劉 梅，張新建，周方園

[1. 齊魯工業(yè)大學（山東省科學院）生態(tài)研究所/山東省應用微生物重點實驗室，山東 濟南 250013；2. 湖北大學生命科學學院，湖北 武漢 430062]

0 引言

【研究意義】自然界中，細菌和昆蟲形成了緊密的共生關系[1-3]，這些細菌分布于昆蟲的體表、腸道以及細胞內(nèi)，在多個方面協(xié)助昆蟲提高適應性[4]。例如，細菌可為昆蟲提供營養(yǎng)物質(zhì)，特別是一些腸道菌可合成多種維生素和氨基酸，也可協(xié)助昆蟲消化難降解甚至有毒的食物[5-8]。此外，伴生細菌會影響寄主昆蟲的生長發(fā)育以及社會行為[9,10]。早期關于昆蟲伴生細菌功能的研究主要以常規(guī)分離方法獲得純菌株隨后驗證菌株功能為主。而近十年以來，鑒于一些微生物難以獲得純培養(yǎng)菌株，越來越多的學者開始使用高通量測序技術研究昆蟲伴生細菌的多樣性和功能[11]。但是目前通過高通量測序所獲得的菌屬的功能主要是通過已有數(shù)據(jù)庫來預測，具有不確定性。而伴生細菌功能的驗證往往仍然需要獲得純菌株。因此，高效的分離技術在高通量測序技術發(fā)達的現(xiàn)在依然十分重要。【前人研究進展】目前，昆蟲伴生細菌一般通過依賴培養(yǎng)的分離方法來獲得。常用的分離培養(yǎng)基主要有LB[12-15]、TSB[13,16,17]和NB[18,19]等。例如有研究者成功使用LB培養(yǎng)基從木食性白蟻[14]以及蜜蜂[15]等昆蟲的腸道內(nèi)分離出多種細菌。還有研究者使用TSB培養(yǎng)基從淡色庫蚊腸道內(nèi)成功分離得到10種細菌[17]。也有研究發(fā)現(xiàn)可以使用NB培養(yǎng)基從斜紋夜蛾[18]以及蝗蟲腸道中分離多種細菌[19]。據(jù)以往研究，不同昆蟲的伴生細菌往往差異較大，因此在分離方法尤其是培養(yǎng)基的選擇上往往具有特異性，這也表明了針對不同昆蟲，研究其伴生細菌分離培養(yǎng)基種類選擇的必要性?！颈狙芯壳腥朦c】蔥地種蠅（Delia antiqua），俗稱“蒜蛆”，是危害大蒜、大蔥、洋蔥等百合科蔬菜的重要地下害蟲。蒜蛆幼蟲取食危害大蒜等作物根莖，給作物生產(chǎn)造成嚴重的損失[20]?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)蒜蛆伴生菌可幫助蒜蛆適應不利的食物環(huán)境[21,22]，產(chǎn)生抗菌活性化合物抵抗多種病原真菌感染蒜蛆[23,24]。然而有關蒜蛆幼蟲伴生細菌多樣性的系統(tǒng)研究鮮見報道。另外，以往對于蒜蛆伴生細菌分離鑒定的研究只采用LB培養(yǎng)基[24]，其他培養(yǎng)基對蒜蛆幼蟲伴生細菌的分離效果也有待深入探討?！緮M解決的關鍵問題】鑒于此，本研究首先使用高通量擴增子測序技術對蒜蛆幼蟲腸道和體表的伴生細菌進行解析，隨后分別采用LB和TSB兩種培養(yǎng)基分離蒜蛆體表和腸道的伴生細菌，比較兩種培養(yǎng)基的分離效果，以期探明蒜蛆幼蟲體表和腸道細菌的多樣性，同時篩選出分離效果較好的蒜蛆伴生細菌分離培養(yǎng)基，為研究蒜蛆伴生細菌的功能及蒜蛆伴生細菌的分離提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試蟲 供試蒜蛆2～3齡幼蟲于2020年5月采集于泰安范鎮(zhèn) (N36°14', E117°25)大蒜田受蒜蛆危害的大蒜植株。采集時確保每棵受害大蒜相互間距100m以上，幼蟲使用無菌鑷子采集后，來自于同一植株的蒜蛆幼蟲單獨置于同一無菌采樣袋內(nèi)，置于冰盒內(nèi)保存帶回實驗室備用。共從32棵大蒜植株采集到51頭幼蟲，試驗中每個受害植株只挑選1頭幼蟲使用。

