齊宇坤, 張欣, 鄧巍, 黃帥義, 佘容,2*, 楊曉燕,2,3

1. 大理大學(xué)東喜瑪拉雅研究院，云南 大理 671003；

2. 中國三江并流區(qū)域生物多樣性協(xié)同創(chuàng)新中心，云南 大理 671003；

3. 大理大學(xué)三江并流區(qū)域生物多樣性保護(hù)與利用云南省創(chuàng)新團(tuán)隊，云南 大理 671003

火是陸地生態(tài)系統(tǒng)中十分重要的干擾因子[1]。隨著全球氣候變暖，野火發(fā)生頻率越來越高，尤其近兩年內(nèi)世界各地發(fā)生的持續(xù)時間長、強(qiáng)度高的森林火災(zāi)，使火對全球生態(tài)系統(tǒng)的影響及火后恢復(fù)研究受到極大關(guān)注[2]。過去對于火干擾的研究主要針對地上植被展開[3]，而近幾年有學(xué)者提出僅關(guān)注地上植被或許并不利于生態(tài)系統(tǒng)的整體恢復(fù)，在制定恢復(fù)策略時應(yīng)當(dāng)對各個生物類群進(jìn)行綜合考慮[4-5]。微生物作為陸地生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，承擔(dān)了很多重要的生態(tài)功能，其群落特征是反應(yīng)土壤生態(tài)系統(tǒng)應(yīng)對壓力和干擾的綜合指標(biāo)[6]。同時，微生物能夠?qū)ν寥牢h(huán)境進(jìn)行改造，與土壤動物、昆蟲以及地上植被關(guān)系密切[7-8]，火后土壤微生物的恢復(fù)也直接影響植被恢復(fù)，從而影響到整個森林生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性，對火后生態(tài)系統(tǒng)的恢復(fù)具有十分重要的作用[4,9]。因此，開展火后土壤微生物群落恢復(fù)能力及驅(qū)動因子研究是很有必要的。

目前的研究已經(jīng)證明火干擾可以通過直接和間接的作用明顯改變土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)[10-11]，但很多研究都是以年為時間單位開展的，這便忽視了火后土壤微生物的即時恢復(fù)過程，而微生物繁殖快、易擴(kuò)散、適應(yīng)能力強(qiáng)，即時恢復(fù)的研究是必要的[4,12]。另一方面，由于土壤微生物群落結(jié)構(gòu)在不同土層深度存在較大差異，土壤對熱量的傳導(dǎo)性也較差，使得火干擾對不同土層微生物的影響也不同[13]。因此，要探究驅(qū)動火后土壤微生物群落恢復(fù)的機(jī)制，需要掌握火后土壤微生物群落在不同土層的即時變化情況。此外，由于土壤微生物群落的復(fù)雜性和各類群生物量的差異，即便基于現(xiàn)代分子生物學(xué)方法，如宏基因組學(xué)技術(shù)，也難以獲得種水平上的微生物群落變化信息[14]，而這嚴(yán)重阻礙了對土壤微生物群落環(huán)境適應(yīng)機(jī)制研究?，F(xiàn)有傳統(tǒng)純培養(yǎng)技術(shù)雖無法完整地分離所有類群，但可以通過選擇一個類群小、個體大、易于分離、鑒定，生態(tài)學(xué)功能明確的微生物類群探究其群落變化問題[15]。

