馬文爽, 杜 軍, 周學(xué)章

(寧夏大學(xué) 西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川 750021)

近平滑念珠菌(Candidaparapsilosis)是一種以酵母樣細(xì)胞和假菌絲兩種形態(tài)廣泛存在于自然界，人和哺乳動(dòng)物皮膚、黏膜表面，并且存在不同菌落形態(tài)轉(zhuǎn)化的一類人畜共患條件致病菌[1]，最早在1928年由Ashford從波多黎各一位腹瀉病人的糞便中分離得到[2]。念珠菌當(dāng)中白色念珠菌是主要致病菌，但近十年來，近平滑念珠菌和克柔念珠菌等非白念珠菌在臨床分離率逐漸提高。人醫(yī)臨床上，近平滑念珠菌在某些地區(qū)目前已經(jīng)成為第二甚至第一的侵襲性致病念珠菌[3]；獸醫(yī)臨床上，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)寧夏銀川市奶牛場(chǎng)的真菌性乳房炎調(diào)查發(fā)現(xiàn)，近平滑念珠菌是僅次于克柔念珠菌的主要致病念珠菌[4]。近年來，隨著廣譜抗生素、皮質(zhì)激素和免疫抑制劑等藥物以及侵入性臨床檢查或治療應(yīng)用的日益增多，人源近平滑念珠菌等非白念珠菌多重耐藥性越來越嚴(yán)重，已成為目前臨床上面臨的焦點(diǎn)問題。以往人源近平滑念珠菌對(duì)臨床常用的唑類藥物多為敏感, 但是近年來耐氟康唑、酮康唑、伊曲康唑和伏立康唑的近平滑念珠菌常常見諸報(bào)道[5]。已有研究報(bào)道表明，人源念珠菌的耐藥性主要由編碼羊毛甾醇14α-去甲基化酶(14α-demythylase, 14-DM)的ERG11基因產(chǎn)生突變或高表達(dá)，ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族(ATP-binding cassette transporters, ABC transporters)基因和易化擴(kuò)散載體超家族(major facilitator super family, MFS)基因及其轉(zhuǎn)錄因子MRR1(multi-resistance regulator)的高表達(dá)所導(dǎo)致的。近平滑念珠菌藥物外排泵包括ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族的念珠菌藥物耐藥基因1(Candida Drug Resistance gene 1,CDR1)、念珠菌藥物耐藥基因2(Candida Drug Resistance gene 2,CDR2)和易化擴(kuò)散載體超家族的多藥耐藥基因1(Multidrug resistance gene 1,MDR1)以及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子MRR1[6]。Berkow等[7]發(fā)現(xiàn)CDR1和MDR1的高表達(dá)與人源臨床近平滑念珠菌分離株對(duì)唑類耐藥性的產(chǎn)生有關(guān)。長(zhǎng)期以來國(guó)內(nèi)外獸醫(yī)臨床上的研究主要集中在念珠菌的分離鑒定、生物學(xué)活性、藥物聯(lián)用及開發(fā)上，對(duì)其耐藥機(jī)制研究不深入。因此，本研究針對(duì)近平滑念珠菌耐藥相關(guān)基因ERG11、MDR1、CDR1、MRR1進(jìn)行研究，以了解其與寧夏銀川市地區(qū)牛源近平滑念珠菌耐藥性的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 受試菌株 近平滑念珠菌(Candidaparapsilosis)質(zhì)控菌株ATCC22019購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)；牛源近平滑念珠菌試驗(yàn)菌株分離自寧夏銀川市患乳房炎奶牛的乳汁樣品。

1.1.2 培養(yǎng)基 CHROM agar念珠菌顯色培養(yǎng)基購(gòu)自上海欣中生物工程有限公司；YPD液體培養(yǎng)基、改良沙堡弱瓊脂培養(yǎng)基均購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 主要試劑與儀器設(shè)備 DN15-新型植物基因組DNA快速提取試劑盒、CV16-Zero Background pTOPO-Blunt Cloning Kit、DH5α感受態(tài)細(xì)胞均購(gòu)自北京艾德萊生物科技有限公司；2× Phanta Max Master Mix、HiScript III RT SuperMix、2× ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix均購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；RNAiso Reagent購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；氟康唑(FLC)、伊曲康唑(ITR)、酮康唑(KET)、5-氟胞嘧啶(5-FC)、兩性霉素B(AMB)均購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司。PCR反應(yīng)儀(22331 Hamburg,德國(guó)Eppendorf公司);實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(QuantStudio 5,美國(guó)ABI公司)；核酸電泳系統(tǒng)(Universal Hood II,美國(guó)Bio-Rad公司);基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)。

