鐘 翔，向曉曦

(恩施州中心醫(yī)院1.病理科；2.普外科，湖北 恩施 445000)

結(jié)腸癌是我國癌癥相關死亡的主要原因之一[1]。目前臨床上免疫法糞便隱血檢測和纖維乙狀結(jié)腸鏡檢查作為主要的篩查手段，已經(jīng)明顯降低了結(jié)腸癌的死亡率，然而這些技術都有其固定的局限性[2]，開發(fā)結(jié)腸癌特異性標志物，則有助于提高患者的早期診斷率。許多惡性腫瘤組織中都存在miRNAs表達或功能異常，這與其表觀遺傳學改變有關，而檢測糞便樣本中miRNAs內(nèi)源性表達和甲基化狀態(tài)有望成為癌癥早期診斷和預后評估最具潛力的、無創(chuàng)性的生物學檢測手段[3]。miR-21和miR-34a都是靶向腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor α，TNF-α)相關炎癥通路的重要介質(zhì)[4]，而且眾多研究證實miRNAs表達和甲基化調(diào)節(jié)具有一定的組織依賴性[5]。因此本研究擬分析糞便和癌組織中miR-21和miR-34a表達及甲基化檢測對于結(jié)腸癌診斷的臨床價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 從2019年3月至2020年1月在我院行結(jié)腸癌原發(fā)灶腫瘤切除(部分患者同時行肝轉(zhuǎn)移灶切除)82例結(jié)腸癌患者中，收集了腫瘤組織標本和癌旁(距離癌變組織邊界大于5 cm)結(jié)腸黏膜組織樣本。同時在手術前使用15mL的收集管取得糞便樣本。將手術前接受化療、放療、免疫治療等患者，復發(fā)患者或合并任何其他惡性腫瘤的患者排除在本研究之外。所有病例術后病理證實為原發(fā)性結(jié)腸癌，采取美國癌癥聯(lián)合委員會或國際聯(lián)合抗癌委員會(UICC/AJCC)的結(jié)腸癌(第7版)TNM分期系統(tǒng)進行結(jié)腸癌病理分期[6]。對照組糞便樣本來自40例結(jié)腸良性腫瘤患者，經(jīng)體格檢查和實驗室檢查排除合并任何惡性腫瘤者。包括結(jié)腸息肉12例，結(jié)腸腺瘤20例，直腸息肉5例，直腸腺瘤3例。結(jié)腸癌組(n=82例)，男性51例，女性31例，平均年齡(59.87±10.67)歲，平均體重指數(shù)(23.58±4.12)kg/m2，吸煙史20.73%(17/82)，家族腫瘤史6.10%(5/82)；TNM I～II期44例，III～IV期38例，9例發(fā)生肝轉(zhuǎn)移。對照組(n=40)，男性22例，女性18例，平均年齡(58.55±12.73)歲，平均體重指數(shù)(23.90±3.75)kg/m2，吸煙史15.0%(6/40)，家族腫瘤史5.0%(2/40)。結(jié)腸癌患者和正常對照組在性別、年齡、體重指數(shù)、吸煙史、家族腫瘤史等方面，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，從而排除潛在影響DNA甲基化水平的一些客觀因素。本研究是根據(jù)我院醫(yī)學倫理委員會批準的方案進行的。在詳細解釋了目的和具體程序之后，所有參與者簽署了書面知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 實時熒光定量PCR法檢測miR-21/miR-34a基因表達情況 采用Trizol試劑盒(美國Sigma-Aldrich公司)和糞便RNA提取試劑盒(美國Omega Bio-Tek公司)分別提取組織樣本和糞便樣本中的總RNA。采用NanoDrop 2000C超微量分光光度計檢測RNA質(zhì)量，只采用A260/280 nm1.8～2.0的RNA片段用于逆轉(zhuǎn)錄。以5μg/L的RNA為模板，采用通用cDNA合成試劑盒(美國Qiagen公司)合成cDNA。利用Roche LC480系統(tǒng)檢測miR-21/miR-34a的表達。根據(jù)Primer Finder數(shù)據(jù)庫(www.applied-science.roche.com)設計了miR-21、miR-34a的PCR引物序列，并委托上海生工生物工程公司合成。PCR反應體系包含2μL特異性引物、8μL DNA模板、10μL LC480 SYBR Green I Master mix，總體積為20μL。PCR反應混合液在95℃預變性5min，然后經(jīng)過45個三步擴增周期(95℃5s，50℃15 s，72℃5s)。所有樣本平行進行3次，取平均值。以5srRNA和U6snRNA作為內(nèi)源參考，對數(shù)據(jù)進行歸一化處理。采用2-ΔΔCT法比較相對miRNA表達水平。miR-21引物序列為(正向)5’-GCG GTA GCT TAT CAG ACT GA-3’，(反向)5’-TGC GTG TCG TGG AGT C-3’。miR-34a引物序列為(正向)5’-GCG GTA GCT TAT CAG ACT GA-3’，(反向)5’-TGC GTG TCG TGG AGT C-3’。 U6引物序列為(正向)5’-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3’，(反向)5’-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3’。qRT-PCR反應特異性由熔解曲線判斷，若呈單峰則特異。在分析miRNAs表達與病理分期的關系時，將中位數(shù)設為臨界值(臨界值高值和下限值均為50%)，95%置信區(qū)間。

