華正罡，陳曦，于浩洋，馮靜

（遼寧省疾病預防控制中心，遼寧省空氣霧霾與人群健康監(jiān)測重點實驗室，沈陽 110005）

百草枯和敵草快均為帶有雙電荷的季銨鹽類除草劑，二者常配伍使用，廣泛用于控制農(nóng)作物和水生雜草，在滅生型除草劑中其產(chǎn)量分別位居世界第二和第三。百草枯對人類的毒性極大，主要作用于肺部，會造成肺細胞的纖維化，使氣體交換嚴重受損，最終導致中毒者血液和組織缺氧而死亡［1-5］。百草枯因其毒性高、臨床無特效解毒劑已于2016 年7 月被禁止在國內(nèi)銷售和使用［6］，此后敵草快的銷量逐漸上升，但敵草快的生產(chǎn)成本較百草枯高，有部分生產(chǎn)者為了降低成本，牟取暴利，將百草枯改名為“敵草快”或?qū)俨菘輷饺霐巢菘熘谐鍪?。敵草快屬于中等毒性除草劑，盡管其毒性較百草枯低，但毒理作用與百草枯相似，可導致中毒者死亡［7-9］。目前對于百草枯和敵草快中毒病人均無特效治療藥，因此對尿液中百草枯和敵草快的準確測定，可以為臨床早期診斷提供有價值的數(shù)據(jù)信息。目前檢測百草枯和敵草快的方法主要有紫外分光光度法［10］、液相色譜法［11-12］、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［13-15］，其中，紫外分光光度法靈敏度低，不適用于生物樣品的微量檢測；百草枯和敵草快是季銨鹽類強極性化合物，易溶于水，不易溶于有機溶劑，很難在普通C18或其它反相液相色譜柱上保留。離子對試劑可用于提高反相保留時間，但如果用串聯(lián)質(zhì)譜儀進行檢測與定量，離子對試劑會產(chǎn)生顯著的離子抑制作用，降低質(zhì)譜檢測靈敏度，同時增加質(zhì)譜系統(tǒng)的污染。

親水作用液相色譜（HILIC），也被稱為“反反相”色譜。該色譜無需離子對試劑［16］，能夠顯著提高離子化效率，對強極性化合物的測定具有明顯優(yōu)勢。考慮到生物樣品基質(zhì)復雜，易引起基質(zhì)干擾，筆者采用弱陽離子交換固相萃取柱對尿液進行凈化及濃縮，以降低基質(zhì)干擾，在此基礎(chǔ)上建立了親水色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時、快速測定尿液中百草枯和敵草快的方法。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：Acquity Xevo TQ 型，美國沃特世公司。

高速冷凍離心機：Thermo ST16R 型，美國賽默飛世爾科技公司。

漩渦混合器：Vortex-genie2 型，美國Scientific industries 公司。

分析天平：BS 110S 型，感量為0.1 mg，德國賽多利斯公司。

百草枯標準物質(zhì)：批號為9-KMT-123-3，純度（質(zhì)量分數(shù)）為98%，加拿大Toronto Research Chemicals（TRC）。

敵草快標準物質(zhì)：批號為9-KMT-123-3，純度（質(zhì)量分數(shù)）為98%，上海麥克林生化科技有限公司。

待測尿液樣品：中國疾病預防控制中心職業(yè)衛(wèi)生與中毒控制所。

空白尿液樣品：中國疾病預防控制中心職業(yè)衛(wèi)生與中毒控制所。

乙腈、甲醇：均為色譜純，美國賽默飛世爾科技公司。

甲酸銨、甲酸：均為優(yōu)級純，北京化工廠。

磷酸二氫鉀：優(yōu)級純，國藥化學試劑有限公司。實驗用水為超純水。

1.2 溶液配制

磷酸鹽緩沖液：稱取磷酸二氫鉀6.8 g，加入500 mL 水溶解，用0.1 mol/L 氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6.8，加水稀釋至1 000 mL。

百草枯、敵草快標準儲備液：質(zhì)量濃度均為1.0 mg/mL，分別稱取百草枯、敵草快標準物質(zhì)各（10±0.1）mg 于10 mL 容量瓶中，加入超純水溶解并定容至標線，混勻，于-20 ℃保存。

百草枯、敵草快標準中間液：質(zhì)量濃度均為100 μg/mL，分別準確吸取百草枯、敵草快標準儲備液各1.0 mL 于10 mL 容量瓶中，以水稀釋至標線，混勻，于-20 ℃保存。