1.2 方法

1.2.1 近平滑念珠菌分離株的鑒定 在改良沙堡弱瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)并分離菌種，使用CHROM agar 念珠菌顯色培養(yǎng)基進(jìn)行初步篩選，以近平滑念珠菌質(zhì)控菌株ATCC22019為參照，將篩選出的白至粉色菌落最終采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜進(jìn)行鑒定。

1.2.2 體外藥物敏感性試驗(yàn) 用滅菌蒸餾水將氟康唑溶解成128 mg/mL的儲(chǔ)存液，采用DMSO將伊曲康唑、酮康唑、兩性霉素B、5-氟胞嘧啶分別溶解成1.6、1.6、3.2、12.8 mg/mL的儲(chǔ)存液；參照CLSI M27-A3推薦的微量稀釋法[8]，采用96孔板對(duì)試驗(yàn)菌株進(jìn)行體外藥物敏感性試驗(yàn)，從中篩選出氟康唑的耐藥(R)、劑量依賴(SDD)及敏感(S)菌株。近平滑念珠菌耐藥性的判斷標(biāo)準(zhǔn)：氟康唑最小抑菌濃度(MIC)≤0.5 μg/mL為S，0.5～4 μg/mL為SDD，≥4 μg/mL為R；伊曲康唑MIC≤0.125 μg/mL為S，0.125～0.5 μg/mL為SDD，≥0.5 μg/mL為R；酮康唑MIC≤0.03 μg/mL為S，0.03～0.25 μg/mL為SDD，≥0.25 μg/mL為R；5-氟胞嘧啶MIC≤0.06 μg/mL為S，0.06～0.25 μg/mL為SDD，≥0.25 μg/mL為R；兩性霉素B MIC≤0.25 μg/mL為S，0.25～2 μg/mL為SDD，≥2 μg/mL為R。

1.2.3ERG11基因突變檢測(cè) 按照DN15-新型植物基因組DNA快速提取試劑盒說明書，對(duì)在YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h的近平滑念珠菌試驗(yàn)菌株和質(zhì)控菌株ATCC22019提取基因組DNA。根據(jù)GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄號(hào)GQ302972為已知序列設(shè)定引物1對(duì)(表1)[9]。經(jīng)回收純化后的目的基因片段連接到CV16零背景平末端克隆載體上，然后轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，白色菌落經(jīng)PCR檢測(cè)后送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。PCR反應(yīng)參數(shù): 第一階段：94 ℃預(yù)變性3 min；第二階段：變性95 ℃ 15 s、退火60 ℃ 15 s、延伸72 ℃ 60 s，共35次循環(huán)；第三階段：72 ℃終延伸8 min；4 ℃保存。PCR反應(yīng)體系總體積為25 μL，包括DNA 模版1 μL，上下游引物各0.5 μL，2 × Phanta Max Master Mix 12.5 μL，蒸餾水10.5 μL。

1.2.4ERG11、MDR1、CDR1、MRR1基因表達(dá)水平定量測(cè)定 按照RNAiso Reagent說明書的步驟對(duì)在YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h的近平滑念珠菌試驗(yàn)菌株與質(zhì)控菌株ATCC22019提取基因組RNA。根據(jù)GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中近平滑念珠菌ERG11、MDR1、CDR1、MRR1基因序列信息設(shè)計(jì)引物4對(duì)(表1)。按照HiScript III RT Super Mix試劑盒說明，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用4對(duì)引物對(duì)近平滑念珠菌ERG11、MDR1、CDR1、MRR1進(jìn)行Realtime PCR擴(kuò)增。Realtime PCR反應(yīng)參數(shù): 預(yù)變性：95 ℃ 3 min；循環(huán)反應(yīng)：95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s，共40次循環(huán)；溶解曲線：95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s、95 ℃ 15 s。Realtime PCR反應(yīng)體系總體積為20 μL，包括cDNA模版1 μL，上下游引物各0.5 μL，2× ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，蒸餾水8 μL。收集熒光數(shù)據(jù)并使用QuantStudio設(shè)計(jì)分析軟件1.3.1進(jìn)行分析。