1.1.2 主要試劑、培養(yǎng)基和儀器 dNTPs、Taq酶、DL2000 DNA Marker、10 ×Buffer購自北京索萊寶科技有限公司。16 S rRNA基因擴增引物27 F和1 492 R由生工生物工程股份有限公司合成。引物序列信息如下：27 F（5′-AGA-GTT-TGA-TCC-TGG-CTC-AG-3′）；1 492 R（5′-TAC-GGC-TAC-CTT-GTT-ACGACT-T-3′）[24]。DNA裂 解 液Buffer 1：25 mmol·L-1NaOH和0.2 mmol·L-1Na2-EDTA (pH = 12)，121 °C高壓滅 菌15 min；中和液Buffer 2：40 mmol·L-1Tris-HCl (pH = 7.5)，121 °C高 壓 滅 菌15 min[25]。Luria-Bertani 固體培養(yǎng)基（LB）：胰蛋白胨10 g·L-1，酵母提取物5 g·L-1，氯化鈉10 g·L-1，瓊脂20 g·L-1。胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSB）：40 g·L-1，購自北京索萊寶科技有限公司。PCR儀（Mastercycler X50a）購自艾本德中國有限公司，電泳儀（PowerPac）購自伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品(上海)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 蒜蛆幼蟲體表和腸道伴生細菌多樣性測序

（1） 樣品制備

將蒜蛆幼蟲放入裝有200 μL 10% 磷酸緩沖鹽溶液（PBS）的1.5 mL無菌離心管中離心超聲處理30 s、震蕩1 min，取出幼蟲后的洗液作為幼蟲體表伴生菌測序樣本。將上述取出的幼蟲使用75%乙醇消毒30 s，然后使用無菌PBS清洗（超聲處理30 s、震蕩1 min）3次。隨后將幼蟲從側面剪開，解剖出幼蟲腸道，摘除附著于腸道的白色脂肪后，整個腸道放入裝有200 μL 10% PBS的1.5 mL無菌離心管中充分研磨，作為腸道測序樣本。碾碎后在室溫下超聲震蕩1 min。上述樣本使用5頭幼蟲作為5個重復進行測序。

（2） DNA的提取

使用細菌基因組 DNA 快速抽提試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]按照說明進行總DNA的提取，提取的DNA用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，用NanoDrop進行DNA濃度和純度的檢測確保其質(zhì)量，保存至-20 ℃用于后續(xù)試驗。

（3） PCR擴增測序

對16 S rDNA V3-V4區(qū)進行擴增，引物序列為338 F (5′- ACT-CCT-ACG-GGA-GGC-AGC-AG -3′)和806 R (5′- GGA-CTA-CHV-GGG-TWT-CTA-AT -3′)，上機測序引物含4 bp長度的barcode標簽用于后期數(shù)據(jù)處理時區(qū)分不同樣品，由上海美吉生物科技股份有限公司提供。PCR反應體系為：10 × Pyrobest Bufer 5 μL，dNTPs 4 μL，引物各2 μL，Pyrobest DNA Polymerase 0.3 μL，模板DNA 3 μL，補充ddH2O 至50 μL。PCR反應條件為：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性30 s，55 ℃復性30 s，72 ℃延伸45 s，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。每樣品PCR擴增3次后的產(chǎn)物混合，用2%瓊脂糖凝膠電泳觀察產(chǎn)物，使用Wizard SV Gel and PCR Clean-up System試劑盒[普洛麥格（北京）生物技術有限公司]切膠回收PCR產(chǎn)物后送上海美吉生物科技股份有限公司使用Illumina Miseq PE300測序。

（4）測序數(shù)據(jù)處理

使 用 QIIME v.1.9.1（Quantitative Insights Into Microbial Ecology）對原始數(shù)據(jù)進行拼接、過濾和嵌合體去除以得到有效序列[26]。隨后用USEARCH軟件包中的UPARS按照97 %相似性閾值對序列進行OTU聚類[27]，選取豐度最高的序列作為該OTU的代表性序列使用RDP classifier v.2.2進行分類學分析，使用SILVA數(shù)據(jù)庫（http://www.arb-silva.de）將置信閾值設為70 %進行分類學注釋[28,29]，統(tǒng)計不同分類水平下各個樣本的OTU組成和reads數(shù)，生成OTU表。

