胡艷梅，周姍娜，喬琦茗，李華南，江正兵

(湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，省部共建生物催化與酶工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 湖北 武漢 430062)

0 引言

目前世界范圍內(nèi)化石燃料的迅速枯竭，造成了一種緊迫的局面，需要一種潛在的替代品來克服目前的能源危機(jī).木質(zhì)纖維素生物質(zhì)由于其巨大的可獲得性、廉價(jià)和可再生的特性而成為工業(yè)規(guī)模開發(fā)的合理候選者.利用木質(zhì)纖維素生物質(zhì)來生產(chǎn)生物燃料和其他有價(jià)值的化學(xué)品是一種利潤(rùn)豐厚、可持續(xù)和有前景的方法[1-2].而纖維素酶的酶促水解可以將木質(zhì)纖維素水解為可發(fā)酵的糖，是將木質(zhì)纖維素生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為有價(jià)值的產(chǎn)品的前提.纖維素酶的高成本是限制酶水解的主要因素，因此需要纖維素酶具有較高的催化活性，從而實(shí)現(xiàn)纖維素材料的高效水解過程[3-4].纖維素酶是由各種微生物產(chǎn)生的，包括細(xì)菌、真菌和放線菌.纖維素酶是通過水解β-1,4-糖苷鍵來分解纖維素的酶類，根據(jù)其作用方式可以分為3大類：內(nèi)切葡聚糖酶(EG)、外切葡聚糖酶(CBH)和β-葡萄糖苷酶(BG)[5].

大多數(shù)的真菌纖維素酶，特別是外切葡聚糖酶具有模塊化的結(jié)構(gòu)，包括催化結(jié)構(gòu)域(CD)和碳水化合物結(jié)合域(CBM)，兩者之間通過高度糖基化的柔性接頭連接[6].CBM是具有自主折疊和熟練識(shí)別異質(zhì)復(fù)雜碳水化合物排列的輔助域，它可能存在于生命的任何領(lǐng)域，主要存在于識(shí)別多糖的蛋白質(zhì)中[7].它以單個(gè)或多個(gè)域的形式存在于蛋白質(zhì)的催化結(jié)構(gòu)域的C端或者是N端，只具有結(jié)合能力不具有催化活性.碳水化合物結(jié)合域一般含有30～200個(gè)氨基酸，大小為20～40 kD[8].根據(jù)其氨基酸序列的相似性，可以將其劃分為為88個(gè)家族.根據(jù)其配體結(jié)合位點(diǎn)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與它們識(shí)別的配體的種類，可以將碳水化合物結(jié)合域劃分為3種類型：A型、B型和C型[9].A型CBM具有有芳香族殘基組成的平坦或平臺(tái)疏水狀表面，A型CBM的結(jié)合位點(diǎn)的平面構(gòu)象與結(jié)晶多糖如纖維素的平面相互作用，識(shí)別并結(jié)合結(jié)晶多糖.與A型CBM相反，B型CBM結(jié)合非晶態(tài)纖維素或木聚糖，其結(jié)合位點(diǎn)結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出芳香族殘基與自由單鏈多糖作用的裂縫排列.C型CBM由于結(jié)合位點(diǎn)的空間位阻，他們只能結(jié)合單糖、二糖或三糖[10].文獻(xiàn)表明CBM的主要功能是識(shí)別并特異性地結(jié)合不溶性的纖維素，將纖維素酶的催化結(jié)構(gòu)域靶向纖維素底物，從而增加纖維素酶對(duì)底物的親和性和水解活性[11].目前CBM促進(jìn)纖維素酶水解的機(jī)制尚未完全明確，推測(cè)CBM通過兩種可能的機(jī)制增強(qiáng)纖維素酶對(duì)不溶性底物的催化活性：CBM能夠增加纖維素酶對(duì)底物的可及性，從而增加底物上的有效酶濃度，導(dǎo)致催化速率的增加[12]；CBM破壞了底物的晶體結(jié)構(gòu)，暴露出更多的纖維素酶結(jié)合表面，從而促進(jìn)酶與更多可用底物分子的接觸[13].基于CBM這樣的功能，將不同的CBM與纖維素酶的催化結(jié)構(gòu)域融合開發(fā)嵌合酶是改善酶的水解效率的有效方法.在多項(xiàng)研究中，嵌合酶已被證實(shí)可以改善催化效率、熱穩(wěn)定性及底物特異性[14-15].

