作用。

已知miRNA 和新miRNA 的靶基因被分為三個(gè)GO類別：細(xì)胞組分（CC）、生物學(xué)過程（BP）和分子功能（MF）。圖5（A）是在CS 和TS 小RNA 文庫(kù)中鑒定到的miRNA 靶基因GO 富集圖，圖5（B）是在CR 和TR 小RNA 文庫(kù)中鑒定到的miRNA 靶基因GO 富集圖。CS 和TS 小RNA 文庫(kù)中共有93 個(gè)靶基因參與了1835 個(gè)GO 條目（圖5A）。其中BP 中高度富集的GO 條目是細(xì)胞過程（cellular process）；CC 中高度富集的GO 條目是細(xì)胞（cell）；MF 中高度富集的GO 條目是結(jié)合活性（binding）。CR 和TR 兩個(gè)小RNA 庫(kù)共有684 個(gè)靶基因參與了4941 生物過程（圖5B）。其中BP 中高度富集的GO 條目是細(xì)胞過程（cellular process）；CC 中高度富集的GO 條目是細(xì)胞（cell）；MF 中高度富集的GO 條目是結(jié)合活性（binding）。四個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中都發(fā)現(xiàn)了刺激反應(yīng)（response to stimulus），表明這些靶基因可以在應(yīng)對(duì)鹽脅迫中發(fā)揮作用。已知KEGG 代謝通路被分為7 大類：代謝（Metabolism）、遺傳信息處理（genetic information processing）、環(huán)境信息處理（environmental in-formation processing）、細(xì)胞過程（cellular processes）、生物體系統(tǒng)（organismal systems）、人類疾?。╤uman diseases）、藥物開發(fā)（drug development）。圖6是差異表達(dá)miRNA靶基因參與的pathway通路，其中A圖為CS和TS小RNA 文庫(kù)中鑒定到的差異表達(dá)miRNA 靶基因參與的pathway 通路，B 圖為CR 和TR 小RNA 文庫(kù)中鑒定到的差異表達(dá)miRNA 靶基因參與的pathway 通路。在CS和TS小RNA文庫(kù)中的生物體系統(tǒng)（organismal systems）中有18 個(gè)靶基因參與了免疫防御系統(tǒng)（immune system）。在CR 和TR 兩個(gè)小RNA 庫(kù)在CS 和TS 小RNA 文庫(kù)中的生物體系統(tǒng)（organismal systems）中有21 個(gè)靶基因參與了免疫防御系統(tǒng)（immune system）。上述結(jié)果表明這些靶基因可以積極參與油菜鹽脅迫抗性反應(yīng)。

圖5 差異表達(dá)miRNA靶基因功能分類Fig.5 Functional classification of different expression miRNA targets

圖6 差異表達(dá)miRNA靶基因參與的pathway通路Fig.6 Pathway involved in differentially expressed miRNAs target genes

2.6 油菜地上部和根中差異表達(dá)miRNA的分析

通過分析油菜地上部和根中miRNA 的差異表達(dá)譜，圖7A 和圖7B分別是鹽脅迫條件下，油菜地上部中上調(diào)表達(dá)和下調(diào)表達(dá)的miRNA；圖7C 和圖7D是鹽脅迫條件下，油菜根中上調(diào)和下調(diào)表達(dá)的miRNA。在地上部中，發(fā)現(xiàn)NaCl處理后bna-miR397a和bna-miR397b表達(dá)顯著上調(diào),bna-miR169a、bnamiR169b和bna-miR169n的表達(dá)顯著下調(diào)。在根中，bna-miR156a、bna-miR156d、bna-miR156e、bnamiR156f以及bna-miR824的表達(dá)顯著上調(diào)，而bnamiR169j、bna-miR169i、bna-miR169h、bna-miR169k、bna-miR169g、bna-miR169a和bna-miR169b的表達(dá)并沒有顯著變化，bna-miR169m、bna-miR169n、bnamiR169c、bna-miR169e、bna-miR169f、bna-miR169d和bna-miR169b表達(dá)顯著下調(diào)。

圖7 鹽脅迫條件下油菜的差異表達(dá)miRNAFig.7 Differentially expressed miRNAs in B.napus under salt stress

