鄧智超 田冬冬 宋青松 郭存 文利超 王奇 初雨蒙 劉濤 郭永峰

摘 ?要：高滲門控鈣滲透通道（OSCA，hyperosmolal-gatedcalcium-permeable channel）是一種Ca2+非選擇性陽離子通道，OSCA家族含有鈣依賴性通道DUF221結(jié)構(gòu)域。為了進(jìn)一步了解煙草OSCA基因家族特征和功能，本研究從栽培煙草K326基因組中鑒定到23個(gè)OSCA家族基因，并對(duì)NtOSCA家族系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)與蛋白結(jié)構(gòu)域、啟動(dòng)子、不同組織器官及干旱和鹽脅迫下表達(dá)模式進(jìn)行分析。根據(jù)進(jìn)化關(guān)系，NtOSCA基因家族被分為4個(gè)亞家族，并且同一亞家族成員間蛋白及基因結(jié)構(gòu)相似。啟動(dòng)子分析結(jié)果表明，NtOSCA家族基因啟動(dòng)子中存在著多種不同的脅迫響應(yīng)元件，其中干旱響應(yīng)元件和脫落酸響應(yīng)元件較多。進(jìn)一步組織表達(dá)分析結(jié)果表明，NtOSCA基因家族成員在不同組織的表達(dá)量不同。干旱和鹽脅迫表達(dá)模式分析表明，20個(gè)NtOSCA基因在干旱脅迫下表達(dá)量上調(diào)，15個(gè)NtOSCA基因在鹽脅迫下表達(dá)量上調(diào)。這說明OSCA基因家族在煙草抗旱和抗鹽脅迫中具有重要作用。

關(guān)鍵詞：煙草;OSCA;家族分析;表達(dá)分析;干旱脅迫;鹽脅迫

Abstract： Hyperosmolal-gated calcium-permeable channel （OSCA） is a Ca2+ nonselective cation channel found in Arabidopsis thaliana. The OSCA family members contain a calcium-dependent channel DUF221 domain. In order to further understand the characteristics and functions of OSCA gene family members in tobacco， 23 OSCA genes were identified from the genome of cultivated tobacco K326. Phylogenetic relationships， gene structures and protein domains， promoters， expression patterns in different tissues and organs， and response to drought and salt stresses of the NtOSCA family genes were analyzed. According to the evolutionary relationship， the NtOSCA gene family was divided into four subfamilies， and the protein and gene structure of the same subfamily members were similar. The results of promoter analysis showed that there were many different stress response elements in the promoters of NtOSCA family genes， among which the drought response elements and abscisic acid response elements were the most abundant. Further tissue expression analysis showed that the expression levels of NtOSCA family genes were different in different tissues. The expression pattern analysis of drought and salt stress responses showed that the expression levels of 20 NtOSCA genes were up-regulated under drought stress， and 15 NtOSCA genes were up-regulated under salt stress. These results indicated that OSCA gene family members played an important role in drought and salt stress resistance of tobacco.

Keywords： tobacco; OSCA; genome-wide analysis; expression analyses; drought stress; salt stress

植物對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)方式主要包括信號(hào)感知、調(diào)控、傳遞，以及應(yīng)答基因的表達(dá)調(diào)控[1]。研究表明，Ca2+是植物響應(yīng)生物和非生物脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中重要的第二信使，在信號(hào)感知過程中，特別是在滲透變化過程中，Ca2+濃度升高[2]。高滲門控鈣滲透通道（OSCA，hyperosmolal-gatedcalcium- permeable channel）是一種Ca2+非選擇性陽離子通道，被認(rèn)為是一種受滲透/機(jī)械應(yīng)力刺激的滲透傳感器，在植物感知外界滲透脅迫和激活多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起著至關(guān)重要的作用。擬南芥OSCA蛋白表現(xiàn)出高滲誘導(dǎo)的Ca2+增加，進(jìn)一步被鑒定為滲透傳感器，并且被證實(shí)能夠抵御干旱脅迫[3]。

隨著植物全基因組測序的進(jìn)行，擬南芥、水稻[4]、玉米[5]、大豆[6]和番茄[7]的OSCA基因家族分別鑒定到15個(gè)、11個(gè)、12個(gè)、21個(gè)和12個(gè)基因。玉米中的ZmOSCA2.4在擬南芥中過表達(dá)顯著提高了抗旱性并且降低衰老相關(guān)基因的表達(dá)[5];擬南芥AtOSCA1.3在免疫信號(hào)傳遞過程中控制氣孔關(guān)閉[8];擬南芥AtOSCA1.8和小麥TaOSCA1.4基因與干旱脅迫關(guān)系密切[9];蒺藜苜蓿[10]和水稻[11]OSCA家族蛋白含有鈣依賴性通道DUF221結(jié)構(gòu)域，HOU等[12]研究發(fā)現(xiàn)該結(jié)構(gòu)域可能通過滲透調(diào)節(jié)來減輕干旱或鹽脅迫造成的損害。