捕食線蟲真菌（Nematode-trapping Fungi，NTF）是一類廣泛分布于各種生境，可平衡不同生境中的線蟲種群數(shù)量，間接調(diào)節(jié)土壤氮循環(huán)，營養(yǎng)類型多樣的真菌，其類群小（僅3屬103種）[16-22]，且易于人工培養(yǎng)、鑒定，因而可以作為在物種水平上開展土壤微生物研究的優(yōu)選類群。基于此，本文選取了云南省大理州彌渡縣彌城鎮(zhèn)谷芹村的云南松林火燒跡地作為樣地，并在鄰近的未過火區(qū)域選取與研究區(qū)域的海拔、坡度、坡向、原始植被等生境條件基本一致的區(qū)域作為對照樣地，分層采集不同土壤樣品，探究火后土壤中捕食線蟲真菌的即時恢復(fù)狀態(tài)及不同土層中捕食線蟲真菌分布差異，分析驅(qū)動火后捕食線蟲真菌恢復(fù)的主要因子。研究結(jié)果不僅能從單一類群的角度回答微生物在火后的即時恢復(fù)能力，也能為微生物的環(huán)境適應(yīng)機(jī)制提供數(shù)據(jù)支持，同時為火后森林火燒跡地的恢復(fù)和管理提供理論依據(jù)。

1 研究區(qū)域

研究區(qū)域位于云南省大理州彌渡縣彌城鎮(zhèn)谷芹村（25°17'26.04'N，100°28'14.84'E），原始植被主要為云南松。2019年6月8日該區(qū)域發(fā)生森林大火，過火面積約47 hm2。本研究在火燒跡地內(nèi)選取火燒強(qiáng)度均勻的區(qū)域設(shè)置研究樣帶，并在火燒跡地外1 km處設(shè)置一坡向、海拔、原始植被等均與火燒跡地基本一致的區(qū)域設(shè)置非火燒對照區(qū)域。

2 研究方法

2.1 樣本采集

于2019年7月18日進(jìn)行土壤樣本采集。采樣時，分別在選取的兩塊樣地中布設(shè)樣線，并設(shè)置6個樣點，每個樣點之間間隔20 m，每個樣點按照0～10 cm（表層土），10～20 cm（中層土），20～30 cm（深層土）進(jìn)行分層采集（見圖1），火燒跡地與非火燒地分別采集樣本18份，合計36份。采樣時注意避免樣品交叉污染，裝于一次性自封袋中并標(biāo)記樣點、土層、采樣時間等樣品信息，帶回實驗室。將采集到的土樣置于4℃冰箱保存，并在一周內(nèi)處理完所有樣品。

圖 1 研究區(qū)域生境示例Fig. 1 The habitat of the study area

2.2 培養(yǎng)基的制備

玉米瓊脂培養(yǎng)基（Corn meal agar medium，CMA），用于捕食線蟲真菌的分離、培養(yǎng)、形態(tài)學(xué)鑒定；土豆培養(yǎng)基（Potato dextrose agar medium，PDA），用于富集菌絲提取DNA；燕麥培養(yǎng)基，用于培養(yǎng)誘餌線蟲。配制方法均參照文獻(xiàn)[23]進(jìn)行。

2.3 誘餌線蟲的培養(yǎng)及制備

將全齒復(fù)活線蟲（Panagrellus redivivus）接入燕麥培養(yǎng)基，放恒溫培養(yǎng)箱26.5℃培養(yǎng)一周，直到觀察到線蟲爬壁即可取出備用或放4℃冰箱保存。采用貝爾曼漏斗法[16]制備線蟲懸浮液。

2.4 捕食線蟲真菌的分離和純化

采用誘餌平板法。每份土樣取1～2 g，按五點撒樣法撒至直徑為90 mm的CMA平板上，每份土樣設(shè)置3個平行。每個平板加入1 mL全齒復(fù)活線蟲懸液以誘導(dǎo)捕食線蟲真菌孢子的萌發(fā)，常溫避光培養(yǎng)4～5周后，在體視顯微鏡下，利用無菌牙簽以單孢挑離法[23]挑取捕食線蟲真菌的單個分生孢子至中央留有約2 cm×2 cm觀察室的直徑60 mm CMA平板上，置于26℃恒溫箱中培養(yǎng)，至菌絲鋪滿觀察室后再在觀察室中加入制備好的線蟲懸液（約200條）以誘導(dǎo)產(chǎn)生捕食器官，26℃恒溫培養(yǎng)2～4 d后觀察捕食器官的類型。