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒、試劑大腸桿菌克隆菌株E.coliDH5α和E.coli. XL10-Gold均為本實(shí)驗(yàn)室保存；畢赤酵母(Pichiapastoris)表達(dá)菌株X33和表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA均購買自湖南豐暉生物科技有限公司.pINA1297-CBH和pET-23a-CBM3質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室保存.DNA聚合酶Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司、T5核酸外切酶及限制性核酸內(nèi)切酶等都購買自Takara和NEB代理商武漢友名生物技術(shù)有限公司；所有的化學(xué)試劑均購買自Sigma-Aldrich公司和國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司.磷酸膨脹纖維素(P-Avicel)為本實(shí)驗(yàn)室制備.

1.2 方法

1.2.1 表達(dá)載體的構(gòu)建 以pINA1297-CBH質(zhì)粒為模板，通過引物CBH-F和CBH-R擴(kuò)增出CBH基因；以pPICZαA質(zhì)粒為模板，通過引物來反擴(kuò)載體pPICZαA，擴(kuò)增引物如表1所示.將擴(kuò)增的CBH片段與pPICZαA載體用DpnI消化，再用T5核酸外切酶進(jìn)行消化，以獲得重組表達(dá)載體pPICZαA-CBH.

表1 引物序列

以pET-23a-CBM3質(zhì)粒為模板，通過相應(yīng)的引物將CBM3片段擴(kuò)增下來；再通過相應(yīng)的引物進(jìn)行重疊延伸PCR，擴(kuò)增出片段CBM3+CBH.再將擴(kuò)增的CBM3+CBH片段與反擴(kuò)的pPICZαA載體分別DpnI進(jìn)行消化，再用T5核酸外切酶進(jìn)行消化，以獲得重組表達(dá)載體pPICZαA-CBM3-CBH.

1.2.2 酶的表達(dá)與純化 畢赤酵母菌株X33用于克隆基因的表達(dá).將活化的畢赤酵母重組菌株接種到BMGY培養(yǎng)基進(jìn)行二次活化，再轉(zhuǎn)接到BMMY培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá).每隔24 h向BMMY液體培養(yǎng)基中加入0.8%的甲醇誘導(dǎo)，連續(xù)誘導(dǎo)5 d.誘導(dǎo)完成后將菌液上清用塞多利斯超濾膜包(購自德國塞多利斯股份公司)進(jìn)行濃縮，將濃縮的上清用Ni柱進(jìn)行純化.將純化的蛋白用12% (w/w) SDS-PAGE進(jìn)行分析.

1.2.3 結(jié)合實(shí)驗(yàn)分析 CBH、CBM3-CBH對(duì)Avicel結(jié)合能力的測(cè)定.將適量的重組蛋白與50 mg Avicel和磷酸鹽緩沖液(pH 7)置于離心管中，充分混合，使最終體積為1 mL，蛋白的初始濃度為0.5 mol/L.置于圓周搖床上于4 ℃孵育1 h.孵育后在12 000 r/min離心5 min，測(cè)定上清的蛋白濃度.比較結(jié)合前后蛋白濃度的差值，分析酶對(duì)Avicel的結(jié)合能力.

1.2.4 酶活性的分析 外切葡聚糖酶的酶活性由3,5-二硝基水楊酸(DNS)法測(cè)定，使用濾紙(FP)、玉米秸稈(CS)、羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)、微晶纖維素(Avicel)和預(yù)處理的微晶纖維素(P-Avicel)作為底物.將50 μL純化的酶液(CBH、CBM3-CBH)和450 μL的0.1 mol/L的檸檬酸鹽緩沖液加入到含有底物的1.5 mL的離心管中，充分混合.將混合物置于55 ℃水浴鍋中反應(yīng)10 min，反應(yīng)后立即取出，放入100 ℃沸水浴中處理10 min滅活.12 000 r/min離心5 min，取上清與DNS于100 ℃反應(yīng)10 min，置于冰上冷卻至室溫，然后測(cè)定OD540處的吸光值.酶活單位(U)的定義為每分鐘反應(yīng)生成1 μmol還原糖所需要酶的量.

