蒲 玲，胡子峰，李 萌，朱佳奇，丁傳凡

(1.上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗技術(shù)研究院，上海 201114；2.寧波大學材料科學與化學工程學院，質(zhì)譜技術(shù)與應用研究院，浙江 寧波 315211)

在生物分子體系中非共價作用普遍存在，是構(gòu)成分子識別的基礎(chǔ)[1]。通過非共價作用可以形成復雜的超分子體系，因此從分子水平上深入理解分子間相互作用具有重要的理論意義和現(xiàn)實的應用價值[2]。利用分析檢測技術(shù)獲取非共價復合物的結(jié)構(gòu)信息[3-4]，如結(jié)合類型、結(jié)合比、結(jié)合強度、結(jié)合位點、結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化等是研究超分子的關(guān)鍵問題之一。

目前，研究非共價復合物的方法主要有光譜法[5-6]、色譜法[7]、超離心技術(shù)以及核磁共振(NMR)、X-射線晶體衍射法等。質(zhì)譜因靈敏度高、能檢測大分子質(zhì)量物質(zhì)，且樣品用量少、圖譜信息豐富等特點，可用于研究生物分子[8-9]，使其在非共價復合物研究中起著重要作用[10-15]。電噴霧電離(ESI)過程極其溫和，可對極性大分子通過脫除溶劑并離子化成氣相完整離子，而極少發(fā)生碎裂[16-17]，在氣相條件下仍能保持非共價結(jié)合。用電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)可以容易地獲得非共價復合物的化學計量、親和力以及結(jié)合性質(zhì)，只要控制好ESI條件，便可以用ESI-MS探索更多類型的非共價復合物[13,15,18-19]。

各種復雜生物分子高級結(jié)構(gòu)的形成和功能發(fā)揮都是不同弱相互作用力協(xié)同作用的結(jié)果[20]，如DNA和RNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)、多肽和蛋白質(zhì)的二級及高級結(jié)構(gòu)、生物膜的形成與穩(wěn)定、酶的高級結(jié)構(gòu)與功能發(fā)揮等，而且在生物分子的高級結(jié)構(gòu)中二硫鍵有著非常重要的作用[21]。蛋白質(zhì)的性質(zhì)和功能由三維構(gòu)象及折疊狀態(tài)決定，要深入了解蛋白質(zhì)的生物活性必須要研究蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，而作為組成蛋白質(zhì)單位的多肽鏈之間的相互作用，可以為研究蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)提供幫助[22-23]。

本工作以X-射線晶體衍射的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)作為多肽序列的來源[24]，計算多肽間的空間距離。當距離小于閾值，則假定2個多肽之間有相互作用，人工合成假定有相互作用的多肽，并用ESI-MS研究多肽之間相互作用的情況。通過改變肽鏈的長度和肽鏈氨基酸序列來研究巰基、疏水作用和氫鍵對多肽非共價作用的影響。

1 實驗部分

1.1 儀器與裝置

LCQ型電噴霧離子阱質(zhì)譜儀：美國Finnigan公司產(chǎn)品，配有電噴霧電離源、TSP AS3000自動進樣器、Xcalibur數(shù)據(jù)分析軟件。

1.2 材料和試劑

多肽(五肽和九肽)：上海吉爾化學公司產(chǎn)品，詳情列于表1。甲醇、乙腈、醋酸：均為分析純，國藥集團公司產(chǎn)品。

表1 多肽信息表Table 1 Information of peptides

1.3 實驗條件

1.3.1質(zhì)譜條件 電噴霧離子源；噴霧電壓4 kV；毛細管溫度200 ℃；毛細管電壓20～50 V(實測值1～10 V)；套管透鏡補償電壓0～5 V；透鏡電壓-16 V；多路直流電壓1：3 V；多路直流電壓2：-7 V；多路射頻電壓幅值400。

1.3.2進樣器條件 進樣速度3 μL/min。

1.4 樣品制備

按照表2將多肽A、B以摩爾比1∶1混合，混合后單個肽的濃度均為2×10-5mol/L，混合溶液在室溫下放置反應12 h后，用電噴霧電離離子阱質(zhì)譜儀(LCQ型)分析樣品。

