吳泳錫，張美玉，王一竹，李方彤，劉 明，戴雨霖，鄭 飛，越 皓

(長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林省人參科學(xué)研究院，吉林 長春 130117)

長白山道地藥材人參(PanaxginsengC.A.Mey.)可作藥食兩用，具有機(jī)體免疫調(diào)節(jié)作用，近年來，人參功能性食品的多元化深加工產(chǎn)品成為研究熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)室的人參冰酒以鮮人參、威代爾葡萄為原料，采用低溫發(fā)酵技術(shù)，通過鮮人參和威代爾葡萄特定比例進(jìn)行配伍，定向轉(zhuǎn)化生成Rg2、Rf、Rg3、Rg5、CK等稀有皂苷，顯著提高了生物利用度，并通過陶瓷膜過濾技術(shù)，使酒體晶瑩剔透、入口細(xì)膩圓潤、余味綿長，具有緩解疲勞、舒張血管、增強(qiáng)免疫力等作用。

Huang等[1]對中國和加拿大不同區(qū)域的冰酒進(jìn)行感官分析，通過4種方法比較香氣組分差異，發(fā)現(xiàn)中國產(chǎn)區(qū)略帶堅(jiān)果蜂蜜香氣，加拿大產(chǎn)區(qū)略帶玫瑰焦糖香氣。喬夢丹等[2]通過超高效液相色譜-四極桿靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜法(UPLC-Q-Orbitrap-HRMS)比較人參發(fā)酵前后的皂苷類化合物成分，共檢測出45種人參皂苷。Dimitrios等[3]通過核磁共振(NMR)、靶向及非靶向的LC-MS和GC-MS比較葡萄酒代謝組學(xué)特征，結(jié)果表明，NMR效果最差，而靶向GC-MS效果顯著，具有足夠的辨別代謝顯著差異的能力。

人參冰酒的香氣成分及非揮發(fā)性成分能夠反映葡萄酒的質(zhì)量及生產(chǎn)工藝等，利用LC-MS以及GC-MS研究人參冰酒的成分特點(diǎn)，對其質(zhì)量控制和技術(shù)開發(fā)具有重要意義。基于此，本文擬采用氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜(GC-QQQ-MS/MS)和UPLC-Q-Orbitrap-HRMS技術(shù)分析人參冰酒的揮發(fā)性成分、酚類和人參皂苷類成分，旨為人參冰酒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供技術(shù)支持，同時(shí)為進(jìn)一步合理開發(fā)人參冰酒提供理論支撐。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與裝置

TRACE 1310氣相色譜儀、TSQ 8000三重四極桿質(zhì)譜儀、Thermo Scientific Q-Exactive四極桿靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀、Dionex UltiMate 3000超高效液相色譜儀：美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品；BT25S型分析天平：北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 材料與試劑

人參冰酒：長春方飛生物科技有限公司產(chǎn)品；甲醇、乙腈、甲酸：均為色譜純，美國Tedia公司產(chǎn)品；超純水：由德國Milli-Q超純水系統(tǒng)制備；綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、沒食子酸、龍膽酸、槲皮素、木樨草素、表沒食子兒茶素、二氫槲皮素、人參皂苷(Re、Rf、Rd、Rb1、Rg1、F2、CK)標(biāo)準(zhǔn)品：純度>98%，上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 樣品制備

1.3.1GC-MS樣品制備 取1 mL人參冰酒，過0.45 μm微孔濾膜，密封狀態(tài)下，35 ℃水浴15 min，氣相色譜直接進(jìn)樣。

1.3.2LC-MS樣品制備 取50 mL人參冰酒，加入等量的水飽和正丁醇萃取4次，40 ℃水浴揮干溶劑，加入甲醇復(fù)溶，定容至10 mL，過0.45 μm微孔濾膜，得樣品溶液。

1.4 實(shí)驗(yàn)條件

1.4.1揮發(fā)性成分的GC-MS測定 色譜條件：DB-Heavy WAX色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度250 ℃；載氣為高純氦氣(He)，純度99.9%；流量1 mL/min；進(jìn)樣量1 μL；進(jìn)樣方式1∶20；程序升溫：初始溫度30 ℃，保持2 min，以4 ℃/min升至230 ℃，保持5 min。

質(zhì)譜條件：三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測，電子轟擊源(EI)，離子源溫度250 ℃，傳輸線溫度250 ℃，質(zhì)量掃描范圍m/z50～550。

