栗小英等

摘要：病程相關蛋白1（pathogenesis-related proteins1，PR1）是一類以基因家族形式存在的重要病程相關蛋白，在前期研究中，在小麥抗葉銹病近等基因系材料TaLr35中成功獲得了1個小麥病程相關蛋白1基因TaLr35PR1，具有植物防御體系中的SCP保守結構域。利用生物信息學方法進一步明確，該基因含有信號肽，定位于細胞間隙，可能含有跨膜結構域，相對分子量為17.3 ku，與多個植物病程相關蛋白1序列具有較高同源性；利用半定量RT-PCR方法結合genetools、SPSS軟件分析TaLr35PR1基因表達模式，結果表明，信號分子水楊酸（salicylic acid，SA）、脫落酸（abscisic acid，ABA）明顯誘導該基因表達，且用信號分子預處理后接種葉銹菌，基因表達量明顯增加；構建了TaLr35PR1基因的原核表達載體pEASY-PR1，在大腸桿菌中高效表達分子量約為17 ku的融合蛋白，明確其最佳誘導條件為在 0.8 mmol/L IPTG下于25 ℃誘導8 h。

關鍵詞：葉銹菌；信號分子；病程相關蛋白1；表達分析；原核表達

中圖分類號： Q756文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）09-0028-04

收稿日期：2014-08-27

基金項目：國家重點基礎研究發(fā)展計劃（編號：2013CB127700）；河北省自然科學基金（編號：C2012204005）。

作者簡介：栗小英（1988—），女，河北張家口人，碩士研究生，研究方向為分子植物病理。E-mail：506112516@163.com。

通信作者：王海燕，副教授，主要從事分子植物病理學研究。E-mail：ndwanghaiyan@163.com。植物在長期的進化過程中，為了抵抗病害對自身生長的不良影響，在一定程度上發(fā)展了感受生物脅迫信號的機制，通過體內的信號傳導途徑，激發(fā)轉錄因子與相應的順式作用元件的結合，進而啟動特定基因的轉錄和表達，最后導致植物對脅迫作出反應[1]。病程相關（pathogenesis-related，PR）蛋白質在信號傳遞與脅迫應答中起調節(jié)作用。PR 基因的最初發(fā)現主要是由于它們在植物受到病原物侵染時會大量表達。PR蛋白質除了在抗病反應中發(fā)揮重要作用外，在植物抗衰老、傷害、非生物逆境脅迫和激素處理，以及正常生長中也發(fā)揮重要作用。在PR蛋白家族中，PR1是一類重要的蛋白，但對其作用機制以及靶物質還尚不了解[2]。水楊酸（salicylic acid，SA）或乙烯（ethylene） 可誘導PR1基因的表達，常被作為系統(tǒng)獲得性抗性（systemic acquired resistance，SAR）的分子標記[3]，因此，PR1基因編碼的蛋白質成為目前的研究熱點。

PR1蛋白最早從煙草中發(fā)現，隨后從許多單子葉和雙子葉植物中鑒定出PR1基因。PR1是一類可經病原菌和SA大量誘導表達的PR蛋白，蛋白分子量為14～17 ku，有酸性和堿性，大多呈堿性。PR1 被證實具有抗病毒擴散、限制真菌入侵和保護植物抵御逆境脅迫等功能[4-5]。Agrawal 等研究證明OsPR1a、OsPR1b基因受茉莉酸（jasmonic acid，JA）、SA、過氧化氫（H2O2）、蛋白酶抑制劑斑蝥素（cantharidin，CN）、草藻滅（endothall，EN）和稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）的誘導，對光傷害及磷酸酶抑制劑等環(huán)境脅迫和化學處理作出反應[6-8]。楊德翠等研究發(fā)現，PR1基因表達量與水楊酸的積累密切相關，表達量的升高增強了牡丹對柱枝孢葉斑?。–ylindrocladium canadense）的抗性，并且發(fā)現該病侵染牡丹 24 h 后，PR1基因的表達顯著提高[9]。