表2 多肽混合作用組合表Table 2 Combination of peptide mixtures

2 結(jié)果和討論

2.1 多肽間作用質(zhì)譜圖

五肽AK-5與ED-5混合作用后，無非共價復合物質(zhì)譜信號，表明未形成非共價復合物，示于圖1a。Ⅱ-5與IP-5相互作用得到較強的非共價復合物質(zhì)譜信號，示于圖1b。

注：a.AK-5與ED-5；b.Ⅱ-5與IP-5圖1 改變五肽序列前，五肽-五肽混合溶液質(zhì)譜圖Fig.1 MS spectra of pentapeptide-pentapeptide mixtures before the sequence changed

改變五肽的氨基酸序列，研究巰基、疏水作用和氫鍵對五肽相互作用的影響。AK-5(Ala-Val-Ile-Phe-Lys)序列不變，用不含巰基側(cè)鏈的異亮氨酸Ile替換ED-5(Glu-Ile-Cys-Ala-Asp)中含巰基側(cè)鏈的半胖氨酸Cys，氨基酸序列變?yōu)镋D′-5(Glu-Ile-Ile-Ala-Asp)，AK-5與ED′-5混合作用，研究其質(zhì)譜行為。Ⅱ-5序列不變，用側(cè)鏈只有H原子的甘氨酸Gly分別替換IP-5(Ile-Phe-Thr-Thr-Pro)中的苯丙氨酸Phe和蘇氨酸Thr，替換氨基酸后的五肽序列分別為IP′-5(Ile-Gly-Thr-Thr-Pro)和IP″-5(Ile-Phe-Gly-Thr-Pro)，Ⅱ-5分別與IP′-5和IP″-5混合作用，研究2組五肽相互作用的質(zhì)譜表現(xiàn)。肽鏈序列改變前后，五肽分子的結(jié)構(gòu)式示于圖2。

改變序列后，AK-5與ED′-5、Ⅱ-5與IP′-5、Ⅱ-5與IP″-5混合溶液的質(zhì)譜圖分別示于圖3a、3b、3c。

增加肽鏈中羥基和疏水基團，研究肽鏈加長對多肽相互作用的影響，加長肽鏈前后多肽分子的結(jié)構(gòu)式示于圖4。增長肽鏈后，五肽與九肽混合作用后的質(zhì)譜圖示于圖5。其中，AK-5與ED′-9、AK′-9與ED-5混合溶液的質(zhì)譜圖分別示于圖5a、5b，均未得到非共價復合物的質(zhì)譜峰。

圖4 肽鏈增長前后，多肽結(jié)構(gòu)式Fig.4 Structures of polypeptides before and after the peptide chain lengthened

注：a.AK-5與ED-9；b.AK-9與ED-5圖5 五肽-九肽混合溶液質(zhì)譜圖Fig.5 MS spectra of pentapeptide-nonapeptide mixtures

2.2 反應產(chǎn)率計算

2個多肽之間的相互作用可以描述為A+B→AB，反應產(chǎn)率[25]由式(1)計算：

(1)

其中，Icomplex和Ipeptide 1分別為復合物和其中1個多肽的質(zhì)譜強度，本文計算Ipeptide 1時選擇質(zhì)譜強度較強的多肽信號，結(jié)果列于表3。

表3 肽-肽相互作用生成復合物的產(chǎn)率Table 3 Productivity of peptide-peptide complexes

根據(jù)質(zhì)譜數(shù)據(jù)計算得到的產(chǎn)率可用來定性判斷任意2個多肽間相互作用的強弱。其中，AK-5與ED-5無非共價結(jié)合，將ED-5序列改為ED′-5后，與AK-5非共價作用增強，分別將AK-5和ED-5增長為九肽AK-9和ED-9，五肽與九肽(AK-5與ED-9，AK-9與ED-5)非共價結(jié)合無明顯增強。Ⅱ-5與IP-5之間的作用最強，改變IP-5序列后，IP′-5與Ⅱ-5、IP″-5與Ⅱ-5相互作用較IP-5與Ⅱ-5的非共價作用均減弱。

2.3 實驗結(jié)果分析

在質(zhì)譜數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)，ED-5容易形成2分子自我結(jié)合的一價質(zhì)譜峰或二價質(zhì)譜峰，示于圖6。ED-5的結(jié)構(gòu)(如圖2)中帶有1個巰基，2個ED-5分子中的巰基容易相互作用形成二硫鍵。