1.2.5 溫度和pH對(duì)酶活性的影響 為了研究pH對(duì)外切葡聚糖酶活性的影響，反應(yīng)在不同pH值下進(jìn)行(pH 3～6, 0.1 mol/L檸檬酸鹽緩沖液; pH 7～8， 0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液; pH 9～11， 0.1 mol/L的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液)，在60 ℃下使用50 mg的Avicel作為底物.為了研究溫度對(duì)纖維素酶活性的影響，反應(yīng)在不同的溫度梯度下進(jìn)行(35～75 ℃)，在pH為6的0.1 mol/L檸檬酸鹽緩沖液中，使用50 mg的Avicel作為底物.

2 結(jié)果分析

2.1 酶的表達(dá)與純化外切葡聚糖酶CBH及其融合酶CBM3-CBH在畢赤酵母X33中成功表達(dá)(圖1)，根據(jù)分子量估計(jì)純化的CBH和CBM3-CBH大小分別是56.5 kD和77 kD.通過SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示CBH和CBM3-CBH的目的條帶均與預(yù)期大小相符(圖2).

圖1 CBM3與CBH融合結(jié)構(gòu)示意圖

M：蛋白分子標(biāo)準(zhǔn)；1：X33空白對(duì)照；2：純化的CBH；3：純化的CBM3-CBH圖2 SDS-PAGE分析純化的酶

2.2 外源的CBM對(duì)外切葡聚糖酶催化活性的影響分析比較了外切葡聚糖酶融合酶CBM3-CBH和天然外切葡聚糖酶CBH對(duì)FP、CS、CMC-Na、Avicel和P-Avicel這幾種底物的催化活性，探究外源的碳水化合物結(jié)合域?qū)ν馇衅暇厶敲复呋钚缘挠绊?圖3).結(jié)果表明，CBH和CBM3-CBH對(duì)FP和CS無活性，對(duì)CMC-Na有比較微弱的活性，對(duì)Avicel有較高的活性，對(duì)P-Avicel的活性最高.CBH和CBM3-CBH對(duì)于CMC-Na的活性分別為0.138 U/mL和0.137 U/mL；對(duì)于Avicel的活性分別為1.19 U/mL和1.11 U/mL；對(duì)P-Avicel的活性分別為3.23 U/mL和3.25 U/mL.從上述數(shù)據(jù)可以看出CBM3-CBH和CBH兩者對(duì)不同底物的催化活性無顯著差異，說明融合外源的碳水化合物結(jié)合域?qū)μ烊煌馇衅暇厶敲窩BH的催化活性無實(shí)質(zhì)性影響.

圖3 外切葡聚糖酶及其融合酶對(duì)不同底物的催化活性

2.3 外源的CBM對(duì)外切葡聚糖酶底物結(jié)合能力的影響分析比較了外切葡聚糖酶融合酶CBM3-CBH和天然外切葡聚糖酶CBH對(duì)Avicel的結(jié)合能力，探究外源的碳水化合物結(jié)合域?qū)ν馇衅暇厶敲傅孜锝Y(jié)合能力的影響(圖4).經(jīng)3次平行試驗(yàn)結(jié)果分析，CBH和CBM3-CBH與Avicel結(jié)合前后蛋白濃度的差值分別為0.32 mg/mL和0.348 mg/mL，CBM3-CBH對(duì)Avicel的結(jié)合能力比CBH高約8%，說明外源的碳水化合物結(jié)合域能夠在一定程度上提高外切葡聚糖酶對(duì)底物的結(jié)合能力.