2.7 靶基因表達(dá)分析

前人研究表明有多個(gè)miRNA 參與植物鹽脅迫反應(yīng)[23,37～41]，分別為miR397-LAC（bna-miR397a、bnamiR397b） 、 miR156-SPL（bna-miR156a、bnamiR156d、bna-miR156f、bna-miR156e）、miR169-NFY（bna-miR169m、bna-miR169g、bna-miR169n）以及miR399-UBC（bna-miR399b）。其中轉(zhuǎn)錄因子miR156 的靶基因是SPL[37]，在本研究中（圖8）發(fā)現(xiàn)miR156在根中表達(dá)量上調(diào)，而在本課題組前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中發(fā)現(xiàn)SPL15表達(dá)量下調(diào)[30]，因此miR156 可能通過調(diào)控SPL15來響應(yīng)鹽脅迫，從而緩解鹽脅迫給植物帶來的損傷。LAC是miR397 的靶基因，其可以通過調(diào)控木質(zhì)素含量來響應(yīng)外界非生物脅迫，差異表達(dá)分析顯示miR397在地上部中表達(dá)上調(diào)，LAC12在本課題組前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中表達(dá)量下調(diào)[30]，miRNA397 可能通過調(diào)控LAC12的表達(dá)，促進(jìn)原生木質(zhì)部細(xì)胞壁增厚，從而響應(yīng)鹽脅迫。轉(zhuǎn)錄因子NFY是miR169的靶基因[42]，它是非生物脅迫反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子，在本研究中發(fā)現(xiàn)miR169在地上部和根中的表達(dá)量都下調(diào)，而在本課題組前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中NFYA5的表達(dá)量顯著上調(diào)[30]，miR169 可能通過調(diào)控NFYA5的表達(dá)參與鹽脅迫反應(yīng)。UBC是miR399 的靶基因，差異表達(dá)分析顯示miR399在根中表達(dá)量下調(diào)，而在本課題組前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中UBC29的表達(dá)量顯著性上調(diào)[30]，miR399 可能通過調(diào)控UBC29的表達(dá)從而參與異常蛋白質(zhì)降解過程，提高作物的耐鹽性。

圖8 鹽脅迫條件下對(duì)miRNA397靶基因LAC的影響（A）、miRNA156靶基因SPL的影響（B）、miRNA169靶基因NFY的影響（C）、miRNA399靶基因UBC的影響（D）Fig.8 Impact on miRNA397 target gene LAC(A),miRNA156 target gene SPL(B),miRNA169 target gene NFY(C),and miRNA399 target gene UBC(D)under salt stress

3 討論

鹽漬土使植物暴露在滲透脅迫下，滲透脅迫對(duì)植物最重要的后果之一是產(chǎn)生大量活性氧，隨后是氧化損傷，例如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、色素和DNA 的降解。生長(zhǎng)在含鹽條件下的植物吸收有害離子，尤其是鈉離子和氯離子，其大量積累對(duì)細(xì)胞有毒，并加劇滲透脅迫。這些離子破壞膜完整性、細(xì)胞代謝、酶結(jié)構(gòu)、細(xì)胞生長(zhǎng)和光合作用[43]。近年來，miRNA 在基因表達(dá)調(diào)控中的作用越來越清晰，許多miRNA 如miR156、miR169、miR393、miR396、miR397 及其靶基因[44]等在擬南芥[13]、大豆[45]、大麥[46]等多種植物的鹽脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

前人研究表明油菜中有56 個(gè)基因編碼假定的轉(zhuǎn)錄因子在非生物脅迫下會(huì)發(fā)生改變[47]。在這些基因中，已經(jīng)顯示在鹽脅迫下上調(diào)超過5 倍的基因來自AP2-EREBP家族（ATERF11,CBF4/DREB1D,CBF1/DREB1B, ATERF4/RAP2.5）,堿性-螺旋-環(huán)-螺旋（bHLH）家族（AtbHLH17），堿性區(qū)亮氨酸拉鏈（bZIP）家族（AtbZIP55/GBF3），C2H2家族（ZAT10、ZAT12、RHL41、ZAT6和ZAT102/RHL41） ，NAC 家 族（ANAC036、ANAC029/ATNAP、ANAC055/ATNAC3、ANAC047、ANAC072/RD26、ANAC002/ATAF1、ANAC019和ANAC032），WRKY家族（ATWRKY53，ATWRKY40和ATWRKY33），熱激家族（ATHSFA1E）以及Homeobox家族（ATHB-7）。此后，由轉(zhuǎn)錄因子和其他蛋白質(zhì)組成的復(fù)雜基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)控制著許多基因的表達(dá)。但是在本研究中，發(fā)現(xiàn)SPL15在鹽脅迫條件下表達(dá)量下調(diào)，而LAC12、NFYA5和UBC29在鹽脅迫條件下表達(dá)量顯著上調(diào)。遺憾的是，目前對(duì)油菜鹽度脅迫下miRNA及其作用靶點(diǎn)的研究還不夠全面。