表1 近平滑念珠菌ERG11、MDR1、CDR1、MRR1基因引物Table 1 The primers for amplification of C.parapsilosis ERG11、MDR1、CDR1、MRR1 genes

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)使用 GraphPad Prism 8 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 近平滑念珠菌分離株的鑒定結(jié)果

收集寧夏銀川地區(qū)6個(gè)奶牛場(chǎng)中327份乳房炎臨床乳汁樣品，并在改良沙堡弱瓊脂培養(yǎng)基上涂布培養(yǎng)，將在該培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)的臨床菌株接種至CHROM agar念珠菌顯色培養(yǎng)基上培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)13株菌落呈白色略帶粉色，初步鑒定為近平滑念珠菌，通過MALDI-TOFMS鑒定[10]，確定其中的12株為近平滑念珠菌(CP1～CP12)并做為試驗(yàn)菌株，1株為其他念珠菌。

2.2 藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

采用藥敏試驗(yàn)檢測(cè)5種臨床常用抗真菌藥物對(duì)12株牛源近平滑念珠菌試驗(yàn)菌株的MIC，以近平滑念珠菌ATCC22019作為質(zhì)控菌株控制整個(gè)試驗(yàn)條件。藥敏結(jié)果顯示，12株試驗(yàn)菌株對(duì)氟康唑的敏感率為41.7%，對(duì)酮康唑敏感率為50%，對(duì)伊曲康唑敏感率為58.3%，對(duì)5-氟胞嘧啶的敏感率為75%，對(duì)兩性霉素B敏感率為83.3%。12株試驗(yàn)菌株中有5株對(duì)氟康唑耐藥，2株為劑量依賴，5株敏感。12株試驗(yàn)菌株對(duì)5-氟胞嘧啶、兩性霉素B的敏感率均高于75%，對(duì)唑類藥物的耐藥率均高于50%，其中對(duì)氟康唑的耐藥率最高，達(dá)58.3%(表2)。將12株試驗(yàn)菌株分為氟康唑耐藥組、劑量依賴組和敏感組開展后續(xù)試驗(yàn)。

表2 近平滑念珠菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of antimicrobial susceptibility tests of C.parapsilosis isolates (n=12)

2.3 ERG11基因突變檢測(cè)結(jié)果

對(duì)12株近平滑念珠菌試驗(yàn)菌株與近平滑念珠菌質(zhì)控菌株ATCC22019基因組DNA中的ERG11基因進(jìn)行雙向測(cè)序。測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與質(zhì)控菌株ATCC22019相比，12株試驗(yàn)菌株中共檢測(cè)到2個(gè)基因突變位點(diǎn)，12株試驗(yàn)菌株均檢測(cè)到錯(cuò)義突變A395T，5株氟康唑耐藥株和1株劑量依賴株檢測(cè)到了同義突變T591C(表3)。說明同義突變T591C可能與近平滑念珠菌對(duì)氟康唑耐藥性的產(chǎn)生有關(guān)。

表3 近平滑念珠菌ERG11基因突變結(jié)果Table 3 ERG11 gene point mutations in C.parapsilosis clinical isolates (n=12)

2.4 ERG11、MDR1、CDR1、MRR1基因表達(dá)水平結(jié)果

對(duì)獲得的12株近平滑念珠菌試驗(yàn)菌株與質(zhì)控菌株ATCC22019基因組RNA進(jìn)行Realtime PCR擴(kuò)增。統(tǒng)計(jì)分析實(shí)時(shí)熒光定量PCR試驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)顯示，氟康唑耐藥組ERG11基因表達(dá)水平顯著高于劑量依賴組和敏感組(P=0.000 7和P=0.001 9)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；氟康唑耐藥組CDR1基因表達(dá)水平顯著高于敏感組(P=0.003 6)，與劑量依賴組表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；氟康唑耐藥組MDR1基因表達(dá)水平顯著高于劑量依賴組和敏感組(P<0.000 1和P=0.000 3)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；氟康唑耐藥組MRR1基因表達(dá)水平顯著高于劑量依賴組和敏感組(P<0.000 1和P=0.002 4)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1～4)。說明ERG11、CDR1、MDR1、MRR1基因的高表達(dá)可能在牛源近平滑念珠菌對(duì)氟康唑耐藥性的產(chǎn)生中起到一定的作用。