煙草是一種具有高經(jīng)濟(jì)效益的作物，在生育期中經(jīng)常受到干旱、鹽堿等非生物脅迫的影響導(dǎo)致產(chǎn)量品質(zhì)下降，但煙草中的OSCA基因家族還未見報(bào)道。因此，本研究利用生物信息學(xué)方法鑒定并分析煙草K326 OSCA基因家族的基因結(jié)構(gòu)、蛋白結(jié)構(gòu)域和啟動(dòng)子，在不同組織器官中及在干旱、鹽脅迫下的表達(dá)模式，探索NtOSCA基因家族成員的進(jìn)化關(guān)系，篩選響應(yīng)干旱和鹽脅迫的候選基因，為進(jìn)一步明確NtOSCA基因功能和煙草抗逆品種培育奠定基礎(chǔ)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料和處理

試驗(yàn)材料為普通煙草品種K326，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所保存。煙草種子消毒后播種于MS固體培養(yǎng)基上，在人工氣候室中培養(yǎng)至4片真葉后，移至MS液體培養(yǎng)基作為對(duì)照，以含有300 mmol/L甘露醇的MS液體培養(yǎng)基模擬干旱脅迫處理，以含有100 mmol/L NaCl的MS液體培養(yǎng)基作為鹽脅迫 處理，培養(yǎng)0、1、3和6 h后分別取6株液氮保存。

1.2 ?煙草OSCA家族基因成員鑒定及序列特征分析

從茄科基因組數(shù)據(jù)庫（https：//solgenomics.net/）中獲取普通煙草（Nicotiana tabacum）的蛋白序列和核酸序列。從TAIR（www.arabidopsis.org）數(shù)據(jù)庫中下載擬南芥所有的OSCA蛋白序列，從Pfam數(shù)據(jù)庫（http：//pfam.xfam.org/）中對(duì)擬南芥OSCA基因家族成員進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其均含有DUF221結(jié)構(gòu)域，所以將含有該結(jié)構(gòu)域的基因作為煙草OSCA基因家族的候選基因。從Pfam數(shù)據(jù)庫中下載OSCA基因家族的HMM模型文件（PF02714），利用HMMER程序檢索OSCA基因家族成員，E值設(shè)為1e-20，提取結(jié)構(gòu)域序列，利用CLUSTAL2.1進(jìn)行多序列比對(duì)，構(gòu)建煙草特異的OSCA蛋白保守結(jié)構(gòu)域隱馬爾科夫模型序列，使用HMMER程序再次檢索煙草核酸序列，得到的結(jié)果文件，E值設(shè)為0.01，篩除其中重復(fù)的序列，剩余的即為煙草OSCA基因家族成員。

利用在線網(wǎng)站Expasy（http：//www.expasy.org/tools/protparam.html）中的ProtParam來計(jì)算煙草OSCA家族蛋白長度（Protein length）、分子量（Molecular weight）、等電點(diǎn)（Isoelectric point）、脂肪族氨基酸含量（AI）、疏水性指數(shù)（GRAVY）等理化性質(zhì)。

1.3 ?亞細(xì)胞定位預(yù)測及連鎖群定位

利用在線網(wǎng)站Softberry（http：//linux1.softberry.com）中的ProtCompv.9.0軟件進(jìn)行分析。從煙草基因組注釋文件（GFF文件）中提取基因的染色體位置。

1.4 ?煙草OSCA蛋白進(jìn)化分析

從Uniprot數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org）下載擬南芥、大豆、番茄的OSCA蛋白序列，利用MEGA7對(duì)擬南芥、大豆、番茄和煙草的OSCA蛋白進(jìn)行進(jìn)化樹構(gòu)建，序列比對(duì)采用ClustalW方法，刪除比對(duì)結(jié)果中結(jié)構(gòu)域外不保守的部分，進(jìn)化樹構(gòu)建使用最大自然法，bootstrap設(shè)為1000。結(jié)果使用Fig Tree將進(jìn)化樹的圖像可視化。