百草枯、敵草快基質(zhì)混合標準工作溶液：分別吸取百草枯標準中間液0.1 mL、敵草快標準中間液0.05 mL，置于同一只10 mL 容量瓶中，以空白基質(zhì)提取液定容至標線，混勻，配制成百草枯的質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL、敵草快的質(zhì)量濃度為0.5 μg/mL 的混合標準工作溶液，于-20 ℃保存，現(xiàn)用現(xiàn)配。

百草枯、敵草快基質(zhì)系列混合標準工作溶液：依次準確吸取百草枯、敵草快基質(zhì)混合標準工作溶液0.01、0.02、0.2、0.4、1.0、1.5 mL，分別置于6 只10 mL 容量瓶中，以空白基質(zhì)提取液稀釋至標線，混勻，配制成百草枯的質(zhì)量濃度分別為1.0、2.0、20、40、100、150 ng/mL，敵草快的質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、10、20、50、75 ng/mL 的基質(zhì)系列混合標準工作溶液。

1.3 樣品處理

準確移取0.5 mL 尿液樣品，用磷酸鹽緩沖液稀釋定容至10 mL，渦旋混勻10 s，過預先經(jīng)3 mL 甲醇和3 mL 水活化與平衡的弱陽離子交換固相萃取柱（WCX），待快流干時依次用6 mL 水和6 mL 甲醇淋洗，棄去所有淋洗液，然后用5 mL 2%甲酸乙腈溶液洗脫，收集洗脫液，于40 ℃下氮吹至近干，加入1 mL 乙腈-水（體積比為1∶1）溶液溶解殘渣，經(jīng)0.22 μm 疏水性聚四氟乙烯濾膜（PTFE）過濾，待測。

1.4 儀器工作條件

1.4.1 色譜

色譜柱：Waters HILIC柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm，美國沃特世公司）；柱溫：30 ℃；樣品室溫度：4 ℃；流動相：A 相為乙腈，B 相為200 mmol/L 甲酸銨水溶液（pH=3.7），流量為0.5 mL/min；洗脫方式：梯度洗脫；洗脫程序：0～1 min 時A 相體積分數(shù)為90%，1～3 min 時A 相體積分數(shù)由90%逐漸下降至30%，3～3.5 min 時A 相體積分數(shù)由30%逐漸下降至10%，3.5～4.0 min 時A 相體積分數(shù)由10%逐漸上升至90%，保持2 min；進樣體積：10 μL。

1.4.2 串聯(lián)質(zhì)譜

離子源：電噴霧離子源，正離子掃描模式；毛細管電壓：2.34 kV；離子源溫度：150 ℃；錐孔反吹氣：氮氣，純度（體積分數(shù)）大于99.999%，流量為50 L/h；脫溶劑氣：氮氣，溫度為350 ℃，流量為650 L/h；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式。百草枯、敵草快質(zhì)譜參數(shù)及保留時間見表1 所示。

表1 百草枯、敵草快的質(zhì)譜參數(shù)及保留時間

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

配制質(zhì)量濃度均為1.0 μg/mL 的百草枯、敵草快標準溶液，過0.22 μm 濾膜，在ESI+模式下，采用全掃描模式分別進樣測定，百草枯和敵草快母離子全掃描質(zhì)譜圖如圖1 所示。由圖1 可以看出，百草枯和敵草快的雙電荷聯(lián)吡啶離子結(jié)構(gòu)特征顯示了其復雜的質(zhì)譜行為，百草枯能同時監(jiān)測到分子離子M2+（m/z92.94）和M+（m/z186.25）及去氫分子離子［M2+-H+］+（m/z185.17）3 種類型的準分子離子；敵草快能同時監(jiān)測到分子離子M2+（m/z92.87）和M+（m/z183.97）及去氫分子離子［M2+-H+］+（m/z183.07）3 種類型的準分子離子，與文獻［6］報道一致。再分別以上述3 種離子作為母離子，進行碰撞解離，并對其子離子進行全掃描分析，得到目標化合物的碎片離子信息，如圖2 所示。由圖2 可以看出，百草枯去甲基碎片［M2+-CH3+］+（m/z171.07）和敵草快先去氫再去乙基后的碎片（m/z157.11）信號較強，可作為定量離子。然后對毛細管電壓、錐孔電壓、碰撞能量等參數(shù)進行優(yōu)化，使得待測化合物離子對信號達到最高，并以信號響應(yīng)次高的離子對作為定性離子，優(yōu)化結(jié)果見表1。