圖1 近平滑念珠菌ERG11 mRNA的表達(dá)量(A)和ERG11 基因在氟康唑耐藥組、劑量依賴組和敏感組的表達(dá)量(B)Fig.1 Expression amount of ERG11 mRNA in C.parapsilosis isolates(A) and Expression amount of ERG11 mRNA in three groups of C.parapsilosis clinical isolates(B)NS表示與陰性對(duì)照相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，*表示與陰性對(duì)照相比差異顯著(P<0.05)，**表示與陰性對(duì)照相比差異極顯著(P<0.01)，***表示與陰性對(duì)照相比差異極顯著(P<0.001)，****表示與陰性對(duì)照相比差異極顯著(P<0.000 1)(下同)NS indicates no statistical significance compared with negative control, * indicated significant difference compared with negative control (P<0.05), ** indicated extremely significant difference compared with negative control (P<0.01), *** indicated extremely significant difference compared with negative control (P<0.001), **** indicated extremely significant difference compared with negative control (P<0.000 1)(The same follow)

圖2 近平滑念珠菌CDR1 mRNA的表達(dá)量(A)和CDR1基因在氟康唑耐藥組、劑量依賴組和敏感組的表達(dá)量(B)Fig.2 Expression amount of CDR1 mRNA in C.parapsilosis isolates (A) and Expression amount of CDR1 mRNA in three groups of C.parapsilosis clinical isolates(B)

圖3 近平滑念珠菌MDR1 mRNA的表達(dá)量(A)和MDR1基因在氟康唑耐藥組、劑量依賴組和敏感組的表達(dá)量(B)Fig.3 Expression amount of MDR1 mRNA in C.parapsilosis isolates(A) and Expression amount of MDR1 mRNA in threegroups of C.parapsilosis clinical isolates(B)

圖4 近平滑念珠菌MRR1 mRNA的表達(dá)量(A)和MRR1基因在氟康唑耐藥組、劑量依賴組和敏感組的表達(dá)量(B)Fig.4 Expression amount of MRR1 mRNA in C.parapsilosis isolates(A) and Expression amount of MRR1 mRNA in three groups of C.parapsilosis clinical isolates(B)

3 討 論

氟康唑是目前臨床上使用最廣泛的抗真菌藥物。然而，氟康唑是一種抑菌劑，不能直接殺死真菌，這就為菌株耐藥性產(chǎn)生和發(fā)展提供了有利條件。隨著氟康唑大量、長(zhǎng)期的應(yīng)用于防治念珠菌感染，念珠菌的耐藥程度越來越嚴(yán)重，耐藥性越來越普遍，并且臨床菌株常常會(huì)產(chǎn)生交叉耐藥，使念珠菌感染防治更為棘手。本研究中牛源近平滑念珠菌對(duì)5種臨床常用的抗真菌藥物均存在一定的耐藥性，并且耐藥現(xiàn)象發(fā)生普遍。12株近平滑念珠菌試驗(yàn)株對(duì)5-氟胞嘧啶、兩性霉素B的敏感率均高于75%，對(duì)唑類藥物的耐藥率均高于50%，其中氟康唑的耐藥率最高，達(dá)58.3%。因此獸醫(yī)臨床耐藥性檢測(cè)十分必要，耐藥性念珠菌有可能通過食物鏈傳播給人類，對(duì)人類的健康造成威脅，尤其對(duì)患有慢性疾病和免疫力低下者的危害更大。藥敏試驗(yàn)結(jié)果提示，牛源近平滑念珠菌對(duì)唑類耐藥率高且具有多重耐藥性，但獸醫(yī)臨床不使用抗真菌和免疫抑制劑等藥物，其抗真菌藥物耐藥性如何獲得、多重耐藥性如何產(chǎn)生以及與大量使用廣譜抗生素之間是否存在關(guān)聯(lián)，是值得探究的一個(gè)問題。