1.2.2 蒜蛆幼蟲體表和腸道細菌的分離和鑒定

使用LB和TSB平板從蒜蛆幼蟲的體和腸道分離細菌，為了防止絲狀真菌和酵母菌污染，在兩種培養(yǎng)基中加入制霉菌素（40 mg·L-1）和放線菌酮（0.5 mg·L-1）[30]。

（1）體表伴生細菌的分離

取單頭蒜蛆幼蟲放入裝有200 μL 10% PBS 1.5 mL離心管中，隨后室溫下超聲30 s，渦旋震蕩1 min，然后將100 μL懸浮液按10倍梯度稀釋至10萬倍。選擇稀釋倍數(shù)為102～105用無菌移液槍移取50 μL滴加到LB和TSB平板上均勻涂布，待菌液充分吸收后用封口膜封口，每個濃度重復3次涂布。試驗使用5頭幼蟲分離體表細菌。

（2）腸道伴生細菌的分離

單頭幼蟲用70%的乙醇進行體表消毒30 s并用10% PBS沖洗，反復3次，隨后使用眼科手術剪從蟲體側面將幼蟲體壁剪開，用鑷子將幼蟲腸道從體內(nèi)拉出，摘除附著于腸道的脂肪后將其放入裝有200 μL 10% PBS的1.5 mL無菌離心管中，充分研磨后超聲30 s，渦旋震蕩1 min，然后將100 μL懸浮液按10倍梯度稀釋至10萬倍，選擇稀釋倍數(shù)為102～105用無菌移液槍移取50 μL滴加到LB和TSB平板上均勻涂布，每個濃度重復3次涂布。試驗使用5頭幼蟲分離腸道細菌。

將所有涂布好的平板倒置于28 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～48 h。每個平板上選擇顏色、大小、厚度、透明度和質(zhì)地不同的菌落，分別在LB和TSB培養(yǎng)基上用接種環(huán)采用三區(qū)劃線法進行劃線純化。純化后的菌株根據(jù)菌落形態(tài)進行分組[31]。

（3）蒜蛆伴生細菌的鑒定

取10 μL超純水加入到96孔板中，用10 μL槍頭從固體培養(yǎng)基純培養(yǎng)物上蘸取少量菌體至96孔板中反復吹吸至混勻；將16.6 μL Buffer 1加入到上述PCR板中吸打混勻，然后離心。離心完的樣品封膜后放入PCR儀中運行95 ℃、30 min，隨后加入16.6 μL Buffer 2 吸打混勻離心后作為DNA模板備用。16S rDNA的PCR擴增引物采用27 F和1 492 R[30,31]。反 應 體 系 為30 μL 體 系：3 μL 10×Buffer、2.4 μL dNTPs（10 mmol·L-1）、3 μL DNA模板、0.3 μL各引物（10 μmol·L-1）、0.15 μLTaq酶、27 μL ddH2O。擴增程序為：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴增產(chǎn)物使用1.2%瓊脂糖凝膠進行檢測，目的片段大小1 500bp[32,33]。陽性結果PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程股份有限公司進行測序。所得序列在NCBI上進行BLAST分析，下載親緣關系較近的序列，使用Mega 7最大似然法構建系統(tǒng)發(fā)育樹（bootstrap值500）[34]，參考前人已經(jīng)發(fā)表的結果使用親緣關系遠且所覆蓋的分類單元多的Anabaena affinis（AF247591.1）作為外群[35,36]。

1.2.3 兩種培養(yǎng)基分離效果的比較

分別在種水平和屬水平上比較高通量測序和兩種培養(yǎng)基上分離到的細菌的數(shù)量，使用韋恩圖比較測序和LB、測序和TSB、LB和TSB之間體表和腸道細菌共有和特有數(shù)量。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