1.4.2非揮發(fā)性成分的LC-MS測定 色譜條件：Sigma HPLC Column C18色譜柱(500 mm×3.0 mm×2.7 μm)；流動相A為0.1%甲酸水，B為乙腈；洗脫條件：0～10 min(5%B)，10～15 min(10%B)，15～18 min(15%B)，18～20 min(20%B)，20～21 min(25%B)，21～22 min(30%B)，22～25min(30%～35%B)，25～30 min(35%B)，30～35 min(40%～60%B)，35～38 min(60%～80%B)，38～40 min(80%～100%B)，40～45 min(100%B)，45～50 min(100%～5%B)，50～60 min(5%B)；流速0.2 mL/min；進(jìn)樣量5 μL；柱溫30 ℃。

質(zhì)譜條件：四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜，電噴霧離子源(ESI)正、負(fù)離子模式檢測，干燥氣溫度350 ℃，鞘氣流速4×106Pa，輔助氣流速1×106Pa，輔助氣溫度300 ℃，F(xiàn)ull scan-ddMS2掃描模式，分辨率70 000 FWHM，質(zhì)量掃描范圍m/z150～2 000。

2 結(jié)果與討論

2.1 GC-MS測定揮發(fā)性成分

根據(jù)美國國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所標(biāo)準(zhǔn)譜庫中的保留指數(shù)和質(zhì)譜信息分析揮發(fā)性成分。對已有標(biāo)樣的物質(zhì), 利用其對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線定量；對沒有標(biāo)樣的物質(zhì)，利用化學(xué)結(jié)構(gòu)、官能團(tuán)相似、碳原子數(shù)相近的標(biāo)樣香氣物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。按照峰面積歸一化法，計(jì)算各組分的相對含量。

人參冰酒的GC-MS總離子流圖示于圖1，共檢測出28種揮發(fā)性物質(zhì)，包括8種酸類、4種酯類、6種醇類、3種醛類、7種其他類，列于表1。其中，酸類物質(zhì)占揮發(fā)性總物質(zhì)數(shù)量的28.6%，是人參冰酒含量最高的風(fēng)味化合物；有15種成分的相對含量大于0.5%，為人參冰酒的主要香氣貢獻(xiàn)成分。

圖1 人參冰酒GC-MS總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of ginseng ice wine by GC-MS

表1 28種揮發(fā)性化合物的GC-MS分析Table 1 Analytical parameters of GC-MS for 28 aromatics

人參冰酒產(chǎn)生的香氣主要包括葡萄自身的香氣、發(fā)酵過程產(chǎn)生的發(fā)酵香氣和陳釀過程產(chǎn)生的香氣及橡木香氣[4]。香氣成分不僅與葡萄品種有關(guān)，還與釀酒工藝[5]、陳釀時(shí)間[6]以及貯存條件有關(guān)。

2.1.1酸類物質(zhì)分析 人參冰酒在發(fā)酵過程中，因醇的氧化或酵母代謝產(chǎn)生酸類物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)共檢測到8種酸類物質(zhì)，分別為乙酸、辛酸、曲酸、4-甲基辛酸、間苯三酚甲酸、蓖麻油酸、棕櫚酸和十五酸。乙酸具有酸味；辛酸具有奶酪、脂肪味；棕櫚酸具有香料味。其中，4-甲基辛酸含量最高，相對含量為1.20%。少量酸類物質(zhì)使香氣成分更強(qiáng)，從而提高人參冰酒的品質(zhì)。

2.1.2醇類物質(zhì)分析 醇類是人參冰酒第二大類揮發(fā)性物質(zhì)，主要由于酒精發(fā)酵與氨基酸轉(zhuǎn)化，同時(shí)也可能受到葡萄自身含糖量及pH值等影響。本實(shí)驗(yàn)共檢測到6種醇類物質(zhì)，分別為正戊醇、2,3-丁二醇、3-呋喃甲醇、丙三醇、豆蔻醇和(Z)-十八-9-烯醇，占總香氣的21.4%。其中，正戊醇具有醇香，(Z)-十八-9-烯醇的相對含量較高，為1.84%。

2.1.3酯類物質(zhì)分析 酯類物質(zhì)主要由于貯藏過程中的酯化反應(yīng)、發(fā)酵過程中產(chǎn)生以及葡萄本身的酯類成分。本實(shí)驗(yàn)共檢測出4種酯類物質(zhì)，分別為乙酸乙酯、2-糠酸甲酯、十二烷二酸二甲酯和2-氯苯基硫代異氰酸酯，占總香氣的14.3%。其中，乙酸乙酯具有果香、醋味；2-氯苯基硫代異氰酸酯的相對含量較高，為1.56%。