圖4 外切葡聚糖酶及其融合酶對(duì)Avicel的結(jié)合

2.4 外源的CBM對(duì)外切葡聚糖酶最適反應(yīng)溫度及pH的影響分析比較了外切葡聚糖酶融合酶CBM3-CBH和天然外切葡聚糖酶CBH的最適反應(yīng)溫度和最適反應(yīng)pH，探究外源的碳水化合物結(jié)合域?qū)ν馇衅暇厶敲缸钸m反應(yīng)溫度及pH的影響.結(jié)果表明，CBH和CBM3-CBH適宜的pH范圍均為5～7，最適反應(yīng)pH均為6，當(dāng)pH高于7時(shí)，酶活力下降的很快，當(dāng)pH為10時(shí)，酶活力僅為最適pH的20%左右(圖5A).從CBH和CBM3-CBH兩者適宜的溫度范圍都是50～65 ℃，最適反應(yīng)溫度都是60 ℃，當(dāng)反應(yīng)溫度高于65 ℃時(shí)，酶活力顯著下降，反應(yīng)溫度為80 ℃時(shí)，酶活力僅為最適反應(yīng)溫度的20%(圖5B).說明外源的碳水化合物結(jié)合域不影響外切葡聚糖酶的最適反應(yīng)溫度與最適反應(yīng)pH，也不影響其適宜的反應(yīng)溫度范圍與pH范圍.

圖5 外切葡聚糖酶及其融合酶的最適反應(yīng)溫度和pH

3 討論

居多研究表明，通過CBM與不同的糖苷水解酶(如脂酶、纖維素酶、木聚糖酶等)的融合，可以促進(jìn)酶與底物的結(jié)合，提高酶的催化效率，從而促進(jìn)酶的水解[16-17].在我們的研究中，探究了融合外源的CBM對(duì)外切葡聚糖酶的催化活性、對(duì)底物的結(jié)合能力及最適反應(yīng)溫度及pH的影響.CBM3-CBH和CBH對(duì)于不同底物的催化活性，未表現(xiàn)出顯著的差異；但是CBM3-CBH對(duì)Avicel的結(jié)合能力比CBH高8%.這表明融合外源的CBM在一定程度上能促進(jìn)外切葡聚糖酶對(duì)底物的結(jié)合，但是對(duì)其催化活性沒有影響.本研究結(jié)果與之前文獻(xiàn)報(bào)道的融合CBM可以提高纖維素酶的催化活性[14, 18]，影響纖維素酶的最適反應(yīng)溫度、熱穩(wěn)定性及pH穩(wěn)定性[19-20]這一結(jié)論不相符，CBM在纖維素酶催化過程中的作用及其作用機(jī)制有待進(jìn)一步探究.后期將選擇不同家族的CBM，通過其與纖維素酶CD區(qū)融合、自身CBM替換、自身CBM缺失等多種方式，系統(tǒng)比較不同家族的CBM對(duì)纖維素酶催化活性及酶學(xué)性質(zhì)的影響，并通過結(jié)構(gòu)分析闡述其可能的作用機(jī)制.

4 結(jié)論

在本研究中，探究了外源的CBM對(duì)外切葡聚糖酶性質(zhì)的影響，比較了天然外切葡聚糖酶CBH和其融合酶CBM3-CBH對(duì)Avicel的結(jié)合能力，對(duì)不同底物的催化活性，最適反應(yīng)溫度及pH.結(jié)果顯示CBM3-CBH和CBH對(duì)不同底物的催化活性沒有顯著差異，但是CBM3-CBH對(duì)Avicel的結(jié)合能力略高于CBH.表明融合外源的CBM能在一定程度上提高外切葡聚糖酶對(duì)底物的結(jié)合能力，對(duì)其催化活性沒有影響.CBM3-CBH和CBH兩者的最適反應(yīng)溫度都是60℃，最適反應(yīng)pH都是6，并且兩者適宜的溫度范圍及pH范圍都相同，表明融合外源的CBM對(duì)外切葡聚糖酶的最適反應(yīng)溫度與最適反應(yīng)pH無影響.本研究為探究CBM在纖維素酶催化過程中的作用機(jī)制奠定了良好的基礎(chǔ).