2.5 捕食線蟲真菌的鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定：采用膠帶法制作捕食線蟲真菌臨時裝片[23]，用奧林巴斯BX53微分干涉顯微鏡拍取分生孢子、孢子梗、厚垣孢子和捕食器官等的形態(tài)特征，并參照文獻(xiàn)[16-22]進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

分子生物學(xué)鑒定：對于形態(tài)特殊，難以通過傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定到種的菌株，參照文獻(xiàn)[25]提取待定菌株的基因組DNA。以ITS1、ITS4[26]為引物分別對ITS（internal transcribed spacer region of the ribosomal RNA gene，核糖體RNA上的非轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)）進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測序，PCR 反應(yīng)體系如下（50 μL）如下：PCR Buffer（10×）5 μL， Mgcl2（25 mM·μL-1）5 μL，dNTP （10 Mm·μL-1）1 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，上游引物（10 μM·μL-1）1.5 μL，下游引物（10 μM·μL-1）1.5 μL，DNA模板2 μL，無菌超純水33.5 μL。反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性4 min，94℃變性45 s，54℃復(fù)性1 min，72℃延伸1.5 min，共35個循環(huán)，最后72℃補(bǔ)平延伸10 min。PCR產(chǎn)物交上海生工生物工程有限公司進(jìn)行純化并雙向測序。所得序列經(jīng)SeqMan軟件進(jìn)行核實和拼接，最后將所得序列導(dǎo)入到NCBI中用Blast工具進(jìn)行同源性比較，并按照同源性達(dá)到98%及結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果將其確定菌株物種屬性。

2.6 數(shù)據(jù)處理

（2）物種檢出率（Occurrence frequency，OF）=檢出某個種的土樣數(shù)/總土樣數(shù)×100%。

（3）所有數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2016和GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計分析。

3 結(jié)果

3.1 捕食線蟲真菌總檢出情況

從火燒跡地和非火燒地的36份土樣中共分離出88株捕食線蟲真菌，其中Arthrobotrys屬4種20株，Dactylellina屬3種67株，Drechslerella屬1種1株。而在分離到的捕食線蟲真菌中，有43株捕食線蟲真菌來自火燒地土壤樣品，經(jīng)鑒定，分別屬于Dactylellina屬的3個種；另外45株捕食線蟲真菌則分離自非火燒地土壤樣品中，分別屬于3個屬（Arthrobotrys、Dactylellina、Drechslerella），共8種，各物種在不同土壤樣品中的檢出率見表1。

表 1 火燒跡地與非火燒地不同捕食線蟲真菌的檢出率Tab. 1 Detection rate of different nematode-trapping fungi species in burned and unburned areas

3.2 不同土層檢出率和物種多樣性的概況

火燒跡地與非火燒地中捕食線蟲真菌均是在表層土中的檢出率最高。隨著土層深度的增加，檢出率降低；且經(jīng)過40 d的恢復(fù)，火燒跡地各個土層中物種的總檢出率略只低于非火燒地（見圖2），但火燒跡地中捕食線蟲真菌物種多樣性（1.07）明顯低于非火燒地（1.89）。

圖 2 火燒跡地與未火燒地不同土層總檢出率比較Fig. 2 Comparison of the total detection rate in different layers between burned and unburned areas

3.3 火干擾下捕食線蟲真菌群落結(jié)構(gòu)的改變

非火燒地中除Dac.drechsleri在10～20 cm的土層中檢出率較高以外，其余各物種分布規(guī)律較為一致，均表現(xiàn)為在表層的檢出率較高，深層檢出率較低，且在相同土層中各物種的檢出率差異不大，體現(xiàn)出在非火燒地中多數(shù)物種在不同土層間的分布較為均勻，群落結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定。而火燒跡地中各物種在不同土層的分布存在明顯差異，且在相同土層中各物種的檢出率也存在明顯差異（見圖3），由此可以看出火干擾破壞了土壤中捕食線蟲真菌群落的穩(wěn)定性，促使捕食線蟲真菌的群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。