1.5 ?煙草OSCA蛋白保守結(jié)構(gòu)域及基因結(jié)構(gòu)分析

使用在線網(wǎng)站MEME（http：//meme-suite.org/）對(duì)NtOSCA蛋白進(jìn)行保守Motif預(yù)測，Motif長度設(shè)為6～100，檢索到的最大Motif數(shù)量為10，其他參數(shù)選擇默認(rèn)值。使用在線網(wǎng)站Evolview（https：//www.evolgenius.info/evolview/#login）對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行可視化。根據(jù)煙草OSCA基因家族成員gDNA和CDS序列，分析基因結(jié)構(gòu)，利用TBtools軟件對(duì)基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行可視化。

1.6 ?;表達(dá)模式分析

從EDWARDS等[13]于2010年發(fā)布（http：//www.ebi.ac.uk/arrayexpress/experiments/E-MTAB-176/）的煙草基因表達(dá)圖譜中選取早期衰老葉、中期衰老葉、后期衰老葉、成熟葉、幼葉、莖、成熟根、幼根、種子和未開花蕾10個(gè)樣品的數(shù)據(jù)，貫穿從種子萌發(fā)到植株衰老的整個(gè)生命周期。檢索煙草OSCA家族成員匹配的樣品編號(hào)，通過樣品編號(hào)獲取對(duì)應(yīng)的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)。將數(shù)據(jù)整理后利用Cluster3.0軟件和JavaTreeView工具繪制熱圖。

1.7 ?RNA提取和Real-time PCR分析

用康維RNA提取試劑盒提取對(duì)照、干旱處理和鹽處理4個(gè)時(shí)間段的煙草幼苗整株RNA，將1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄后獲得cDNA。將稀釋20倍的cDNA

作為Real-time PCR的模板，設(shè)置PCR程序?yàn)椋侯A(yù)變性95 ℃ 10 s;循環(huán)反應(yīng)95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s共40個(gè)循環(huán);溶解曲線分析采用95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。

數(shù)據(jù)采用2-??CT方法進(jìn)行計(jì)算和分析，以NtActin作為內(nèi)參基因，與其他數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比并綜合計(jì)算。顯著性分析選擇ANOVA方法，顯著性水平為0.05。該研究所用引物如表1所示，每個(gè)樣品3次重復(fù)。

2 ?結(jié) ?果

2.1 ?煙草OSCA基因家族鑒定

通過Hmmer search在煙草中鑒定出23個(gè)OSCA基因，將其命名為NtOSCA1.1-4.0。在煙草的24條染色體中，有9條染色體含有OSCA基因，其中12號(hào)和17號(hào)染色體最多，各有3個(gè)，3號(hào)染色體有2個(gè)，1號(hào)、10號(hào)、15號(hào)、19號(hào)、22號(hào)和23號(hào)各有1個(gè)，其余都定位在Scaffold上。

從表2可見，NtOSCA家族蛋白平均長度是708 aa，最短的是NtOSCA3.1（400 aa），最長的是NtOSCA2.4（939 aa）;蛋白平均分子量80 719.7 Da，范圍在45 467.71～105 853.49 Da;等電點(diǎn)的平均值為8.93，其中最高的是NtOSCA1.7（9.7），最低的是NtOSCA4.0（6.36）;平均脂肪族氨基酸指數(shù)為102.25，最小的是NtOSCA1.12（92.38），最大的是NtOSCA2.5（109.76）;平均疏水性指數(shù)為0.186，除NtOSCA1.12（-0.09）表現(xiàn)為親水性外，其余全部表現(xiàn)為疏水性，其中NtOSCA2.3（0.338）疏水性最高。通過分析發(fā)現(xiàn)NtOSCA蛋白都具有多個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，并且都定位在細(xì)胞膜上，部分NtOSCA家族成員同時(shí)定位在高爾基體上。

2.2 ?NtOSCA家族系統(tǒng)進(jìn)化分析

通過對(duì)擬南芥、大豆、番茄和煙草的OSCA基因家族成員構(gòu)建進(jìn)化樹（圖1），來揭示NtOSCA 基因家族的進(jìn)化關(guān)系。根據(jù)前人對(duì)擬南芥OSCA基因家族的研究，OSCA基因家族可以劃分為4個(gè)亞家族，分別為Group Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ。擬南芥、大種的分化。NtOSCAs在4個(gè)亞家族的分布不均，其中Group Ⅰ亞家族中最多，有12個(gè)成員，Group Ⅳ亞家族的成員最少，只有NtOSCA4.0，但這個(gè)基因卻在進(jìn)化過程中被保留了下來，且在不同物種中保守，說明這個(gè)基因可能對(duì)植物有比較重要的作用。