2.1.4醛類物質(zhì)分析 醇的氧化或酸的還原生成醛類物質(zhì)。在人參冰酒中共檢測到3種醛類物質(zhì)，分別為3-糠醛、苯丙醛和苯乙醛，占總香氣的10.7%。其中，苯乙醛具有花香氣味；3-糠醛的相對含量最高，為8.12%，具有特殊的香氣。

2.1.5醚類及其他物質(zhì)分析 在人參冰酒中只檢測出三乙二醇單丁醚1種醚類物質(zhì)，占總香氣的3.6%，相對含量為1.42%。

2.1.6其他類成分 在人參冰酒中共檢測到6種其他類成分，分別為氟乙酰胺、1,3,5-三甲基吡唑、對苯二酚、1-萘酚、間苯三酚和2-萘酚。間苯三酚含量最高，相對含量為41.31%。人參冰酒中芳香族物質(zhì)相對含量較高，主要呈花果香，同時(shí)酚類物質(zhì)對人參冰酒產(chǎn)生的苦味有影響[7]。

2.2 LC-MS測定非揮發(fā)性成分

在正、負(fù)離子模式下采集的人參冰酒總離子流圖示于圖2。在負(fù)離子模式下，共鑒定出19種多酚類和28種皂苷類成分，列于表2。其中，酚酸類成分包括有機(jī)酸類、類黃酮類和其他類成分。在正離子模式下，共鑒定出5種多酚類成分，列于表3。

圖2 人參冰酒LC-MS正(a)、負(fù)(b)離子模式下的總離子流圖Fig.2 Total ion chromatograms of ginseng ice wine in positive (a) and negative (b) ion modes of LC-MS

2.2.1多酚類物質(zhì)分析 有機(jī)酸類物質(zhì)分析：從人參冰酒中共鑒定出12種有機(jī)酸及其衍生物，在負(fù)離子模式下多以[M-H]-的形式存在。以化合物16為例，可檢測到m/z353.100 9 [M-H]-準(zhǔn)分子離子峰，碎片離子m/z191.466 5[M-H-H2O]-為脫去咖啡?；?，碎片離子m/z173.044 5為脫去1分子H2O生成。通過與標(biāo)準(zhǔn)品對比保留時(shí)間、碎片離子的種類和豐度，推斷化合物16為綠原酸，裂解規(guī)律示于圖3。同理，在負(fù)離子模式下鑒定出化合物1、2、3、4、5、6、7、14分別為原兒茶酸、龍膽酸、對香豆酸、沒食子酸、丁香酸、香草酸、阿魏酸乙酯、阿魏酸；化合物15、17為化合物16的同分異構(gòu)體，具有與其相同的裂解途徑，通過與標(biāo)準(zhǔn)品比對，確定其分別為新綠原酸和隱綠原酸。在正離子模式下鑒定出化合物2為咖啡酰葡萄糖。

圖3 綠原酸的裂解途徑Fig.3 Fragmentation pathway of chlorogenic acid

黃酮苷元是多酚羥基化合物，具有微酸性，負(fù)離子模式下準(zhǔn)分子離子[M-H]-豐度較高，一級質(zhì)譜中碎片離子較少，有助于推斷其分子質(zhì)量。黃酮苷元在ESI-MS2譜中表現(xiàn)為丟失中性碎片CO(28 u)、H2O(18 u)、CO2(44 u)，通過這些特征可判斷其官能團(tuán)取代情況，快速辨別同分異構(gòu)體結(jié)構(gòu)。當(dāng)黃酮結(jié)構(gòu)中羥基取代數(shù)目逐漸增多時(shí)，串聯(lián)質(zhì)譜中產(chǎn)生的碎片離子增多。黃酮醇苷元更易產(chǎn)生C環(huán)開環(huán)離子，而二氫黃酮苷元一般不丟失CO。同樣，在黃酮類化合物中，3-O位與7-O位容易形成糖苷鍵，二級質(zhì)譜中出現(xiàn)糖苷鍵均裂產(chǎn)物。

黃酮類物質(zhì)分析：以化合物19為例，在負(fù)離子模式下其準(zhǔn)分子離子峰為m/z285.040 9[M-H]-，通過與標(biāo)準(zhǔn)品比對，可知木樨草素的準(zhǔn)分子離子為m/z285.039 4[M-H]-。碎片離子m/z267.072 7為木樨草素脫去1分子H2O形成；碎片離子m/z257.176 2為木樨草素脫去1分子羰基形成；碎片離子m/z175.958 8為木樨草素B環(huán)碎裂形成，其裂解規(guī)律示于圖4。同理，可推斷化合物13為葒草素。