測序數(shù)據(jù)處理方法詳見1.2.1。采用Sigmaplot 14.0和R 3.3.1作圖。

2 結果與分析

2.1 蒜蛆幼蟲體表和腸道細菌的多樣性

所有樣品測序的稀釋曲線最后都基本趨于平緩，說明測序數(shù)據(jù)量充分，高通量測序能較好地反映物種的豐度及多樣性。其中從蒜蛆幼蟲體表和腸道分別獲得了424 579和408 741個有效reads。根據(jù)97%相似度對抽平后的序列進行OTU聚類，從蒜蛆幼蟲體表檢測到59個OTU，從蒜蛆幼蟲腸道檢測到203個OTU。

經(jīng)過測序一共得到4個門、66個科、115個屬。如圖1和圖2測序結果所示，蒜蛆幼蟲體表和腸道樣本中的序列大部分不能鑒定到種水平，基本上都是鑒定到屬水平。如圖1，蒜蛆幼蟲體表共鑒定得到4個門、16個科、21個屬，其中豐度較高的屬包括穩(wěn)桿菌屬Empedobacter（48.1%）、乳球菌屬Lactococcus（20.8%）、不 動 桿 菌 屬Acinetobacter（12.7%）、腸球菌屬Enterococcus（4.0%）、普羅威登斯菌屬Providencia（3.3%）、鞘氨醇桿菌屬Sphingobacterium（2.5%）和叢毛單胞菌屬Comamonas（1.3%）。上述屬中，能鑒定到種的只有短穩(wěn)桿菌Empedobacter brevis、韓國叢毛單胞菌Comamonas koreensis、河流瓦格球菌Vagococcus fluvialis、擬黃桿菌Ochrobactrum pseudogrignonense和戴爾福特菌Delftia tsuruhatensis五個種。如圖2，蒜蛆幼蟲腸道共鑒定得到4個門、65個科、115個屬，其中豐度較高的屬包括羅威登斯菌屬Providencia（80.2%）、腸球菌屬Enterococcus（8.9%）、沃爾巴克氏體屬Wolbachia（7.7%）、乳球菌屬Lactococcus（1.6%）；上述屬中絕大部分種類均不能夠鑒定到種。

圖 1 蒜蛆幼蟲體表伴生細菌測序樣本中物種屬水平（a）和種水平（b）相對豐度Fig. 1 Relative abundance of bacteria on D. aniqua larval surface at genus (a) and species (b) levels

圖 2 蒜蛆幼蟲腸道細菌測序樣本中屬水平（a）和種水平（b）物種豐度Fig. 2 Relative abundance of bacteria in D. aniqua guts at genus (a) and species (b) levels

2.2 LB和TSB分離蒜蛆幼蟲體表和腸道細菌結果

使用LB培養(yǎng)基從蒜蛆幼蟲體表和腸道共分離得到463株細菌，根據(jù)形態(tài)選取97株菌進行測序，鑒定后共得到29種細菌（表1、圖3、圖4），分別屬于放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）4個門，分屬于11個科18個屬。使用TSB培養(yǎng)基從蒜蛆幼蟲的體表和腸道共分離得到391株細菌，選取53株菌進行測序，經(jīng)測序后共鑒定到44種細菌（表1、圖3、圖4）。這些細菌分屬于放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）4個門，分別屬于19個科28個屬。由圖3、圖4可知兩種培養(yǎng)基一共分離得到65種細菌，其中兩種培養(yǎng)基分離得到6種相同的細菌，分別為摩根氏菌Morganella morganii、雷氏普羅威登斯菌Providencia rettgeri、擬黃桿菌O.pseudogrignonense、微 桿 菌Microbacteriumsp.1、鉻還原白桿菌Leucobacter chromiireducens和蒼黃假棍狀桿菌Pseudoclavibacter helvolus。

表 1 使用兩種培養(yǎng)基分離得到的蒜蛆幼蟲伴生細菌菌株的GenBank號以及種屬鑒定信息Table 1 GenBank codes and species identification information on bacteria associated with D. antiqua larvae isolated on two media

使用LB培養(yǎng)基從蒜蛆幼蟲體表和腸道分離得到的伴生細菌的分離頻率結果如圖5所示，體表伴生細菌29種，分離頻率較高的種（圖5-a）包括雷氏普羅威登斯菌P. rettgeri（24.05%）、 金腸球菌Enterococcus gilvus（11.45%）和摩根氏菌M. morganii（9.16%）；腸道伴生細菌13種，分離頻率較高的種（圖5-b）分別為摩根氏菌M.morganii（44.33%）、雷氏普羅威登斯菌P.rettgeri（21.65%）和穩(wěn)桿菌Empedobactersp. (15.46%)。