念珠菌耐藥不僅與藥物作用的靶酶基因突變或過表達(dá)有關(guān)，而且與外排泵基因突變或高表達(dá)及生物膜形成等有關(guān)。念珠菌中麥角固醇的合成與ERG3、ERG11基因有關(guān)，其突變或高表達(dá)可引起耐藥[11]。Magobo等[12]發(fā)現(xiàn)大部分耐氟康唑的人源近平滑念珠菌臨床分離株中ERG11序列存在錯(cuò)義突變A395T(Y132F)，而且這些存在Y132F突變的分離株比由其他耐藥機(jī)制引起的耐唑類菌株更容易引起克隆傳播[13]。Corzo-Leon等[14]對(duì)12株耐氟康唑的人源近平滑念珠菌的ERG11基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)，其均存在T591C同義突變，部分存在A395T錯(cuò)義突變。本研究通過對(duì)牛源近平滑念珠菌試驗(yàn)菌株ERG11基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)兩個(gè)突變位點(diǎn)，錯(cuò)義突變A395T存在于所有試驗(yàn)菌株中，同義突變T591C只在耐藥株和劑量依賴株上被檢測(cè)到，猜測(cè)寧夏銀川地區(qū)牛源近平滑念珠菌中Y132F突變?cè)贓RG11基因中可能出現(xiàn)了克隆傳播，而同義突變T591C可能在牛源近平滑念珠菌對(duì)氟康唑抗性的產(chǎn)生中起了一定作用，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步探究。對(duì)ERG11基因mRNA表達(dá)量的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，氟康唑耐藥組ERG11基因表達(dá)量較高，且表達(dá)水平顯著高于劑量依賴組和敏感組[15]，說明寧夏銀川地區(qū)牛源近平滑念珠菌中ERG11基因的高表達(dá)與其耐藥性存在相關(guān)性，同樣的結(jié)論在光滑念珠菌、熱帶念珠菌、都柏林念珠菌和克柔念珠菌上也得到印證，但也有研究發(fā)現(xiàn)近平滑念珠菌氟康唑耐藥株中ERG11基因的表達(dá)是下調(diào)的[16]，說明近平滑念珠菌ERG11基因的高表達(dá)不是其耐藥性的唯一因素。

藥物外排泵包括ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族和主要易化擴(kuò)散載體超家族。這些外排泵存在于所有細(xì)胞生物體中，參與保護(hù)細(xì)胞免受有害物質(zhì)的損傷，他們的過表達(dá)與微生物多藥耐藥表型相關(guān)。研究已證實(shí)，白色念珠菌、都柏林念珠菌CDR1和MDR1高表達(dá)與其氟康唑耐藥性相關(guān)[17-18]；近平滑念珠菌CDR1和MDR1高表達(dá)與其氟康唑耐藥性也相關(guān)[19-20]。本研究對(duì)CDR1、MDR1mRNA表達(dá)量的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，氟康唑耐藥組CDR1基因表達(dá)水平顯著高于敏感組，MDR1基因表達(dá)水平顯著高于劑量依賴組和敏感組，其結(jié)果與以上研究報(bào)道相一致。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的突變或高表達(dá)可以上調(diào)藥物外排泵和麥角固醇生物合成酶，從而使菌株表現(xiàn)出耐藥性，此類研究已在白色念珠菌、光滑念珠菌和近平滑念珠菌上得到了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的支持[21-23]。本研究對(duì)MRR1mRNA 表達(dá)量的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，氟康唑耐藥組MRR1基因表達(dá)水平顯著高于劑量依賴組和敏感組，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述研究相符合。

綜上所述，本研究中寧夏銀川地區(qū)牛源近平滑念珠菌對(duì)唑類抗真菌藥物的耐藥率較高且具有多重耐藥性。ERG11基因中的T591C突變以及ERG11、CDR1、MDR1、MRR1基因的高表達(dá)都可能在牛源近平滑念珠菌氟康唑耐藥性的產(chǎn)生中起到一定的作用?；诒狙芯康脑囼?yàn)數(shù)據(jù)，后續(xù)將針對(duì)近平滑念珠菌細(xì)胞外磷脂酶活力與其氟康唑耐藥性之間的關(guān)系，棘白菌素類不敏感株與其靶酶基因FKS突變及高表達(dá)相關(guān)性等方面進(jìn)行研究，為進(jìn)一步指導(dǎo)獸醫(yī)臨床預(yù)防奶牛真菌性乳房炎提供參考。