小麥（Triticum aestivum）是重要的糧食作物，是全世界一半以上人口的主糧。小麥生產經常受到病蟲害的威脅，尤其由小麥葉銹菌（Puccinia triticina）引起的小麥葉銹病是威脅全球小麥穩(wěn)產高產的主要病害之一。小麥抗葉銹病基因Lr35，其抗性從2葉期開始表達，6葉期完全表達，是1個十分有效的成株抗葉銹病基因。筆者前期利用RT-PCR和cDNA末端快速擴增技術（rapid amplification of cDNA ends，RACE）技術從含有小麥抗葉銹病基因Lr35的近等基因系材料TcLr35中獲得1個PR1基因的cDNA全長，命名為TaLr35PR1[10]。本研究擬利用半定量RT-PCR明確TaLr35PR1基因在受葉銹菌和信號分子誘導后核酸水平的表達特征，為進一步探究其在生物與非生物脅迫過程中的功能及了解生物脅迫應答機理提供線索。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試植物材料為攜帶小麥抗葉銹病基因Lr35的回交6代近等基因系材料TcLr35，及與其遺傳背景相同的感病親本“Thatcher”；供試小麥葉銹菌菌株為07-10-426-1（PHNT），該菌株對TcLr35呈非親和反應（反應型為1型），對Thatcher呈親和反應（反應型為4型）。各種限制性內切酶、質粒、膠回收試劑盒、Taq DNA聚合酶購自生工生物工程上海（股份）有限公司；原核表達載體pEASYTM-E1購自北京全式金生物技術有限公司。

1.2試驗方法

化學試劑處理：參考Zambounis等的方法[11]配制50 μmol/L SA溶液、50 μmol/L ABA溶液，噴灑于六葉期的成株小麥葉片表面至溶液滴下，于18～25 ℃、光照時間10～14 h的溫室培養(yǎng)，處理3 d后，開始接種葉銹菌07-10-426-1（孢子萌發(fā)率為80%以上），以未接菌處理為對照，分別在接種后0、6、12、24、36、48、72、120 h取0.1 g葉片，液氮速凍后于-80 ℃儲藏備用。

1.3總RNA的提取和cDNA第1鏈的合成

采用Bio-Flux公司的BIOZOL試劑盒提取小麥各處理樣品總RNA，按照寶生物工程（大連）有限公司的反轉錄酶試劑盒說明書合成cDNA第1鏈。反轉錄合成的模板直接用于PR1基因的半定量RT-PCR分析。

1.4小麥TaLr35PR1生物信息學分析

利用SignalP（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）、TMHMM（http：//www.hsls.pitt.edu/obrc/index.）、ProtScale（http：//expasy.org/tools/）和Spidey（http：//www. nebi. nlm. nih. Gov/spidey）在線工具完成對基因結構模式的分析。分別利用SOPMA程序和Phyre2在線工具完成對蛋白質二級、三級結構的預測。

1.5小麥TaLr35PR1基因表達模式分析

根據TaLr35PR1基因開放閱讀框（open reading frame，ORF）設計特異引物TaLr35PR1-F、TaLr35PR1-R（TaLr35PR1-F：5′- CCCAAGCTTTTAGTATGGTTTCTGTCCAATGAT-3′；TaLr35PR1-R：5′-CGCGGATCCAACTCGCCTCAGGACTAC-3′），以小麥中組成型表達的基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）基因（GenBank登錄號：AF251217；GAPDH-F：5′-AACTGCCTTGCTCCTCTTGC-3′；GAPDH-R：5′-CTGTTGTCACCCTGGAAGTCA-3′）作為內標基因。以葉銹菌、ABA，SA處理后不同時間點的小麥葉片的cDNA為模板進行半定量RT-PCR。PCR反應條件為：94 ℃預變性1 min；94 ℃變性30 s，51 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，35個循環(huán)。每個樣品設3個重復。試驗數據通過genetools軟件得出表達量大小，利用SPSS軟件計算方差和顯著性，綜合進行分析，獲得TaLr35PR1基因的相對表達量。

1.6小麥TaLr35PR1原核表達載體的構建與誘導表達

設計原核表達特異引物YTaLr35PR1-F：5′-CGCGGATCCAACTCGCCTCAGGACTAC-3′、YTaLr35PR1-R：5′-CCCAAGCTTTTAGTATGGTTTCTGTCCAATGAT-3′；PCR產物與表達載體pEASY-E1進行連接并轉化。首先使用PCR擴增用引物驗證目的片段與載體連接是否成功，再利用上游引物YTaLr35PR1-F和載體自帶T7終止子引物T7terminator（5′-TAGTTATTGCTCAGCGGTGG-3′）驗證目的片段插入的方向性，然后轉入表達載體BL21（DE3）感受態(tài)細胞后進行誘導表達。