續(xù)上表

使用TSB培養(yǎng)基從蒜蛆幼蟲體表和腸道分離得到的伴生細菌的分離頻率結果如圖6所示，體表伴生細菌43種，分離頻率較高的種（圖6-a）包括摩根氏菌M. morganii（20.93%）和酯香微桿菌Microbacterium esteraromaticum（11.63%）。腸 道 伴生細菌18種，分離頻率較高的種（圖6-b）包括摩根氏菌M. morganii（42.34%）、短穩(wěn)桿菌E. brevis（11.71%）、溶血假單胞菌Pseudochrobactrum asaccharolyticum（7.21%）。

圖 3 兩種培養(yǎng)基分離蒜蛆幼蟲細菌的16S rDNA最大似然樹Fig. 3 Maximum likelihood trees for 16S rDNA sequences of strains on D. antiqua larva isolated on two media

2.3 LB和TSB兩種培養(yǎng)基分離蒜蛆幼蟲體表和腸道細菌結果比較

2.3.1 LB和TSB兩種培養(yǎng)基分離蒜蛆幼蟲體表和腸道細菌數(shù)量比較 在種水平上，使用LB培養(yǎng)基從蒜蛆幼蟲體表分離得到29個種的細菌，使用TSB培養(yǎng)基共分離得到43個種的細菌；使用兩種培養(yǎng)基從蒜蛆幼蟲體表在種水平上分離得到5種相同的細菌，分別為鉻還原白桿菌Leucobacter chromiireducens、摩根氏菌M.morganii、擬黃桿菌O.pseudogrignonense、假蒼白桿菌Pseudochrobactrumsp.和蒼黃假棍狀桿菌Pseudoclavibacter helvolus（圖7-a）。在種水平上，使用LB培養(yǎng)基從蒜蛆幼蟲腸道共分離得到13個種的細菌，使用TSB培養(yǎng)基從蒜蛆幼蟲腸道共分離得到18個種的細菌；使用兩種培養(yǎng)基從蒜蛆幼蟲腸道在種水平上分離得到3種相同的細菌，分別為鉻還原白桿菌L.chromiireducens、摩根氏菌M.morganii和雷氏普羅威登斯菌P.rettgeri（圖7-b）。

圖 4 變形菌門（Proteobacteria，a）、放線菌門（Actinobacteria，b）和擬桿菌門（Bacteroidetes，c）的16S rDNA最大似然樹Fig. 4 Maximum likelihood trees for 16S rDNA sequences of Proteobacteria (a), Actinobacteria (b), and Bacteroidetes (c)

在屬水平上，使用LB培養(yǎng)基從蒜蛆幼蟲體表共分離得到17個屬，而使用TSB培養(yǎng)基分離得到25個屬；兩培養(yǎng)基分離到的相同的屬有11個，分別為：節(jié)桿菌屬Arthrobacter、芽孢桿菌屬Bacillus、穩(wěn)桿菌屬Empedobacter、亮節(jié)桿菌屬Leucobacter、微桿菌屬Microbacterium、摩根氏菌屬Morganella、蒼白桿菌屬Ochrobactrum、Paenochrobactrum、普羅威登斯菌屬Providencia、假蒼白桿菌屬Pseudochrobactrum和偽假蒼黃菌屬Pseudoclavibacter（圖7-c）。在屬水平上，使用LB培養(yǎng)基從蒜蛆幼蟲腸道共分離得到13個屬，而使用TSB培養(yǎng)基分離得到12個屬；兩培養(yǎng)基分離到的相同的屬有7個，分別為不動桿菌屬Acinetobacter、叢毛單胞菌屬Comamonas、穩(wěn)桿菌屬Empedobacter、亮節(jié)桿菌屬Leucobacter、摩根氏菌屬Morganella、蒼白桿菌屬Ochrobactrum、類芽孢桿菌屬Paenibacillus、Paenochrobactrum和普羅威登斯菌屬Providencia（圖7-d）。

圖 5 LB培養(yǎng)基上分離蒜蛆幼蟲體表（a）和腸道（b）細菌分離頻率Fig. 5 Frequency of isolating bacteria on D. antiqua surface (a) and in guts (b) by using LB medium