圖 3 火燒跡地與非火燒地不同土層中捕食線蟲真菌的分布及檢出率Fig. 3 Distribution and detection rate of nematode-trapping fungi in different soil layers of burned and unburned areas

3.4 不同物種對火干擾的響應(yīng)不同

通過將火燒跡地檢出的3個物種與其在未火燒地中的檢出率比較發(fā)現(xiàn)，與未火燒地相比，火燒跡地中3個物種的總檢出率均有所增加，但不同物種對火干擾的響應(yīng)不同，具體表現(xiàn)為：（1）Dac. ellipspspora在火燒跡地各個土層中的檢出率均高于非火燒地，即火干擾后所有土層的檢出率均增加；（2）Dac. parvicolla在20～30 cm土壤中的檢出率比非火燒地略有下降，而在0～10 cm土壤中的檢出率高于非火燒地；（3）Dac. drechsleri的檢出率與非火燒地相比在0～10 cm和10～20 cm土壤中的檢出率沒有變化，但在20～30 cm土壤中有所增加（見圖4）。

圖 4 火燒跡地捕食線蟲真菌在不同土層的檢出率比較Fig. 4 Comparison of the detection rate of nematode-trapping fungi in different soil layers in burned areas

4 分析與討論

4.1 火干擾后土壤捕食線蟲真菌恢復(fù)迅速

此前對于火后微生物恢復(fù)研究大多數(shù)基于傳統(tǒng)生物量測定和宏基因組方法，這些研究反映了火干擾后森林土壤微生物群落的變化趨勢，但傳統(tǒng)生物量的測定方法只能從整體討論生物量的變化，無法整體監(jiān)測生物多樣性，導(dǎo)致信息缺失。而宏基因組檢測技術(shù)容易忽略環(huán)境中的稀有物種，并且通常運用宏基因技術(shù)時樣品采集密度低，這也可能導(dǎo)致稀有物種被忽略[14]。因此過去的研究忽略了稀有類群在火后恢復(fù)中的作用，但稀有物種對于整體的生態(tài)功能是至關(guān)重要的[27]。本研究利用傳統(tǒng)培養(yǎng)法針對捕食線蟲真菌這一小類群的研究發(fā)現(xiàn)，火干擾會明顯改變捕食線蟲真菌原本穩(wěn)定的群落結(jié)構(gòu)，降低其多樣性，說明和其他真菌類群一樣，火燒對捕食線蟲真菌類群的多樣性影響極大[28]。同時，與其他研究相比明顯不同的是，本研究中捕食線蟲真菌在各個土層的總檢出率在火燒40 d后即可恢復(fù)到僅略低于未火燒地的水平，且捕食線蟲真菌已經(jīng)形成新的生態(tài)位分化，這說明捕食線蟲真菌在火燒40 d后已經(jīng)完成了一定程度的恢復(fù)，指示群落結(jié)構(gòu)與非火燒地有明顯差別。究其原因，這可能是由于火后土壤條件僅有利于部分類群的恢復(fù)，不同類群在火后的恢復(fù)機(jī)制不同所致。因此，要進(jìn)一步認(rèn)識火后微生物的恢復(fù)機(jī)制，未來還需要在種水平上開展更細(xì)致、廣泛的研究。

有研究指出，土壤微生物群落的功能冗余使許多類群執(zhí)行的功能不會因多樣性的差異而改變[7]。真菌是早期凋落物的分解者，且在最初的微生物礦化過程中發(fā)揮著主導(dǎo)作用[7]，因此，在火后生態(tài)系統(tǒng)中的作用也應(yīng)十分重要。但有研究證明火燒后森林土壤含水量降低，有機(jī)酸變性導(dǎo)致土壤pH值升高，使火后土壤環(huán)境不利于真菌的恢復(fù)[29]。而本研究發(fā)現(xiàn)火燒40 d后捕食線蟲真菌群落已經(jīng)完成了一定程度的恢復(fù)；由此我們推測，捕食線蟲真菌對火燒后的劇烈環(huán)境變化具有較高的適應(yīng)性，而捕食線蟲真菌又是在土壤生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用的一類真菌，與細(xì)菌、植物根系、土壤動物的關(guān)系十分密切[8,16]，因此其在火后生態(tài)系統(tǒng)恢復(fù)過程中可能會發(fā)揮重要的調(diào)控作用，但由于本研究的局限性，稀有類群在火燒跡地的恢復(fù)和適應(yīng)機(jī)制及在火燒跡地營養(yǎng)物質(zhì)循環(huán)中發(fā)揮的作用有待進(jìn)一步研究。