2結果與分析

2.1小麥TaLr35PR1基因特征分析

ProtScale軟件[12]預測TaLr35PR1編碼的蛋白總體表現為疏水性；SignalP 4.1[13]預測TaLr35PR1氨基酸序列具有信號肽，信號肽酶切位點在第1～24個氨基酸殘基之間。利用 SMART在線軟件對TaLr35PR1基因進行結構分析，結果表明該基因具有保守的抗真菌結構域SCP（圖1）；利用Phyre2軟件分析，結果表明該基因由4條α螺旋、4條β折疊構成，呈三明治般的ɑβɑ結構。

2.2小麥TaLr35PR1基因表達模式

2.2.1SA誘導葉片中TaLr35PR1基因的表達譜分析50 μmol/L SA脅迫處理后，TaLr35PR1基因表達量在處理 12 h 明顯增加，并達到最大，約為對照組（0 h）表達量的7.6倍；之后隨著時間延長，表達量減少，到120 h又略有增加，約為對照組（0 h）表達量的2.6倍（圖2）。為了明確信號分子與葉銹菌的協(xié)調作用，50 μmol/L水楊酸脅迫處理3 d后，再接種葉銹菌，TaLr35PR1基因表達量在接種12 h極顯著增加并達到最大（P<0.01），約為對照組（0 h）的2.6倍；之后隨著接種時間延長，表達量顯著減少，到120 h又略有增加，約為未接種對照組（0 h）表達量的1.8倍。水楊酸預處理后再接種葉銹菌的表達趨勢與未接菌處理基本一致，但整體表達水平高于未接菌處理，接菌0 h后，TaLr35PR1基因表達量約為未接菌處理5.9倍。上述結果均扣除了Thatcher的表達量。

2.2.2ABA誘導葉片中TaLr35PR1基因的表達譜分析50 μmol/L ABA脅迫處理后，TaLr35PR1基因表達量在處理 12 h 明顯增加，72 h達到表達高峰，約為對照組（0 h）表達量的3.6倍，至120 h表達量減少（圖3）。為了明確信號分子與葉銹菌的協(xié)調作用，在50 μmol/L脫落酸脅迫預處理后，再接種葉銹菌。結果表明，TaLr35PR1基因表達量在接種12 h后顯著增加，至72 h達到最大（P<0.05），約為未接種對照組（0 h）的1.8倍；之后隨著接種時間延長，表達量稍有減少，整體表達趨勢與未接菌處理一致，但表達量明顯高于未接菌處理；接菌0 h后，TaLr35PR1基因表達量約為脫落酸處理（0 h）的3.2倍。上述結果均扣除了Thatcher的表達量。

2.3TaLr35PR1基因原核表達載體的構建

利用pEASY-E1表達試劑盒構建表達載體TaLr35PR1-pEASY，為驗證目的片段是否與載體成功連接，利用YTaLr35PR1-F、YTaLr35PR1-R引物進行PCR擴增，對重組子進行初篩，獲得約420 bp左右的片段，與該引物對TcLr35總RNA的PCR擴增產物大小一致，說明目的基因已經整合到pEASY-E1載體上。為驗證目的片段插入載體的方向是否正確，使用YTaLr35PR1-F、T7terminator重組引物對重組子進行篩選，預期擴增產物為目的片段與載體序列的重組片段，獲得約500 bp左右的片段（圖4），證明插入載體的方向正確。測序結果進一步表明，目的片段插入表達載體的位置和讀碼框正確。

