王文婷，張 妍，李海明，袁 翔，肖慧敏

(宿州學院 生物與食品工程學院，安徽 宿州 234000)

0 引言

秋葵屬錦葵科，雙子葉植物，是一種一年生(熱帶多年生)的草本植物，是菜藥兩用植物，營養(yǎng)價值很高，并且具有一定的保健功能．研究表明，黃秋葵花中黃酮類化合物的含量是大豆葉子的300倍[1]．黃酮類化合物可以被人體很快吸收，吸收以后通過人體的腦血屏障進入脂肪組織，可以防止人類血管動脈粥樣硬化從而保護血管，也可以疏通體內(nèi)血液循環(huán)、提高視力、活躍大腦細胞以及人體內(nèi)其他臟器細胞等，同時還具有抵抗人體衰老、抵抗疲勞、降低血脂血壓、防止脂肪氧化以及治療燒傷燙傷等功能[2-4]．其中，抗衰老的作用機制主要和黃酮類化合物的抗氧化活性有關．因為大多數(shù)黃酮類化合物中的羥基和羰基可以阻止體內(nèi)自由基的產(chǎn)生或清除體內(nèi)自由基，從而避免體內(nèi)的氧化損傷，具有極強的抗氧化活性[5]．

目前，對黃秋葵花中總黃酮的提取方法和它的抗氧化活性的研究報道較少．黃酮類化合物的提取方法主要有堿性水或堿性稀醇提取法、水提法、有機溶劑提取法等，但這些方法往往存在試劑消耗量大、耗時長等問題[6-7]．因此，本試驗采用超聲波提取法探究黃秋葵花總黃酮的提取工藝，為提高黃秋葵花的綜合開發(fā)提供一定的理論依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 主要原料與試劑

黃秋葵花(亳州市匯東生物科技有限公司)；蘆丁標準品(上海創(chuàng)賽科技有限公司)；NaNO2、NaOH(南京化學試劑股份有限公司)；CH3CH2OH(安徽安特食品股份有限公司)．

1.2 主要儀器和設備

電子分析天平(濟南歐萊博科學儀器有限公司，PRACTUM124-1CN)；電熱恒溫鼓風干燥箱(上海丙林電子科技有限公司，DHG-3S)；臺式多用途高速離心機(廣州吉迪儀器有限公司，JIDI-16D)；高速搖擺式粉碎機(浙江超群機械設備有限公司，CQF-4D)；數(shù)控超聲波儀(廣州昊昕科技有限公司，KQ5200DB)；紫外可見分光光度計(聚創(chuàng)華業(yè)儀器有限公司，UV-759)．

1.3 試驗方法

1.3.1 標準曲線的制作

參考董丹等[6]的方法，測定并制作蘆丁標準曲線：y=6.6619x-0.0161，R2=0.9991．

1.3.2 黃秋葵花總黃酮的提取

干燥的黃秋葵花粉碎后過80目篩，稱取適量黃秋葵花粉末于帶塞的錐形瓶中，加入一定濃度的乙醇溶液，混合搖勻后置于超聲波儀中，在一定溫度下超聲提取一定時間，提取后轉移至離心管，以5 000 r/min離心10 min，最后取上清液，備用[8-10]．

1.3.3 黃秋葵花總黃酮的測定

采用硝酸化鋁法，在1.3.2提取出的上清液中加5%的NaNO2溶液，混勻，5 min后加入10%的Al(NO3)3溶液，同樣混勻，6 min后加4%的NaOH溶液，最后用40%的乙醇溶液定容，放置15 min后測定其吸光度值．再由1.3.1中的標準曲線計算出黃秋葵花樣品溶液中總黃酮的質量濃度，由式(1)計算出黃秋葵花總黃酮的提取率[10-11]．

(1)

式中：c為黃秋葵花樣品溶液中總黃酮的質量濃度，mg/mL；V為黃秋葵花總黃酮提取液的定容體積，mL；d為黃秋葵花樣品溶液的稀釋倍數(shù)；m為黃秋葵花樣品質量，g．