4.2 Dactylellina屬可能是火后捕食線蟲真菌群落恢復(fù)的關(guān)鍵類群

此前研究表明，不同的微生物類群對火干擾的敏感性及火后環(huán)境適應(yīng)能力存在差異[30]，使得火后土壤微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著改變。本研究結(jié)果顯示，與非火燒地相比，火燒跡地捕食線蟲真菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化，僅檢出了Dactylellina屬捕食線蟲真菌，而在大部分生境中占據(jù)優(yōu)勢的Arthrobotrys屬在火燒地中未檢出，這與其他火燒跡地捕食線蟲真菌研究的結(jié)果一致[27,31]。有研究者認(rèn)為，可能是Arthrobotrys屬多占據(jù)土壤上層生態(tài)位[16]，在火燒過程中更容易被高溫殺死，除此之外，火燒還會大量清除土壤中的有機(jī)物，使得依賴分解有機(jī)物獲取營養(yǎng)的Arthrobotrys屬難以恢復(fù)；而Dactylellina屬真菌更多分布于深層土壤中[16]，由于土壤對熱量的傳導(dǎo)性較差，使火燒對Dactylellina屬的影響減弱，同時Dactylellina屬比Arthrobotrys屬真菌捕食線蟲的能力更強(qiáng)[23]，因此在火后獲取營養(yǎng)的途徑更廣，加上土壤上層生態(tài)位空間空缺，促使Dactylellina屬能夠在火燒后較短時間內(nèi)實現(xiàn)對土壤上層空間補(bǔ)位，生物量迅速恢復(fù)，替代了原有其他物種的生態(tài)功能[32]。因此，Dactylellina屬真菌可能更適應(yīng)火后劇烈變化的環(huán)境條件，是火燒后土壤捕食線蟲真菌類群即時生態(tài)恢復(fù)的關(guān)鍵類群，在火后恢復(fù)中扮演重要的角色，是驅(qū)動火后土壤微生物群落恢復(fù)的主要生物因素。

4.3 分布于深層土壤中的捕食線蟲真菌驅(qū)動了整個土壤捕食線蟲真菌群落的恢復(fù)

本研究在火燒跡地中分離出的三種捕食線蟲真菌也同時存在于非火燒地中，而與非火燒地相比，各個物種的恢復(fù)節(jié)律存在明顯差異。這體現(xiàn)了火燒引發(fā)的捕食線蟲真菌在物種水平上的生態(tài)位分化，即一方面在火因子的干擾下，資源環(huán)境在不同土層上具有明顯變化[13]；另一方面也說明各物種在生存需求、環(huán)境適應(yīng)和定植能力等方面均存在屬內(nèi)差異[16]。同時，Dactylellina屬在火后不同土層的檢出率變化表明土壤深層分布的該屬真菌驅(qū)動了捕食線蟲真菌群落的快速恢復(fù)?；诖耍P(guān)于火后土壤生態(tài)系統(tǒng)恢復(fù)策略的制定有必要將環(huán)境變化，以及土壤微生物在不同土層深度中的分布差異納入考慮。但是，目前對于火干擾后不同土層中微生物群落恢復(fù)節(jié)律及功能類群的研究還比較有限，火干擾后恢復(fù)效果的評估也缺乏相應(yīng)的參照標(biāo)準(zhǔn)，相關(guān)的研究亟待加強(qiáng)。