2.3 ?基因結(jié)構(gòu)與蛋白結(jié)構(gòu)域分析

對(duì)NtOSCA基因家族進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析（圖2），來進(jìn)一步探索其保守性和進(jìn)化關(guān)系。通過對(duì)外顯子和內(nèi)含子的分析發(fā)現(xiàn)，NtOSCA基因成員的內(nèi)含子數(shù)量范圍在0～19，同一亞家族成員的內(nèi)含子數(shù)量相似，Group Ⅰ亞家族成員內(nèi)含子的平均數(shù)量為9個(gè)，Group Ⅱ亞家族平均為11個(gè)，Group Ⅲ亞家族平均為5個(gè)，Group Ⅳ亞家族沒有內(nèi)含子。同一亞家族的NtOSCA家族成員具有相似或相同的外顯子數(shù)，例如Group Ⅰ亞家族的NtOSCA1.1到NtOSCA1.6的外顯子長度和數(shù)量極為相似，NtOSCA1.1有10個(gè)外顯子，NtOSCA1.5有12個(gè)，其他成員都是11個(gè)。這說明NtOSCA基因家族在進(jìn)化關(guān)系上極為保守，這種保守性與它密切的進(jìn)化關(guān)系是相吻合的。

通過對(duì)NtOSCAs蛋白結(jié)構(gòu)域分析（圖2），找到了15個(gè)Motif，其中Motif 2、3、7、8和17構(gòu)成了DUF211。Motif分析發(fā)現(xiàn)所有的NtOSCA蛋白都具有Motif 8，Motif 12，除了NtOSCA4.0外，其他的差異性不大，但在不同亞家族間存在個(gè)別差異，例如Motif 15主要存在于Group Ⅰ和Ⅲ亞家族，在其他亞家族中極少分布：Motif 13分布在Group Ⅰ和Ⅱ亞家族，其他家族沒有。并且NtOSCA蛋白Motif的位置和順序高度一致，這說明NtOSCAs蛋白結(jié)構(gòu)高度保守。

2.4 ?煙草OSCA啟動(dòng)子分析

為了進(jìn)一步揭示NtOSCA基因家族在非生物脅迫中的作用，對(duì)NtOSCA基因家族成員上游2000 bp的啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析，找到大量與抗逆相關(guān)的順勢作用元件，例如脫落酸響應(yīng)元件、干旱響應(yīng)元件、生長素響應(yīng)元件、水楊酸響應(yīng)元件和低溫響應(yīng)元件（圖3）。對(duì)這些元件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)不同基因啟動(dòng)子的順式作用元件差異很大，即使是同一個(gè)亞家族也有明顯的差異，尤其是水楊酸響應(yīng)元件和低溫響應(yīng)元件，例如NtOSCA第一亞家族中有4個(gè)成員缺少水楊酸響應(yīng)元件，只有2個(gè)成員具有低溫響應(yīng)元件。除NtOSCA2.1中沒有脫落酸響應(yīng)元件，NtOSCA1.7中沒有干旱響應(yīng)元件外，大部分基因都存在干旱響應(yīng)元件和脫落酸響應(yīng)元件。這也說明NtOSCA基因家族可能與干旱脅迫以及鹽脅迫有著密切的關(guān)系。

2.5 ?煙草OSCA基因表達(dá)量分析

根據(jù)數(shù)據(jù)庫中NtOSCA基因在不同組織中的表達(dá)量和干旱處理下的表達(dá)量繪制了熱圖。結(jié)果表明（圖4），NtOSCA基因在根、莖、葉、花、種子以及根和葉的不同發(fā)育時(shí)期中均有表達(dá)，NtOSCA第一亞家族在成熟葉片和衰老葉片表達(dá)量較低，在幼葉、根和花等器官中表達(dá)較高;NtOSCA第二亞家族在花中表達(dá)量較高，個(gè)別成員在幼根（NtOSCA2.5，NtOSCA2.6）和幼葉（NtOSCA2.1，NtOSCA2.3）中表達(dá)量較高，說明第二亞家族與煙草的發(fā)育和器官分化有密切關(guān)系。NtOSCA4.0在花和莖中特異性表達(dá)，說明它可能與花器官的形成有關(guān)。

通過對(duì)煙草基因組數(shù)據(jù)庫中干旱處理的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，NtOSCA第一和第三亞家族的大部分成員在干旱處理4 d時(shí)表達(dá)量上調(diào)，NtOSCA1.4在2 d時(shí)表達(dá)量最高。第三亞家族的兩個(gè)成員在第2 d時(shí)開始上調(diào)，在第4 d時(shí)達(dá)到最高。NtOSCA2.2和NtOSCA2.4在干旱脅迫下表達(dá)下調(diào)，NtOSCA4.0在數(shù)據(jù)庫中沒有數(shù)據(jù)。