圖 6 TSB培養(yǎng)基上分離蒜蛆幼蟲體表（a）和腸道（b）細菌分離頻率Fig. 6 Frequency of isolating bacteria on D. antiqua surface (a) and in guts (b) by using TSB medium

2.3.2 LB和TSB兩種培養(yǎng)基分離蒜蛆幼蟲體表和腸道細菌與高通量測序結果的比較 以測序結果為標準，分別比較LB和TSB兩種培養(yǎng)基的分離效率與測序結果的差異。

在屬水平上，使用LB培養(yǎng)基從蒜蛆幼蟲體表共分離得到17個屬，使用高通量測序共檢測到21個屬；兩者共有的屬有9個，分別為：不動桿菌屬Acinetobacter、叢毛單胞菌屬Comamonas、穩(wěn)桿菌屬Empedobacter、腸球菌屬Enterococcus、亮節(jié)桿菌屬Leucobacter、蒼白桿菌屬Ochrobactrum、類芽孢桿菌屬Paenibacillus、Paenochrobactrum和普羅威登斯菌屬Providencia（圖7-e）。在屬水平上，使用LB培養(yǎng)基從蒜蛆幼蟲腸道共分離得到13個屬，使用高通量測序共檢測到115個屬；兩者共有的屬有8個，分別為： 不動桿菌屬Acinetobacter、叢毛單胞菌屬Comamonas、腸球菌屬Enterococcus、亮節(jié)桿菌屬Leucobacter、蒼白桿菌屬Ochrobactrum、類芽孢桿菌屬Paenibacillus、Paenochrobactrum和普羅威登斯菌屬Providencia（圖7-f）。

在屬水平上，使用TSB培養(yǎng)基從蒜蛆幼蟲體表共分離得到25個屬，使用高通量測序共檢測到21個屬；兩者共有的屬有6個，分別為： 穩(wěn)桿菌屬Empedobacter、亮節(jié)桿菌屬Leucobacter、蒼白桿菌屬Ochrobactrum、Paenochrobactrum、普羅威登斯菌屬Providencia和鞘氨醇桿菌屬Sphingobacterium（圖7-g）。在屬水平上，使用TSB培養(yǎng)基從蒜蛆幼蟲腸道共分離得到12個屬，使用高通量測序共檢測到115個屬；兩者共有的屬有7個，分別為芽孢桿菌屬Bacillus、亮節(jié)桿菌屬Leucobacter、蒼白桿菌屬Ochrobactrum、類芽孢桿菌屬Paenibacillus、Paenochrobactrum、普羅威登斯菌屬Providencia和假蒼白桿菌屬Pseudochrobactrum（圖7-h）。

圖 7 蒜蛆幼蟲使用LB、TSB培養(yǎng)基以及測序分離細菌種類比較Fig. 7 Bacteria from D. antiqua larva as identified by LB, TSB,and high throughput sequencing methods

3 討論與結論

本研究通過高通量擴增子測序?qū)λ馇紫x體表和腸道的伴生細菌進行了檢測，從體表和腸道一共得到4個門、66個科、115個屬的細菌。其中，蒜蛆幼蟲體表優(yōu)勢菌屬主要是穩(wěn)桿菌屬Empedobacter、乳球菌屬Lactococcus和不動桿菌屬Acinetobacter；蒜蛆幼蟲腸道的優(yōu)勢菌屬為普羅威登斯菌屬Providencia、腸球菌屬Enterococcus和乳球菌屬Lactococcus。由于目前測序技術的限制，測序所得序列長度有限，大部分序列不能注釋到種甚至是屬。

本研究采用兩種培養(yǎng)基對蒜蛆幼蟲體表和腸道的伴生細菌進行分離。使用LB培養(yǎng)基共分離得到29種細菌，分布在4門、11科、18屬。本研究與之前研究結果相比有很大的差異，已有研究使用LB培養(yǎng)基從蒜蛆幼蟲體表和腸道分離得到41株細菌經(jīng)鑒定屬于4個門12個屬15個種[24]。這種差異可能是由于取樣地點差異、實驗操作差異造成的。本研究取樣點與前人研究取樣點存在一定的地理差異，可能導致蒜蛆幼蟲體表和腸道伴生細菌種類的差異。但是，本研究也與之前的研究有相似之處，比如前人研究中檸檬酸桿菌屬Citrobacter、腸桿菌屬Enterobacter、假單胞菌屬Pseudomonas、沙雷氏菌屬Serratia、鞘氨醇桿菌屬Sphingobacterium和寡養(yǎng)單胞菌屬Stenotrophomonas的細菌在本研究中也有分離到[24]。