1.2.2 甲基化特異性PCR(MSP)法分析miR-21/miR-34a基因啟動子甲基化狀態(tài) 用液氮砂漿將組織標本(20 ± 1 mg)快速研磨成粉末。糞便樣品(200～220 mg)稱重后，置于2 mL微量離心管中離心，然后加入1.6 mL緩沖液。所有的操作步驟都在冰浴中完成。分別用Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0(大連寶生公司)和QIAamp DNA Stool Mini Kit(美國Qiagen公司)提取組織和糞便基因組DNA。用紫外分光光度法測定DNA的濃度，同樣采用A260/280 nm1.8～2.0的DNA片段用于逆轉(zhuǎn)錄。使用EpiTect Fast DNA Bisulfite Kit試劑盒(美國Qiagen公司)對1.5～2.0μL DNA樣本進行亞硫酸鹽修飾。將修飾后的DNA稀釋成15 μL保存。合成MSP引物，配制25 μL PCR擴增反應體系，PCR反應混合液在95℃預變性5 min，然后經(jīng)過45個三步擴增周期(95℃5 s，50℃ 15 s，72℃ 5 s)，最后的延伸步驟在72℃下進行5 min。將PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠分離，凝膠成像分析系統(tǒng)顯示清晰的特征DNA條帶。miR-21甲基化引物序列為(正向)5’-ATT CGT TTC GTT TCG CGT TCG TTT C-3’，(反向)5’-CTA AAA CTA ACT CTC TCG ACC CCG-3’。miR-21非甲基化引物序列為(正向)5’-TTT TTA TTT GTT TTG TTT TGT GTT TGT TTT G-3’，(反向)5’-CCT AAA ACT AAC TCT CTC AAC CCC A-3’。miR-34a甲基化引物序列為(正向)5’-GGT TTT GGG TAG GCC GTT TC-3’，(反向)5’-TCC TCA TCC CCT TCA CCG CCG-3’。miR-34a非甲基化引物序列為(正向)5’-NNG GTT TTG GGT AGG TGT GTT TT-3’，(反向)5’-AAT CCT CAT CCC CTT CAC ACC A-3’。對PCR產(chǎn)物進行電泳，若甲基化特異性引物擴增出目的條帶，而非甲基化特異性引物未擴增出條帶則為甲基化；若非甲基化特異性引物擴增出目的條帶，而甲基化引物未擴增出條帶，則為非甲基化；若甲基化或非甲基化引物都能擴增出目的條帶，則判斷為部分甲基化。