圖6 ED-5一價峰(a)和二價峰(b)的質(zhì)譜圖Fig.6 MS spectra of monovalent (a) and bivalent (b) peak of ED-5

AK-5與ED-5混合后無相互作用，將ED-5(Glu-Ile-Cys-Ala-Asp)中的極性氨基酸半胱氨酸Cys換成疏水氨基酸異亮氨酸Ile后形成ED′-5(Glu-Ile-Ile-Ala-Asp)，AK-5與ED′-5之間的作用加強，產(chǎn)率明顯增大。一方面是由于替換了ED-5中帶有巰基的半胱氨酸Cys，ED-5本身不能再相互作用形成二硫鍵二聚物，有足夠的游離氨基酸與AK-5相互作用形成復合物；另一方面是由于替換為疏水的氨基酸，加強了多肽之間的疏水作用，更有利于非共價復合物的形成。

通過增加五肽AK-5和ED-5肽鏈的長度研究加長肽鏈對多肽相互作用的影響。肽鏈加長后，多肽分子間的氫鍵作用和疏水作用都相應增強，但五肽和九肽非共價復合物的質(zhì)譜信號無明顯增強，表明巰基的阻礙作用強于加長肽鏈帶來的疏水和氫鍵的增強作用。這是因為多肽結(jié)構(gòu)中巰基的存在阻礙多肽間的相互作用，同時含巰基側(cè)鏈的肽鏈本身更容易形成二價峰，電荷的增多會抑制多肽間接近形成復合物，增強多肽分子間的氫鍵和疏水作用后，巰基的阻礙作用仍占主要地位，五肽與九肽之間的非共價作用并無明顯增強。

五肽Ⅱ-5和IP-5之間的作用較強，因此通過改變IP-5氨基酸序列來研究疏水側(cè)鏈和氫鍵對多肽相互作用的影響。如表3所示，五肽Ⅱ-5和IP-5相互作用的產(chǎn)率約為7.6%。Ⅱ-5序列不改變，改變IP-5(Ile-Phe-Thr-Thr-Pro)的序列為IP′-5(Ile-Gly-Thr-Thr-Pro)和IP″-5(Ile-Phe-Gly-Thr-Pro)，Ⅱ-5分別與IP′-5、IP″-5混合作用。Ⅱ-5和IP′-5相互作用的產(chǎn)率約為2.4%，實驗結(jié)果表明，將五肽IP-5第2位氨基酸由側(cè)鏈為氫原子的甘氨酸Gly替代疏水的苯丙氨酸Phe后，多肽結(jié)合的產(chǎn)率減小，肽-肽相互作用的結(jié)合強度變?nèi)酰砻魇杷饔媚茉鰪姸嚯拈g的非共價作用。Ⅱ-5和IP″-5相互作用的產(chǎn)率約為2.9%，IP-5第3位氨基酸由甘氨酸Gly替代帶羥基的蘇氨酸Thr后，IP″-5與Ⅱ-5的氫鍵作用弱于IP-5與Ⅱ-5的氫鍵作用，Ⅱ-5和IP″-5非共價結(jié)合減弱，表明氫鍵能增強多肽間的非共價作用。以上實驗結(jié)果表明，疏水作用和氫鍵在非共價作用中起著非常重要的作用，將疏水支鏈和帶羥基的支鏈替換成氫原子后，多肽間相互作用明顯減弱。

3 結(jié)論

在多肽相互作用中，利用ESI-MS能夠研究多肽相互作用的強弱。結(jié)果表明，多肽中如果存在含有巰基側(cè)鏈的氨基酸，則傾向于自身相互作用形成二硫鍵結(jié)合在一起，阻礙含巰基多肽與其他分子相互作用形成復合物。多肽中含有疏水側(cè)鏈和羥基側(cè)鏈會形成氫鍵和疏水作用，從而增強多肽間的非共價作用，對多肽間的相互作用影響很大；將疏水側(cè)鏈和羥基側(cè)鏈分別用H原子替代后，多肽間的相互作用明顯減弱。利用ESI-MS能夠快速分析生物分子間的作用力，定性判斷它們之間的結(jié)合強度，通過改變多肽分子的結(jié)構(gòu)，研究多肽分子間非共價作用的影響因素，為研究生物大分子高級結(jié)構(gòu)和分子間的相互作用提供幫助。