2.4TaLr35PR1基因的體外誘導表達

以不同溫度、不同IPTG濃度、不同時間誘導轉化了表達載體pEASY-PR1的大腸桿菌BL21（DE3）。經SDS-PAGE

分析可見，在25 ℃溫度下，誘導的pEASY-PR1在17 ku左右產生1條新的誘導條帶，大小與理論值推算相符，而在27 ℃溫度下未見明顯誘導條帶（圖5-A）；以未經誘導的pEASY-PR1為對照，0.01～0.80 mmol/L IPTG誘導菌體均產生1條約17 ku的新條帶，確定0.80 mmol/L IPTG為最佳的誘導濃度（圖5-B）；隨著誘導時間的延長，誘導2 h蛋白表達量增加明顯，6 h至過夜趨于穩(wěn)定，最佳誘導時間為8 h（圖5-C）。結果表明，小麥TaLr35PR1基因在大腸桿菌中得到了高效表達，獲得了分子量約為17 ku的融合蛋白，最佳誘導條件為在0.8 mmol/L IPTG下于25 ℃誘導8 h。

3結論與討論

有報道證明擬南芥在抵抗病原物后的茉莉酸（JA）、SA信號轉導網絡協(xié)調擬南芥抗病性[14]。此外，在病原物侵染前用SA處理擬南芥，發(fā)現可以誘導SAR反應以及PR蛋白的表達，以增強抗病能力[15]。PR1基因能被病菌侵染和信號分子脅迫所誘導[16-17]，PR1基因的表達增強了植物抵御病害和其他各種脅迫的能力。機械損傷、植物激素（JA、SA、ET）、蛋白磷酸酶抑制劑斑蝥素（CN）、草藻滅（EN）都能誘導水稻OsPR1a基因的表達[18]。SA介導的SAR反應主要對活體營養(yǎng)型病菌起作用，而JA/ET介導的抗病信號途徑對抵抗腐生型真菌侵染起到作用[19]。棉花的PR3、PR10、GST18基因在轉錄水平上不僅受JA、SA的誘導，而且受棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum）誘導后表達水平顯著上調[11]。小麥葉銹菌為典型的活體營養(yǎng)型病菌。本研究旨在明確SA和葉銹菌誘導對TaLr35PR1基因表達的影響，結果發(fā)現TaLr35PR1基因表達受SA單獨誘導；同時，在SA脅迫處理后再接種葉銹菌，TaLr35PR1基因表達趨勢與SA誘導表達趨勢一致，而且SA與葉銹菌協(xié)同作用顯著增加了TaLr35PR1表達量，且其表達量明顯高于葉銹菌單獨誘導。

ABA是調節(jié)植物生長發(fā)育的一種激素。當植物面臨不利的自然環(huán)境時，植物體內ABA的含量會增加，進而促進植物生長。植物體內存在ABA、非ABA 2種調節(jié)系統(tǒng)[20]。實現這種調節(jié)必須能夠順利完成從刺激到準確反應的一系列信號轉導過程，這主要包括以受體為中心的脫落酸信號的細胞識別、以第二信使為中心的胞內信號轉換，以及以蛋白磷酸化為中心的信號放大與傳導等過程[14]。在前期研究中證明ABA可以誘導病程相關蛋白的表達[21]，在本研究中發(fā)現TaLr35PR1基因表達受ABA誘導，而且脫落酸與葉銹菌協(xié)同作用明顯誘導TaLr35PR1基因的表達，而且表達量顯著高于SA和葉銹菌單獨誘導?；?種信號分子對TaLr35PR1基因的誘導表達模式，推測小麥TaLr35PR1基因在參與小麥抗葉銹病防御反應時，可能通過SA、ABA 2種信號途徑，但具體作用機制還需進一步探討。

水稻、小麥等作物中關于病程相關蛋白從蛋白水平驗證抗病性的研究報道較多。李雪姣等研究發(fā)現，在水稻與白葉枯病菌互作時，病程相關蛋白1家族在接菌后不同時間點、不同生長期都發(fā)揮作用[22]；關明俐等的研究有力地證明了不同的病程相關蛋白在水稻與白葉枯病菌互作時發(fā)揮作用[23]；此外，牛吉山等應用RT-PCR和cDNA文庫篩選技術，從抗白粉病小麥-簇毛麥6VS/6AL易位系中分離到1個小麥類甜蛋白基因的全長cDNA，Western分析表明其可能與小麥 6VS/6AL 易位系的抗白粉病性相關[24]；余宇克隆得到了小麥類甜蛋白基因的全長序列，并利用原核表達得到純度較高的類甜蛋白[25]。后續(xù)研究將進一步制備單克隆抗體，從蛋白水平分析其表達模式，并分析其他信號分子對該基因的影響，探析信號傳遞途徑。

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