1.2.3 血清學指標檢查 采集糞便樣本同時留取血液樣本，2 000 r/min離心10 min取上清，-80℃保存直至分析。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor α，TNF-α)、白細胞介素-6(Interluekin-6，IL-6)水平。試劑盒購自美國Genzyme公司。

1.2.4 糞便隱血檢測 以糞便隱血膠體金檢測試紙法檢測所有參與者的糞便樣本。若試紙出現(xiàn)藍綠色則為陽性。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌患者腫瘤組織和癌旁組織中miR-21、miR-34a表達和甲基化狀態(tài) 與癌旁組織相比，結(jié)腸癌組織中miR-21相對表達量升高，同時miR-34a相對表達量降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而經(jīng)qMSP法檢測，結(jié)腸癌組織中miR-21啟動子甲基化率(6例完全甲基化和19例部分甲基化)較癌旁組織降低，同時miR-34a啟動子甲基化率(26例完全甲基化和32例部分甲基化)較癌旁組織升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表1和圖1)。

表1 結(jié)腸癌患者腫瘤組織和癌旁組織中miR-21、miR-34a表達和甲基化狀態(tài)(n=82)

2.2 兩組糞便中miR-21、miR-34a表達和甲基化狀態(tài) 與對照組相比，結(jié)腸癌患者糞便中miR-21相對表達量升高，同時miR-34a相對表達量降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而經(jīng)qMSP法檢測，結(jié)腸癌患者糞便中miR-21啟動子甲基化率(3例完全甲基化和14例部分甲基化)較對照組降低，同時miR-34a啟動子甲基化率(33例完全甲基化和40例部分甲基化)較對照組升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表2和圖2)。

表2 結(jié)腸癌患者和對照組人群糞便中miR-21、miR-34a表達和甲基化狀態(tài)

2.3 結(jié)腸癌患者腫瘤組織和糞便中miR-21、miR-34a表達和甲基化狀態(tài)的關系 經(jīng)Pearson相關分析，miR-21、miR-34a在結(jié)腸癌患者腫瘤組織和糞便中的表達量呈正相關性(r=0.782，0.618，P<0.001)。此外，根據(jù)Fisher’s精確概率法檢驗結(jié)果，P<0.001，提示腫瘤組織和糞便中miR-21、miR-34a甲基化狀態(tài)不一致；而根據(jù)Kappa一致性檢驗結(jié)果，Kappa>0.4，P<0.001，提示腫瘤組織和糞便中miR-21、miR-34a甲基化結(jié)果存在一致性，但是Kappa在0.4～0.75范圍內(nèi)，一致性一般(見表3、4和圖1)。

表3 結(jié)腸癌患者腫瘤組織和糞便中miR-21甲基化狀態(tài)的一致性

表4 結(jié)腸癌患者腫瘤組織和糞便中miR-34a甲基化狀態(tài)的一致性

圖1 結(jié)腸癌患者腫瘤組織和糞便中miR-21、miR-34a表達的Pearson相關性

2.4 糞便中miR-21、miR-34a甲基化檢測聯(lián)合糞便隱血試驗對結(jié)腸癌的診斷價值 結(jié)腸癌的診斷以術后病理檢查作為金標準。糞便miR-21、miR-34a甲基化檢測分別聯(lián)合糞便隱血均能夠提高糞便隱血單獨用于結(jié)腸癌診斷的敏感性、特異性和檢出率，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表5)。

表5 糞便中miR-21、miR-34a甲基化檢測對結(jié)腸癌的診斷價值

2.5 結(jié)腸癌患者糞便中miR-21、miR-34a甲基化與臨床病理特征的關系 結(jié)腸癌患者糞便miR-21非甲基化和miR-34a甲基化狀態(tài)與腫瘤直徑有關，經(jīng)χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。但是與其他臨床病理特征，包括年齡、性別、吸煙史、病灶部位、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、TNM分期、肝轉(zhuǎn)移無關(P>0.05，見表6)。