2.6 ?煙草OSCA基因家族在干旱和鹽脅迫下表達(dá)分析

圖5表明，大部分NtOSCA成員受干旱誘導(dǎo)，且同一亞家族表達(dá)模式相似。第一亞家族的大部分成員，在處理1 h后表達(dá)上調(diào)，在3 h時(shí)表達(dá)下調(diào)，且低于對(duì)照的表達(dá)量， NtOSCA1.3和NtOSCA1.8在6 h后表達(dá)又有所回升。第二、三亞家族除了NtOSCA2.8外都在1 h后表達(dá)最高，然后開始下降。NtOSCA4.0在3 h后表達(dá)最高。

圖6表明，大部分NtOSCAs在鹽處理后1 h后表達(dá)上調(diào)，NtOSCA1.3、NtOSCA1.6、NtOSCA1.11和NtOSCA2.7在3 h后表達(dá)輕微下調(diào)，在6 h后達(dá)到最高，NtOSCA3.2和NtOSCA1.9在1 h后表達(dá)最高然后開始下調(diào)且低于對(duì)照的表達(dá)量。值得注意的是NtOSCA4.0在鹽處理后，在3 h后表達(dá)倍數(shù)達(dá)到4000，說明NtOSCA4.0可能在鹽脅迫中發(fā)揮著重要作用。

3 ?討 ?論

OSCA蛋白是一種Ca2+非選擇性陽離子通道，在滲透壓力調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮重要作用，本研究在普通栽培煙草K326中鑒定到23個(gè)高滲門控鈣滲透通道基因，并對(duì)其進(jìn)行了組織特異表達(dá)分析。組織特異表達(dá)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NtOSCA基因在根、莖、葉、花、種子以及根和葉的不同發(fā)育時(shí)期中均有表達(dá)，說明NtOSCA基因家族可能對(duì)植物的各個(gè)時(shí)期發(fā)育均有著重要的作用。

王傲雪等[7]發(fā)現(xiàn)多數(shù)SlOSCA基因響應(yīng)干旱、鹽、低溫、ABA脅迫，THOR等發(fā)現(xiàn)[14]擬南芥Ca2+透性通道OSCA1.3在免疫信號(hào)傳遞過程中控制氣孔關(guān)閉。ZmOSCA2.4[8]、OsOSCA1.1和OsOSCA2.2[15]在擬南芥中過表達(dá)提高了植株對(duì)干旱的抵抗能力，ZmOSCA4.1苗期耐旱性較好[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫和鹽脅迫下測定煙草OSCA家族成員的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)NtOSCA基因家族在干旱脅迫下的大部分成員在干旱和鹽脅迫下1 h后均表達(dá)上調(diào)，且煙草OSCA家族啟動(dòng)子區(qū)域也含有大量脅迫響應(yīng)元件，其中干旱脅迫響應(yīng)元件最多，NtOSCA4.0最多有8個(gè)，可推測煙草OSCA基因家族也具有抗逆功能，并且OSCA基因家族在不同物種間功能是保守的。顧小雨等[17]發(fā)現(xiàn)抑制PbrOSCA2.6和PbrOSCA3.2表達(dá)后花粉管對(duì)滲透脅迫的敏感性下降，煙草NtOSCA3.1、NtOSCA3.2、NtOSCA2.5和NtOSCA2.6在花中表達(dá)量較高，并且在干旱脅迫下表達(dá)上調(diào)，可能也與干旱脅迫下的花粉管發(fā)育有關(guān)。NtOSCA4.0在干旱和鹽脅中的表達(dá)量都很高，因此NtOSCA4.0可能參與多種非生物脅迫，在逆境脅迫中發(fā)揮重要作用。后續(xù)應(yīng)對(duì)不同基因的功能進(jìn)行下一步的研究。

4 ?結(jié) ?論

本研究通過生物信息學(xué)的方法，從普通煙草K326中鑒定出了23個(gè)NtOSCA基因，劃分為4個(gè)亞家族，并且都含有保守結(jié)構(gòu)域DUF211。表達(dá)模式分析表明，NtOSCA基因家族在幼葉、根和花器官表達(dá)較高，干旱脅迫下20個(gè)NtOSCA基因表達(dá)量上調(diào)，鹽脅迫下15個(gè)NtOSCA基因表達(dá)量上調(diào)。以上結(jié)果表明NtOSCA家族成員在植物抵御干旱脅迫和鹽脅迫中發(fā)揮著重要的作用。

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