圖4 木樨草素的裂解途徑Fig.4 Fragmentation pathway of luteolin

黃酮醇類物質(zhì)分析：以化合物18為例，負(fù)離子模式下其準(zhǔn)分子離子峰為m/z301.035 6[M-H]-，通過與標(biāo)準(zhǔn)品對比，可知槲皮素的準(zhǔn)分子離子峰為m/z301.034 3[M-H]-。碎片離子m/z273.170 9為槲皮素脫去1分子羰基得到；碎片離子m/z151.039 0由黃酮類化合物最常見的RDA斷裂形成。同理，可推斷化合物9、12分別為槲皮素-3-O-葡萄糖苷酸和金絲桃苷。

黃烷醇類物質(zhì)分析：以化合物10為例，負(fù)離子模式下其準(zhǔn)分子離子峰為m/z305.064 6[M-H]-，通過與標(biāo)準(zhǔn)品對比，可知表沒食子兒茶素的準(zhǔn)分子離子峰為m/z305.066 7[M-H]-。碎片離子m/z261.134 6為表沒食子兒茶素脫去1分子CO2得到；碎片離子m/z219.050 7為表沒食子兒茶素裂解脫去C2H2O后得到。通過與標(biāo)準(zhǔn)品比對碎片離子信息和保留時(shí)間，可推斷化合物10為表沒食子兒茶素，其裂解規(guī)律示于圖5。同理，在正離子模式下，推斷化合物5為原花青素四聚體。

圖5 表沒食子兒茶素的裂解途徑Fig.5 Fragmentation pathway of epigallocatechin

二氫黃酮類物質(zhì)分析：以化合物8為例，負(fù)離子模式下其準(zhǔn)分子離子峰為m/z303.051 2[M-H]-，通過與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對比，可知二氫槲皮素的準(zhǔn)分子離子峰為m/z303.051 0[M-H]-。碎片離子m/z285.134 6[M-H-H2O]-為二氫槲皮素脫去1分子H2O產(chǎn)生；碎片離子m/z275.058 2[M-H-CO]-為二氫槲皮素脫去1分子CO產(chǎn)生；碎片離子m/z259.118 8[M-H-CO2]-為二氫槲皮素脫去1分子CO2產(chǎn)生。通過與標(biāo)準(zhǔn)品比對碎片離子信息并參考文獻(xiàn)[8]，可推斷化合物8為二氫槲皮素。同理，在正離子模式下，可推斷化合物4為二氫山奈酚-3-O-葡萄糖苷。

花色素類物質(zhì)分析：在正離子模式下，花色素類成分通常較不穩(wěn)定，易受光照或pH值改變而降解，通常以花色素C環(huán)上C3位羥基糖苷化的形式表現(xiàn)。結(jié)合保留時(shí)間及碎片離子信息并參考文獻(xiàn)[9]，推斷正離子模式下化合物3為二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷。

非黃酮類物質(zhì)分析：在負(fù)離子模式下，通過查閱文獻(xiàn)[10]發(fā)現(xiàn)，醛類化合物的基本裂解規(guī)律是以從醛基上脫去CO自由基為主，與羧酸類化合物的結(jié)構(gòu)相近。以化合物11為例，負(fù)離子模式下其準(zhǔn)分子離子峰為m/z181.049 83 [M-H]-，二級質(zhì)譜下可檢測到m/z166、153碎片離子，分別是由其母離子丟失中性碎片CH3、CO產(chǎn)生，因此，推測化合物11為丁香醛。在正離子模式下，化合物1的準(zhǔn)分子離子峰為m/z229.068 5[M+H]+，二級質(zhì)譜下可檢測到m/z187碎片離子，是其母離子于苯環(huán)上2、3位和4、5位之間發(fā)生鍵斷裂丟失中性碎片C2H2O產(chǎn)生；m/z145碎片離子為m/z187離子繼續(xù)丟失1分子C2H2O得到。因此，推斷化合物1為白藜蘆醇。

人參冰酒的顏色受花色苷的B環(huán)取代基影響。在酸性條件下，當(dāng)羥基增加時(shí)顏色變紅，甲氧基增加時(shí)顏色變紫；咖啡酸對人參冰酒的顏色有一定影響[11]；酚酸成分是人參冰酒非揮發(fā)性物質(zhì)的重要組成成分，是調(diào)節(jié)香氣的重要基礎(chǔ)[12]，對人參冰酒整體感官有很大的貢獻(xiàn)。