表6 結(jié)腸癌患者糞便中miR-21、miR-34a甲基化檢測與臨床病理特征的關系(例，%)

2.6 結(jié)腸癌患者糞便中miR-21、miR-34a甲基化狀態(tài)與血清TNF-α、IL-6水平的關系 結(jié)腸癌患者糞便miR-21非甲基化組血清TNF-α、IL-6水平較甲基化組水平升高，同時糞便miR-34a甲基化組血清TNF-α、IL-6水平較非甲基化組水平亦升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表7)。

表7 結(jié)腸癌患者糞便中miR-21、miR-34a甲基化狀態(tài)與血清TNF-α、IL-6水平的關系

3 討論

本研究利用人糞便標本，證實結(jié)腸癌患者糞便miR-21呈低甲基化，同時miR-34a則呈高甲基化，聯(lián)合檢測糞便miR-21或miR-34a甲基化狀態(tài)可以提高糞便隱血用于結(jié)腸癌診斷的敏感性、特異性和檢出率，因此可作為常規(guī)篩查手段的輔助工具，以提高早期結(jié)腸癌的篩查或診斷率。此外糞便miR-21和miR-34a甲基化狀態(tài)發(fā)生變化可能與下游TNF-α炎癥信號通路的激活也有一定的關系，進而促進腸黏膜上皮細胞癌變的進展。

在我國，結(jié)腸癌患者5年生存率極低，這可能與早期篩查手段有限有關[7]。因此迫切需要新的健全和可靠的診斷方法來改進現(xiàn)有的篩查策略，以提高結(jié)腸癌的早期診斷率，進而改善患者預后。目前大多數(shù)針對結(jié)腸癌篩查或診斷的非侵入性分子檢測都是基于糞便和/或血液的分析。例如免疫學糞便隱血檢測(Fecal occult blood testing，F(xiàn)OBT)就是最常用的檢測方法。然而，F(xiàn)OBT檢測也有一些局限性，例如對于結(jié)腸癌和結(jié)腸腺瘤的鑒別診斷敏感性較低。另一種鑒別結(jié)直腸和其他良性腫瘤的有前途的方法是檢測糞便中代表癌癥相關基因和/或表觀遺傳變異譜的分子生物標志物。腫瘤組織中的腫瘤細胞不斷脫落，進入糞便，這為發(fā)現(xiàn)癌癥相關基因“特征”提供了基礎[8]。在本研究中，結(jié)腸癌miR-21表達量普遍升高，同時miR-34a表達量則降低，這與其基因啟動子發(fā)生去甲基化或者超甲基化有關；且這兩項因子在糞便組織和癌組織中的表達變化和甲基化狀態(tài)基本一致，說明糞便DNA檢測能夠敏感地反應腫瘤組織中的DNA分子變化。雖然眾多研究也已證實糞便DNA甲基化檢測的可行性，但是由于臨床醫(yī)學數(shù)據(jù)有限，目前糞便DNA檢測暫時只能作為研究或試驗用，距臨床應用尚需要大量的工作支持[9]。但是本研究結(jié)果也為篩選糞便中的生物標志分子提供了可靠的數(shù)據(jù)支持。