我們通過高通量測序和傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)得到的優(yōu)勢菌屬在之前的研究中也有報道，例如在培養(yǎng)基中添加穩(wěn)蠅Stomoxys calcitrans伴生細菌穩(wěn)桿菌屬Empedobacter的細菌能促進幼蟲生長[37]。從腸道分離得到的乳球菌屬Lactococcus可以協(xié)助昆蟲例如天牛和蜜蜂進行纖維素的降解[38,39]，同時發(fā)現(xiàn)不動桿菌屬Acinetobacter的細菌有降解木質(zhì)素的能力[40,41]。從麻蠅腸道分離得到的普羅威登斯菌屬Providencia的細菌能幫助昆蟲適應環(huán)境[42]。橄欖樹主要害蟲中的普羅威登斯菌屬Providencia的伴生細菌能協(xié)助昆蟲利用L-rhamnose[43]。從果蠅腸道分離得到的普羅威登斯菌屬Providencia和摩根氏菌屬Morganella的細菌有固氮和解毒功能[44]。家蠶腸道伴生菌腸球菌屬Enterococcus通過降低腸道pH和提供堿性條件提高了寄主的適應性[45]。從昆蟲腸道伴生菌微桿菌屬Microbacterium中純化能得到氨基酸水解酶[46]。因此推斷這些優(yōu)勢菌屬在蒜蛆適應性以及對營養(yǎng)物質(zhì)的利用方面可能發(fā)揮了重要作用。

本研究使用兩種培養(yǎng)基對蒜蛆幼蟲體表和腸道的伴生細菌進行了分離，使用LB培養(yǎng)基共分離得到29種細菌，使用TSB培養(yǎng)基共分離得到44種細菌。這兩種培養(yǎng)基分離到的細菌數(shù)量存在巨大差異。這可能是由于培養(yǎng)基營養(yǎng)成分和菌株的生長特性、營養(yǎng)需求差異導致的。LB培養(yǎng)基富含豐富的碳和氮等營養(yǎng)物質(zhì)，可以滿足各種細菌的生長需求[47]。TSB主要用作觀察菌落形態(tài)并獲得純細菌菌株的初始生長培養(yǎng)基[48]。部分細菌可能在LB培養(yǎng)基上生長速度差異較大，在挑取單菌落時，生長較慢的菌株可能會被忽略掉，導致LB平板上分離到的細菌種類偏少。

另外，值得注意的是，本研究中有些使用LB或者TSB培養(yǎng)基分離到的屬在高通量測序數(shù)據(jù)中未檢測到。這可能由兩方面的原因?qū)е拢阂皇怯捎跇悠凡町悾怯捎跍y序數(shù)據(jù)的讀長太短導致注釋不全面。本研究中細菌分離和測序分別采用兩批樣品，分菌樣品中可能存在一些環(huán)境中的細菌不存在于測序樣品中。此外，受制于目前二代測序技術讀長的限制，某些屬的序列比如普羅威登斯菌屬Providencia不能注釋到種，所以分離到的某些鑒定到種的菌株如雷氏普羅威登斯菌P. rettgeri在測序檢測時不能被認定為檢測到。

總體來說，使用TSB培養(yǎng)基能夠分離到更多種類的蒜蛆伴細菌。但是使用LB能夠分離到的部分菌株在TSB中未分離到，說明在分離蒜蛆幼蟲伴生菌時最好同時使用兩種培養(yǎng)基分離。而高通量測序結果表明，兩種分離方法雖然都分離到了蒜蛆幼蟲體表和腸道的優(yōu)勢細菌，但使用常規(guī)培養(yǎng)的分離方法能夠分離到的伴生細菌種類還相當有限。以往任何驗證伴生菌功能的研究往往需要純菌株來驗證，基于此，未來可以參考作物根際微生物的高通量分離方法[26]，從昆蟲的體表和腸道分離更多的伴生菌。