1.3.4 黃秋葵花總黃酮提取單因素試驗

(1)乙醇濃度對提取黃秋葵花總黃酮的影響

準確稱取1.0000 g黃秋葵花粉末，分別加20%、30%、40%、50%、60%、70%的乙醇溶液160 mL，然后在超聲波50 ℃溫度下提取30 min．按照1.3.2和1.3.3中的方法得到不同乙醇濃度下黃秋葵花總黃酮的提取率，研究提取過程中不同的乙醇濃度對總黃酮提取率的影響．

(2)超聲溫度對提取黃秋葵花總黃酮的影響

準確稱取1.0000 g黃秋葵花粉末，加入160 mL 50%的乙醇溶液，用30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃超聲波分別提取30 min．按照1.3.2和1.3.3中的方法得到不同溫度下黃秋葵花總黃酮的提取率，分析提取過程中不同的超聲溫度對總黃酮提取率的影響．

(3)超聲時間對提取黃秋葵花總黃酮的影響

準確稱取1.0000 g黃秋葵花粉末，加入50%的乙醇溶液160 mL，在60 ℃下分別用超聲波提取10 min、20 min、30 min、40 mim、50 min、60 min．按照1.3.2和1.3.3中的方法,在不同時間下提取黃秋葵花總黃酮，繪制超聲時間-提取率曲線，探究提取過程中不同的超聲時間對總黃酮提取率的影響．

(4)料液比對提取黃秋葵花總黃酮的影響

準確稱取1.0000 g黃秋葵花粉末，在提取時間30 min、超聲溫度60 ℃的條件下，加入一定量的50%乙醇溶液，將料液比(g/mL)設定為1∶120、1∶140、1∶160、1∶180、1∶200、1∶220，提取黃秋葵花中的總黃酮．按照1.3.2和1.3.3中的方法，得到不同料液比下黃秋葵花總黃酮的提取率，考察提取過程中不同的料液比對總黃酮提取率的影響．

1.3.5 Box-Behnken試驗設計

根據(jù)超聲波提取黃秋葵花總黃酮的單因素試驗結果，設計四因素三水平表如表1，進行黃酮提取的響應面優(yōu)化試驗.

表1 四因素三水平試驗設計

2 結果與討論

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 不同乙醇濃度對黃秋葵花總黃酮提取率的影響

不同乙醇濃度對黃秋葵花總黃酮提取率的影響如圖1所示.隨著超聲波提取黃秋葵花總黃酮時的乙醇濃度的增加，提取率先增加后減少，最高為8.54%．這可能是因為隨著提取時乙醇濃度的增加，溶質溶出量趨向緩慢飽和，乙醇濃度越大，其極性相對降低，對提取物的作用也越小，且會有其他物質溶出[12]．因此，黃秋葵花總黃酮提取時應選取的最佳乙醇濃度為50%．

圖1 乙醇濃度對黃秋葵花總黃酮提取率的影響

2.1.2 不同超聲溫度對黃秋葵花總黃酮提取率的影響

不同超聲溫度對黃秋葵花總黃酮提取率的影響如圖2所示.隨著超聲溫度的升高，黃秋葵花總黃酮的提取率先增加后略微下降，在60 ℃達到最高值，為7.13%．可能是因為開始時溫度升高能夠加快黃酮類物質的溶出，但溫度太高，會破壞黃酮的穩(wěn)定性[13]．所以，黃秋葵花總黃酮提取時應選取的最佳超聲溫度為60 ℃．

2.1.3 不同超聲時間對黃秋葵花總黃酮提取率的影響

不同超聲時間對黃秋葵花總黃酮提取率的影響如圖3所示.隨著超聲時間的增加，黃秋葵花總黃酮的提取率先上升后下降，30 min時達到最高提取率，為7.28%．

圖2 超聲溫度對黃秋葵花總黃酮提取率的影響

圖3 超聲時間對黃秋葵花總黃酮提取率的影響

因為隨著超聲時間的增加，熱效應和機械效應也在逐漸加強，從而破壞提取出的黃秋葵花總黃酮的結構，隨之其提取率有所下降[9]．所以，黃秋葵花總黃酮提取時應選取的最佳超聲時間為30 min．