眾多研究表明，miR-21的表達增加與結(jié)腸癌[9]等多種惡性腫瘤密切相關，對腫瘤細胞的增殖和凋亡具有促進作用。例如You等[10]學者發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-21表達后，可以促進結(jié)腸癌細胞系SW480的增殖，而且miR-21在結(jié)腸癌組織中呈高表達，與患者的惡性化程度呈正相關性，但與生存率呈負相關性。說明miR-21可能參與結(jié)腸癌細胞增殖的調(diào)控。此外Hulf等[11]學者證實，在前列腺癌細胞系中，miR-21啟動子高甲基化導致其表達被抑制；而經(jīng)去甲基化藥物5-氮雜-2′-脫氧胞苷(5-Aza-CdR)處理后，可導致miR-21表達上調(diào)。Ortiz等[12]學者采用Illumina的450K甲基化芯片分析、TCGA數(shù)據(jù)庫篩查、數(shù)據(jù)驗證(焦磷酸測序和qRT-PCR)和功能分析等方法，證實miR-21和miR-146b 可能受到去甲基化的調(diào)節(jié)，導致miR-21和miR-146b表達模式發(fā)生改變；并且通過細胞實驗也證實在TPC1細胞系中檢測到由于甲基化丟失導致miR-21表達增加。因此作者推斷檢測miR-21基因的甲基化和表達水平對惡性病變和良性病變的鑒別具有潛在的臨床價值。為了證實上述推斷，我們首先檢測了結(jié)腸癌組織標本中miR-21的表達情況和甲基化狀態(tài)，證實miR-21在結(jié)腸癌組織中呈高表達，同時伴有甲基化丟失，說明miR-21表達增加是由于DNA甲基化缺失引起的轉(zhuǎn)錄機制和生物學途徑的中斷。而且糞便組織中miR-21表達水平直接反映了結(jié)腸癌組織的狀態(tài)，但是甲基化狀態(tài)與腫瘤組織中存在一定的差異，這可能與樣本量偏少有關。同樣miR-34a在結(jié)腸癌組織和患者的糞便樣本中也出現(xiàn)表觀遺傳學改變。miR-34a在結(jié)腸癌組織中表現(xiàn)出頻繁的表觀沉默，而在鄰近的正常腸黏膜組織中則沒有表現(xiàn)，這可能是導致miR-34a表達量下調(diào)的主要原因，這與很多其他類型的癌癥研究結(jié)論基本一致[13-14]，如miR-34a高甲基化可抑制多種腫瘤細胞的增殖、遷移以及侵襲能力。

此外，我們還分析了糞便miR-21、miR-34a的甲基化狀態(tài)與結(jié)腸癌患者臨床病理特征之間的關系，由于納入的樣本量有限，我們進證實糞便miR-21、miR-34a甲基化狀態(tài)與腫瘤直徑有關。這也可以分子機制角度解釋，例如miR-34a表達下降與c-Met、Snail和β-catenin蛋白水平上調(diào)有關，而這些轉(zhuǎn)錄因子表達上調(diào)是促進結(jié)腸癌細胞轉(zhuǎn)移的重要原因[15]。除此以外，我們還發(fā)現(xiàn)，糞便miR-21、miR-34a甲基化狀態(tài)與血清炎癥因子TNF-α、IL-6水平升高有關。炎癥是結(jié)腸癌發(fā)生和進展的重要機制。一些炎癥細胞因子在癌癥組織中被上調(diào)，包括TNF-α、IL-6等，進而導致壞死和炎癥，并促進癌癥的發(fā)生。而miR-21、miR-34a和TNF-α旁分泌/自分泌之間的關系早已被多項研究證實[16-19]。但是根據(jù)miRDB數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，人們認為TNF-α并非miR-21或miR-34a的直接靶標，因此miR-21、miR-34a對TNF-α蛋白表達的調(diào)節(jié)作用可能是通過間接途徑發(fā)生的，但具體的調(diào)控網(wǎng)絡尚需進一步完善。

綜上所述，結(jié)腸癌患者糞便和癌組織中miR-21呈低甲基化，同時miR-34a呈高甲基化，聯(lián)合檢測糞便中miR-21或miR-34a甲基化狀態(tài)都能夠提高糞便隱血對結(jié)腸癌的臨床診斷效能。但是是否具有臨床推廣價值尚需要擴大樣本量進一步證實該結(jié)論的可靠性。