滿明銀， 李娜娜， 卜 月，于凱江

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)科， 哈爾濱 150000

膿毒癥是嚴(yán)重感染引起的宿主反應(yīng)失調(diào)導(dǎo)致的致命性器官功能障礙[1]。2016年的一項(xiàng)薈萃分析[2]顯示，每年可能有530萬人因膿毒癥而死亡。導(dǎo)致膿毒癥患者死亡的主要原因是多器官衰竭。肝臟具有解毒、代謝、合成、分泌等重要功能，對(duì)于維持人體生理穩(wěn)態(tài)具有重要作用[3]。肝臟也是人體重要的免疫器官[4]，是膿毒癥最易損傷的器官之一[5]。研究[6]表明，膿毒癥相關(guān)肝損傷發(fā)病率為34.7%。相關(guān)研究[7]認(rèn)為，肝臟的損傷常發(fā)生在膿毒癥早期。膿毒癥相關(guān)肝損傷按照發(fā)病機(jī)制可分為原發(fā)性和繼發(fā)性，繼發(fā)性肝損傷為促炎因子及活性氧自由基(ROS)等所致?lián)p傷[8]。

SS-31(在文獻(xiàn)中也被稱為Elamipretide, MTP-131, BendaviaTM)是一種水溶性、芳香陽離子線粒體靶向四肽。近年來在不同病因引起的線粒體功能障礙的相關(guān)研究[9-12]中，SS-31被證明可在包括腎臟、腦、心臟和骨骼肌在內(nèi)的多個(gè)器官中改善線粒體功能，抑制線粒體ROS 的產(chǎn)生、降低促炎介質(zhì)水平。但目前尚未有SS-31在膿毒癥相關(guān)急性肝損傷中的研究，尚不清楚其能否減輕膿毒癥相關(guān)肝損傷。

本實(shí)驗(yàn)通過觀察SS-31能否減少膿毒癥小鼠氧自由基的釋放及促炎因子的產(chǎn)生，從而對(duì)膿毒癥相關(guān)急性肝損傷起到抗炎、抗氧化的保護(hù)作用，進(jìn)而為膿毒癥肝損傷的防治提供新的治療靶點(diǎn)及靶向治療藥物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用6～8周齡SPF級(jí)C57BL/6J 雄性小鼠(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)，體質(zhì)量19～23 g。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0011；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(黑)2021-004。

1.1.2 主要儀器和試劑 微量冷凍離心機(jī)(美國Thermo公司)，高速冷凍離心機(jī)(美國Thermo公司)，-80 ℃冰箱(美國Thermo公司)，實(shí)驗(yàn)室純水凈化器(美國Thermo公司)，精密電子天平(瑞士Mettler Devices公司)，多功能酶標(biāo)儀(美國MD SpectraMax M5)，小動(dòng)物麻醉機(jī)(美國 Surgivet 公司)；ELISA試劑盒(江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司)，PBS 1×(500 mL)(美國SIGMA公司)，SS-31(杭州專肽生物技術(shù)有限公司)。

1.2 模型制備

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 24只實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(control組) 、治療藥物組(control+SS-31組)、膿毒癥肝損傷組(LPS組) 、膿毒癥肝損傷 +治療藥物組(LPS+SS-31組) ，每組均為 6 只。

1.2.2 模型建立 實(shí)驗(yàn)小鼠在實(shí)驗(yàn)前12 h 開始禁食，實(shí)驗(yàn)前4 h 禁水。造模前各小鼠稱重，control組、control+SS-31組小鼠按體質(zhì)量給予10 mL/kg的PBS液腹腔注射，LPS 組、LPS+SS-31組小鼠按體質(zhì)量給予10 mL/kg 的LPS( PBS液稀釋至1 mg/mL) 腹腔注射。繼之control組、LPS組小鼠按體質(zhì)量給予生理鹽水10 mL/kg腹腔注射，control+SS-31組、LPS+SS-31組小鼠給予SS-31(生理鹽水溶解至1 mg/mL) 10 mg/kg腹腔注射。注射器為胰島素針 30號(hào)5/16(0.3 mm×8 mm)。

1.3 取材

1.3.1 動(dòng)物麻醉及取材準(zhǔn)備 4組小鼠于模型建立12 h后使用小動(dòng)物麻醉機(jī)在小鼠活體狀態(tài)下給予異氟烷實(shí)行吸入麻醉。麻醉滿意后，固定于仰臥位，于腹正中線行1.5～2.0 cm 的縱行切口，充分暴露胸腹部，取心腔血及肝組織。

1.3.2 血標(biāo)本采集 充分暴露胸部后，以 1 mL注射器緩慢抽血，收集血液試管為EP管(每管內(nèi)預(yù)先加入10 μL肝素抗凝)，血液收集完畢后混勻，置于冰盒中靜置15 min后，4 ℃條件下離心(4000 r/min) 5 min，取上清液，分裝做好標(biāo)記，-80 ℃冰箱保存，待行血清肝功能檢測(cè)。