已鑒定的多酚類物質(zhì)中，白藜蘆醇可以改善血管彈性[13]，對骨損傷具有保護(hù)作用[14]；木樨草素具有抗炎[15]、抗腫瘤[16]；表沒食子兒茶素對乳腺癌產(chǎn)生抑制作用[17-18]；綠原酸可預(yù)防糖尿病[19-20]。多酚類化合物是人參冰酒潛在的活性物質(zhì)基礎(chǔ)，其活性機(jī)制需進(jìn)一步研究。

2.2.2皂苷類物質(zhì)分析 在人參冰酒中共檢測出28種皂苷成分，負(fù)離子模式下皂苷主要以[M-H]-形式存在[21]。以化合物28為例，其碎片離子m/z845.493 5 [M+COOH]-為與流動相甲酸根結(jié)合而成；準(zhǔn)分子離子m/z799.484 3[M-H]-、碎片離子m/z637.430 5和m/z475.376 6為位于C6位糖苷鍵相繼裂解得到；碎片離子m/z391.898 2為三醇型皂苷母核脫去C20位烴基側(cè)鏈而成。通過標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間以及裂解規(guī)律可確定化合物28為人參皂苷Rf，其二級質(zhì)譜圖示于圖6a，裂解途徑示于圖7?；衔?7與人參皂苷Rf的一級質(zhì)譜碎片離子m/z845.493 5 [M+COOH]-一致，在二級質(zhì)譜下，兩者均產(chǎn)生碎片離子m/z475和637。人參皂苷Rf在C6位裂解2個(gè)糖苷鍵，在25 eV轟擊下，m/z475碎片離子豐度高于m/z637，證明人參皂苷Rf與C6位相連接的糖苷鍵較與葡萄糖相連接的糖苷鍵更容易碎裂；在50 eV轟擊下，化合物27產(chǎn)生m/z475碎片離子，說明化合物27在C6位和C20位分別連接1個(gè)葡萄糖，推測為人參皂苷Rg1。經(jīng)與對照品比對并結(jié)合保留時(shí)間，確認(rèn)化合物27為人參皂苷Rg1。

圖6 人參皂苷Rf(a)，Rg3(b)，Ro(c)的二級質(zhì)譜圖Fig.6 MS/MS spectra of ginsenoside Rf (a), Rg3 (b), Ro (c)

圖7 人參皂苷Rf的裂解途徑Fig.7 Fragmentation pathway of ginsenoside Rf

其他人參皂苷均有相似的裂解規(guī)律，通過參考文獻(xiàn)[21]，同時(shí)結(jié)合分子質(zhì)量信息、中性碎片丟失和相對應(yīng)的中性皂苷碎裂規(guī)律，得到化合物20～27、29～47分別為Re5、Rh6、20(S)-Rf3、F3、C-Y1、C-Y2、F1、Rg1、Noto R2、Rg2、Rh1、20(R)Rg2、20(R)Rh1、Ro、20(S)Rf2、Rc、Re、Rg7、F2、F4、Rh4/Rk3、Rg3、20(R)Rg3、Rk1、Rg5、Rh2、CK。人參皂苷Rg3、Ro的二級質(zhì)譜圖示于圖6b,6c。人參皂苷Rg3對乳腺癌有抑制作用[22]；Rh2具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫作用[23-24]；Re可緩解心臟衰竭[25]；F2可調(diào)節(jié)酒精性肝損傷[26]；CK可抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖[27]。

葡萄酒發(fā)酵過程為人參皂苷提供了酸性條件及糖類轉(zhuǎn)化，進(jìn)一步促進(jìn)糖苷鍵斷裂，使人參皂苷轉(zhuǎn)化成稀有人參皂苷，同時(shí)部分稀有人參皂苷呈現(xiàn)出20(R),20(S)構(gòu)型。稀有皂苷更利于人體吸收，提高生物利用度，同時(shí)具有較強(qiáng)的藥理活性[28]。

3 結(jié)論

本研究利用UPLC-Q-Orbitrap-HRMS高分辨、定性準(zhǔn)確的特點(diǎn)，鑒定了人參冰酒中24種多酚類物質(zhì)和28種皂苷類成分，對人參冰酒中28種揮發(fā)性成分進(jìn)行了鑒定及含量測定，并總結(jié)了化合物的裂解規(guī)律。該方法可為研究人參冰酒的化學(xué)成分提供快速、準(zhǔn)確的方法，為人參冰酒的質(zhì)量評價(jià)和進(jìn)一步開發(fā)提供理論依據(jù)。