圖1 百草枯和敵草快母離子全掃描質(zhì)譜圖

圖2 百草枯和敵草快子離子全掃描質(zhì)譜圖

2.2 色譜條件優(yōu)化

百草枯和敵草快均屬于季銨鹽化合物，極性大，反相色譜柱難以保留，文獻［17］采用向流動相中加入離子對試劑以增加其保留行為，但離子對試劑會抑制質(zhì)譜信號，降低儀器檢測靈敏度，同時還會對質(zhì)譜系統(tǒng)造成污染。親水色譜（HILIC）采用強極性固定相來改善強極性物質(zhì)保留行為的色譜技術(shù)，結(jié)合高比例的有機相和低比例水相組成流動相體系，可實現(xiàn)百草枯和敵草快的保留和分離，因此選擇Waters HILIC 色譜柱為分離柱，乙腈-水為流動相。

百草枯和敵草快極易被玻璃和不銹鋼等材料吸附，在樣品制備和檢測過程中應(yīng)完全避免使用玻璃和不銹鋼器皿，但在檢測過程中儀器的管路及色譜柱接口的不銹鋼材料對待測化合物造成的吸附無法避免，而且硅膠基色譜柱上殘留的硅羥基對帶正電荷的百草枯和敵草快會有二級吸附作用，綜合表現(xiàn)的結(jié)果為色譜峰展寬并且嚴重拖尾，如圖3（a）所示。為了減少測定過程中對待測化合物的吸附，提高測定結(jié)果的準確度，一是向流動相中加入一定濃度的甲酸銨緩沖液以競爭性拮抗硅羥基結(jié)合位點對待測物的吸附，改善色譜峰拖尾；二是增加流動相流量，以進一步加強洗脫能力。分別考察了在水相中加入濃度為50、100、150、200 mmol/L 的甲酸銨緩沖液和流量分別為0.3、0.4、0.5 mL/min 時的色譜行為，結(jié)果表明，以200 mmol/L 甲酸銨溶液作為水相，流量為0.5 mL/min 時，色譜峰的對稱因子為0.95～1.05，滿足系統(tǒng)適應(yīng)性試驗對色譜峰對稱性的要求，如圖3（b）所示。

圖3 不同濃度甲酸銨作為水相時百草枯和敵草快的色譜圖

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

在1.4 儀器工作條件下，測定百草枯、敵草快基質(zhì)混合標準工作溶液，記錄百草枯和敵草快的色譜峰面積（A），然后測定相同濃度水平的溶劑標準溶液中百草枯和敵草快的色譜峰面積（B），各平行測定5 次。根據(jù)公式R=A/B×100%計算基質(zhì)效應(yīng)。計算得百草枯的基質(zhì)效應(yīng)為2.8%，敵草快的基質(zhì)效應(yīng)為4.9%，表明尿樣基質(zhì)對百草枯和敵草快均有顯著的基質(zhì)抑制作用（R小于85%認為存在基質(zhì)抑制效應(yīng)［18］）?；诎俨菘莺蛿巢菘斓募句@鹽陽離子特性，選擇混合型聚合物反相吸附和弱陽離子交換機理的固相萃取柱對樣品進行凈化處理。平行稱取6份空白尿液樣品，分別加入適量的百草枯、敵草快混合標準工作溶液，按1.3 樣品處理方法處理，在1.4儀器工作條件下進樣測定，結(jié)果顯示敵草枯和百草枯的基質(zhì)效應(yīng)分別為95.3%和98.4%，表明樣品經(jīng)凈化后基質(zhì)不干擾待測物的測定。

2.4 線性方程與檢出限

在1.4 儀器工作條件下，分別對百草枯、敵草快基質(zhì)系列混合標準工作溶液進行測定，以待測化合物的質(zhì)量濃度（X）為橫坐標、以定量離子對的色譜峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，計算線性方程和相關(guān)系數(shù)。以3 倍信噪比對應(yīng)的質(zhì)量濃度作為方法檢出限。百草枯和敵草快的質(zhì)量濃度線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限見表2。

表2 質(zhì)量濃度線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限

2.5 加標回收與精密度試驗

準確稱取6 份尿液空白樣品各0.5 mL，分別加入百草枯、敵草快混合標準工作溶液各100 μL，按1.3 樣品處理方法處理，在1.4 儀器工作條件下進樣測定，結(jié)果見表3。由表3 可知，百草枯和敵草快的平均回收率分別為100.9%，100.8%，測定結(jié)果的相對標準偏差分別為2.6%、1.6%，表明該方法的精密度和準確度良好。

表3 加標回收與精密度試驗結(jié)果

3 結(jié)語

建立了親水色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定尿液中百草枯和敵草快的方法。該方法具有較好的精密度、準確度和靈敏度，適合尿液中百草枯和敵草快的快速檢測。