2.1.4 不同料液比對黃秋葵花總黃酮提取率的影響

不同料液比對黃秋葵花總黃酮提取率的影響如圖4所示.隨著提取劑的增加，黃秋葵花總黃酮的提取率呈先增加后減少的趨勢，料液比(g/mL)為1∶180時達到最高值8.72%．提取劑量過大造成提取率有所下降，一方面由于提取劑與原料的比例越大，濃度差就越大，導致物質的運輸過程越快；另一方面，比例的升高也會增加一些脂溶性物質和醇溶性雜質的溶出，從而影響總黃酮的浸出，提取率下降[14]．所以，黃秋葵花總黃酮提取時應選取的最佳料液比(g/mL)為1∶180．

圖4 料液比對黃秋葵花總黃酮提取率的影響

2.2 響應面法優(yōu)化黃秋葵花總黃酮提取工藝的 試驗結果

2.2.1 響應面試驗結果及其顯著性分析

響應面試驗結果如表2.根據(jù)表2的結果，由響應面軟件(Design Expert10)分析得到方差分析結果，見表3．其中，二次多項式回歸方程為：

總黃酮提取率=10.76-0.15A-0.12B+ 0.13C+0.17D+0.24AB+0.22AC+ 0.059AD-0.081BC-0.015BD-0.10CD- 0.51A2-0.16B2-0.56C2-0.42D2．

由表3可知，模型的P值小于0.000 1，說明模型有顯著性差異和統(tǒng)計學意義，且失擬項P=0.093 0，大于0.05，失擬項不顯著，說明試驗誤差小[10,12]．

表2 響應面法優(yōu)化試驗設計結果

另外，從表3中看出，A(乙醇濃度)、B(超聲溫度)、C(超聲時間)、D(料液比)對黃秋葵花總黃酮提取率影響都極顯著．AB(乙醇濃度與超聲溫度)、AC(乙醇濃度與超聲時間)的交互作用影響極顯著，CD(超聲時間與料液比)的交互作用明顯，其他各兩因素間的交互作用不明顯．

2.2.2 響應面圖分析

利用響應面軟件得出各因素交互作用對黃秋葵花總黃酮提取率影響的曲面圖如圖5．其中，曲面圖越陡，圖形越接近橢圓，說明交互作用越明顯，最小橢圓的中心點為曲面圖的最高點[8-9]．由圖5可見，不同因素交互作用對黃秋葵花總黃酮提取率的影響程度不同，其中，乙醇濃度與超聲溫度、乙醇濃度與超聲時間、超聲時間與料液比的交互作用均比較明顯，這與方差分析結果一致．

表3 方差分析結果

根據(jù)響應面預測分析，確定了黃秋葵花總黃酮的最佳提取工藝：A(乙醇濃度)為47.561%、B(超聲溫度)為53.921℃、C(超聲時間)為30.417 min、D(料液比)為1∶183.834，黃秋葵花總黃酮提取率為10.839%．

根據(jù)實際，為了便于操作，修正最佳工藝，即A(乙醇濃度)為48%、B(超聲溫度)為54℃、C(超聲時間)為30 min、D(料液比)為1∶184，進行平行驗證試驗后，最終提取率為10.953%，和預測基本一致，所以該響應面的優(yōu)化結果具有可行性．

圖5 不同因素交互作用對總黃酮提取率影響的響應面圖

3 結論

在單因素試驗基礎上，采用響應面法優(yōu)化了黃秋葵花總黃酮的提取工藝，得到最佳工藝參數(shù)：乙醇濃度48%、超聲溫度54℃、超聲時間30 min、料液比(g/mL)1∶184，最佳工藝下黃秋葵花總黃酮提取率可達10.953%．黃秋葵花的花期長、產(chǎn)量大，但它的枯萎速度也很快，經(jīng)常被當作垃圾焚燒處理，這樣不但造成浪費資源，且污染環(huán)境．如果可以利用黃秋葵花提取其中的黃酮物質，不僅能夠廢物利用，還可為天然黃酮的開發(fā)與應用提供參考．