為了鑒定miRNA 及其靶基因在油菜鹽脅迫響應(yīng)中發(fā)揮的重要作用，在本研究中，鑒定了來自油菜的數(shù)百萬個(gè)小RNA 序列，以了解鹽脅迫條件下miRNA 對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的影響。分別在200 mmol·L-1NaCl（T）和無鹽處理對(duì)照（C）條件下培養(yǎng)油菜品種中雙11，取其地上部（S）和根（R）構(gòu)建了12 個(gè)小RNA 文庫(kù)，并用Illumina 基因組分析儀對(duì)其進(jìn)行測(cè)序，從CS、TS、CR 和TR 庫(kù)中共得到198 831 780 個(gè)raw reads。進(jìn)一步對(duì)全基因組的miRNA 進(jìn)行差異表達(dá)分析，一共鑒定到了26 個(gè)差異表達(dá)的miRNA。這些差異表達(dá)的miRNA 導(dǎo)致了下游多個(gè)基因的表達(dá)發(fā)生顯著變化，并且植物對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)伴隨著一系列廣泛的細(xì)胞內(nèi)過程，包括信號(hào)感知、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)生物合成等。這說明不同的植物通過多種miRNA 介導(dǎo)的調(diào)控策略來響應(yīng)脅迫[48]，例如miR159、miR393、miR396 和miR398 等與鹽脅迫有關(guān)[49～52]。

在本研究中鑒定出miR156-SPL15、miR397-LAC12、miR169-NFYA5和miR399-UBC29在鹽脅迫條件下發(fā)揮作用。有研究表明miR156 及其靶基因SPL在植物非生物脅迫的響應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用[53]，在本研究中，miR156 特異性的在根中上調(diào)表達(dá)，這一結(jié)果與前人的研究結(jié)果形成對(duì)比，即擬南芥在鹽脅迫下miR156 的表達(dá)下調(diào)[21]，并通過調(diào)控其靶基因SPL15參與到鹽脅迫響應(yīng)中；蘋果在鹽脅迫條件下miR156的表達(dá)下調(diào)，其靶基因SPL13通過激活WRKY100，促進(jìn)與抗氧化劑生物合成，糖代謝和脯氨酸生物合成有關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)一步維持ROS和滲透平衡，從而增強(qiáng)鹽脅迫的耐受性[21]。這表明不同植物對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)存在差異[54]。miR397 及其靶基因LAC可以通過調(diào)控木質(zhì)素含量來參與非生物脅迫(58)，在本研究中，鑒定到LAC12是miR397a 的靶基因，該基因可以導(dǎo)致木質(zhì)素含量升高，進(jìn)一步改變Na+遷移途徑從而提高植物對(duì)鹽脅迫的抗性。已有研究表明，番茄和玉米根系中高濃度的NaCl均能提高LAC的轉(zhuǎn)錄水平，并指出鹽脅迫下根系轉(zhuǎn)錄水平的提高可能是植物的普遍響應(yīng)。因此，LAC可能在植物根系適應(yīng)鹽脅迫過程中發(fā)揮重要作用[55,56]。越來越多的證據(jù)表明NFY是非生物脅迫反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子[16,17,43,57～61]，并受到miR169 的調(diào)控。在本研究中miR169 家族成員miR169g 和miR169n 在根中的表達(dá)量下調(diào)，這和前人之前的研究一致，但是過表達(dá)miR396c 的水稻和擬南芥對(duì)鹽脅迫抗性都降低，而過表達(dá)miR396a/b 轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性提高。這表明同一個(gè)miRNA 家族的不同成員在不同的植物中采用不同的方式參與鹽脅迫響應(yīng)[60]。然而，鹽脅迫條件下油菜中NFY的作用還沒有被詳細(xì)研究。前人研究表明UBC[42,62]定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，是miR399 的靶基因，其表達(dá)受高鹽度或ABA 誘導(dǎo)并參與異常蛋白質(zhì)的降解過程[42]，且在鹽脅迫條件下UBC轉(zhuǎn)錄水平升高，通過調(diào)控泛素化途徑參與植物鹽脅迫抗性反應(yīng)。這表明，植物在鹽脅迫反應(yīng)中可能存在著共同的調(diào)控機(jī)制。這些結(jié)果為進(jìn)一步研究作物抵抗鹽脅迫的分子機(jī)制提供了理論依據(jù)。

4 結(jié)論

植物的耐鹽過程是復(fù)雜的，由多種因素決定，miRNA 的參與進(jìn)一步增加了這一過程的復(fù)雜性。本研究通過油菜miRNA 測(cè)序以及轉(zhuǎn)錄組組測(cè)序技術(shù)發(fā)掘鹽脅迫響應(yīng)相關(guān)的miRNA及其核心靶基因，豐富了油菜地上部和根部miRNA 的情況。共篩選出26 個(gè)與鹽脅迫應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的候選miRNA，并且同一家族的不同miRNA 表達(dá)模式有所不同。差異表達(dá)的miRNA 的靶基因顯著富集的通路不同。這些miRNA 的鑒定及其功能意義的闡明拓寬了我們對(duì)鹽脅迫反應(yīng)中轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控的理解，為探索油菜耐鹽機(jī)制提供重要的參考。