1.3.3 組織標(biāo)本采集 小鼠處死后，打開腹腔，游離并取出肝臟，每只小鼠取出肝臟的左外側(cè)葉置入4%多聚甲醛溶液中固定48 h，然后進(jìn)行石蠟包埋、切片，并行HE染色，觀察病理組織學(xué)改變；剩余肝臟組織保存于-80 ℃冰箱。

1.4 檢測(cè)方法

1.4.1 小鼠血清指標(biāo)檢測(cè) 取上清液，采用ELISA試劑盒檢測(cè)小鼠血清中ALT、AST的濃度值。依次將5組不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品加入室溫平衡20 min后酶標(biāo)板中，將解凍后的10 μL待檢樣品和40 μL樣品稀釋液先后加入預(yù)先設(shè)計(jì)的待檢樣品孔中，除空白孔外，每孔加入由過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗體 100 μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37 ℃恒溫箱中孵育 60 min。倒掉上層液體，拍干，用稀釋后的洗滌液反復(fù)洗板 5 次，在所有孔中先后加入底物A、B各 50 μL，37 ℃避光孵育15 min。加入終止液 50 μL，通過多功能酶標(biāo)儀測(cè)定 450 nm 處吸光度值，再根據(jù)計(jì)算公式得出實(shí)際樣品濃度。操作嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4.2 小鼠肝臟病理切片 小鼠肝臟組織浸泡于甲醛溶液中固定48 h后，將肝臟組織進(jìn)行修型，放置于石蠟包埋盒中經(jīng)過脫水、透明、浸蠟等過程，進(jìn)行包埋。包埋后進(jìn)行組織切片，厚度為 4 μm，將載有石蠟切片的載玻片置于60 ℃烤箱中烘烤2 h，置于室溫過夜。石蠟切片經(jīng)脫蠟、組織軟化、蘇木精染色、鹽酸乙醇分化、伊紅染色、脫水、透明后封片。HE染色后切片于顯微鏡下觀察其病理變化。

1.4.3 ELISA 法測(cè)定小鼠肝組織ROS、超氧化物歧化酶(SOD)、IL-1β、IL-6、TNFα 水平 取0.1 g 肝組織，置于冰上剪碎后置于EP管中，加入 PBS 液900 μL，充分研磨至組織勻漿，4 ℃條件下離心(3000 r/min)20 min，取上清液并做好標(biāo)記，并使用ELISA試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)過程嚴(yán)格按照ELISA試劑盒檢測(cè)方法及說明書進(jìn)行。

1.5 倫理學(xué)審查 本研究方案經(jīng)由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批，批號(hào)：2021037，符合實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物管理與使用準(zhǔn)則。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠表現(xiàn) 各組小鼠模型制備完成后12 h觀察各組小鼠狀態(tài)。4組小鼠均無死亡，control組及control+SS-31組小鼠較造模前未見明顯異常表現(xiàn)；LPS組及LPS+SS-31組小鼠出現(xiàn)不同程度的精神萎靡、少動(dòng)、蜷縮、毛發(fā)豎起、大便不成形等情況，其中LPS+SS-31組小鼠上述異常表現(xiàn)程度較LPS組輕。各組間小鼠體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

2.2 各組小鼠血清指標(biāo)比較 為檢測(cè)SS-31能否減輕膿毒癥肝損傷，比較4組小鼠血清中 ALT、AST水平。與control組比較，LPS組小鼠血清中 ALT、AST水平均顯著升高(P值均<0.05);與LPS組小鼠比較，LPS+SS-31組小鼠血清中 ALT、AST水平均顯著降低(P值均<0.05)(表1)。

2.3 各組小鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)比較 為檢測(cè)SS-31能否減輕膿毒癥小鼠氧化應(yīng)激，比較4組小鼠肝組織勻漿上清液中ROS、SOD水平。與control組比較，LPS組小鼠中ROS、SOD水平顯著改變(P值均<0.05);與LPS組小鼠比較，LPS+SS-31組小鼠中ROS水平顯著降低(P<0.05)(表1)。

2.4 各組小鼠炎性指標(biāo)水平比較 為檢測(cè)SS-31能否改變膿毒癥小鼠肝組織中炎癥介質(zhì)水平，比較4組小鼠肝組織勻漿上清液中TNFα、IL-1β、IL-6水平。與control組比較，LPS組小鼠中TNFα、IL-1β、IL-6水平均顯著升高(P值均<0.05);與LPS組小鼠比較，LPS+SS-31組小鼠中TNFα、IL-1β、IL-6水平顯著降低(P值均<0.05)(表1)。

表1 4組小鼠各指標(biāo)比較

2.5 各組小鼠肝組織病理切片比較 與 control組比較，LPS 組小鼠肝組織切片HE染色顯示出肝小葉結(jié)構(gòu)破壞、炎性細(xì)胞浸潤、細(xì)胞間隙模糊、肝細(xì)胞腫脹; LPS+SS-31組炎性細(xì)胞浸潤減少，肝細(xì)胞腫脹減輕(圖1)。

注：a， control組；b，control+SS-31組；c，LPS組；d，LPS+SS-31組。圖1 肝組織病理切片(HE染色，×400)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用小鼠動(dòng)物模型，通過監(jiān)測(cè)ALT、AST來反映不同組別膿毒癥小鼠的肝損傷情況，并分別從氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、組織病理等多個(gè)角度進(jìn)行分析，探討線粒體靶向肽SS-31對(duì)小鼠膿毒癥肝損傷的作用。

膿毒癥時(shí)易引起包括肝臟在內(nèi)的多器官損傷，進(jìn)一步導(dǎo)致器官功能障礙甚至衰竭，在微觀上線粒體是膿毒癥時(shí)易受損傷和出現(xiàn)功能障礙的細(xì)胞器，膿毒癥所引起的線粒體功能障礙在影響機(jī)體ATP能量產(chǎn)生和供應(yīng)的同時(shí)，也引起了大量氧自由基的釋放，進(jìn)一步加重了機(jī)體損傷，促進(jìn)了膿毒癥器官損傷的發(fā)展。而肝臟作為人體內(nèi)最大的解毒和免疫器官，當(dāng)肝細(xì)胞受到嚴(yán)重?fù)p傷時(shí)，其合成、代謝、解毒、分泌與免疫功能發(fā)生嚴(yán)重障礙，其對(duì)內(nèi)毒素的清除上發(fā)生障礙，反過來加劇了機(jī)體的損傷。既往相關(guān)研究[9,13-15]表明，SS-31可通過改善線粒體氧化呼吸鏈中復(fù)合物活性、穩(wěn)定心磷脂改善膜的生物物理性能、減輕線粒體質(zhì)子泄漏、減少ROS產(chǎn)生等途徑改善線粒體功能，減少ROS釋放。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，與control組相比，小鼠腹腔注射LPS后12 h，血清中ALT、AST水平均顯著升高，表明 LPS 誘發(fā)小鼠產(chǎn)生了膿毒癥，發(fā)生了肝損傷，這與既往研究[16]結(jié)果一致。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,使用線粒體靶向肽SS-31后可以減輕膿毒癥小鼠的急性肝損傷，且與LPS組相比發(fā)現(xiàn)腹腔注射SS-31后降低了膿毒癥小鼠模型中的ROS含量，這可能是通過SS-31改善了膿毒癥小鼠體內(nèi)的線粒體功能實(shí)現(xiàn)的。ROS可作用于核因子(NF) -κB、活化蛋白-1等氧化還原敏感性轉(zhuǎn)錄因子，從而調(diào)節(jié)促炎基因的轉(zhuǎn)錄，增加炎癥介質(zhì)釋放，加重炎癥反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SS-31可減少小鼠高表達(dá)的TNFα、IL-1β、IL-6等炎性因子，這與既往研究[17-18]一致。既往大量研究[19]證實(shí)，NF-κB是膿毒癥炎癥反應(yīng)的重要通路，SS-31可下調(diào)年齡相關(guān)的NF-κB的激活，SS-31通過改善線粒體功能，減少ROS的釋放，進(jìn)而減少NF-κB通路的激活及炎癥介質(zhì)釋放可能是SS-31減輕炎癥反應(yīng)的重要機(jī)制之一。氧化應(yīng)激產(chǎn)生的大量ROS可導(dǎo)致體內(nèi)SOD消耗，使SOD濃度降低，但本實(shí)驗(yàn)使用SS-31未能逆轉(zhuǎn)SOD的降低，這可能與SS-31使用后仍超過某一“閾值”導(dǎo)致SOD被消耗有關(guān)。既往相關(guān)研究[20-21]證明了SS-31應(yīng)用的安全性與耐受性良好，在本實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，未發(fā)現(xiàn)注射SS-31藥物后小鼠產(chǎn)生不良反應(yīng)，為SS-31應(yīng)用的安全性提供了支持。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在膿毒癥小鼠腹腔注射SS-31治療后，可減少體內(nèi)ROS的產(chǎn)生，下調(diào)膿毒癥時(shí)高表達(dá)的炎性因子，從而減輕小鼠膿毒癥肝損傷。通過對(duì)線粒體功能開展多方面機(jī)制研究，線粒體靶向藥物有望為膿毒癥的治療提供新的靶點(diǎn)。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突，特此聲明。

作者貢獻(xiàn)聲明：滿明銀負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，資料分析，撰寫論文；李娜娜參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；卜月負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)及修改論文；于凱江負(fù)責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。