張偉溪 王顏波,2 丁昌俊 朱文旭,3 蘇曉華

(1.林木遺傳育種國家重點實驗室 國家林業(yè)和草原局林木培育重點實驗室 中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所 北京 100091；2.南昌工程學(xué)院 南昌 330099； 3.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 沈陽 110866)

自從Parsons等(1986)證實楊樹(Populus)可以進行遺傳轉(zhuǎn)化、外源基因可在林木細胞中表達以來，林木基因工程研究已經(jīng)取得長足發(fā)展。據(jù)統(tǒng)計，全球至少有35個國家對百余個樹種進行了遺傳轉(zhuǎn)化研究，其中楊樹、番木瓜(Carica)、松樹(Pinus)、柳樹(Salix)、核桃(Juglans)、蘋果(Malus)、櫻桃(Cerasus)、樟樹(CinnamomumSect.Camphora)、懸鈴木(Platanus)、桉樹(Eucalyptus)、云杉(Picea)、美國栗(Castaneadentata)、美國榆(Ulmusamericana)等200多個轉(zhuǎn)基因林木已進入田間試驗階段或已批準商品化(FAO，2004;Straussetal.,2011;Sedjo,2005;Klockoetal.,2018;Muhretal.,2018;Changetal.,2018;康向陽，2020)。轉(zhuǎn)基因林木的改良性狀主要集中在抗病、抗蟲等抗生物脅迫，抗除草劑，抗旱、耐鹽等抗非生物脅迫，降低木質(zhì)素合成、增加纖維素合成等材性改良以及發(fā)育調(diào)控等方面(Londoetal.,2010)。由此可見，轉(zhuǎn)基因林木主要應(yīng)用于木材生產(chǎn)或在生態(tài)景觀建設(shè)等方面，并不像轉(zhuǎn)基因作物一樣直接或間接涉及人類生命安全相關(guān)問題。但是，轉(zhuǎn)基因林木的環(huán)境釋放及推廣應(yīng)用的潛在生態(tài)風(fēng)險仍不容忽視，其生態(tài)安全性監(jiān)測仍需持續(xù)跟蹤進行，以便有效地規(guī)避其生態(tài)安全問題，從而加速轉(zhuǎn)基因林木的商業(yè)化應(yīng)用和推廣。因此，加強轉(zhuǎn)基因生物安全的基礎(chǔ)研究，提高對轉(zhuǎn)基因生物安全性評價水平，制定有效的生態(tài)風(fēng)險監(jiān)測和管理策略尤為重要。

目前，轉(zhuǎn)基因植物生態(tài)安全評估主要集中在轉(zhuǎn)基因植物外源基因逃逸以及對生態(tài)系統(tǒng)的影響方面(Londoetal.,2010;Richardsonetal.,2011)，如外源基因可能存在通過花粉、種子以及無性繁殖器官等媒介向其近緣種或其他生物群體進行基因漂移和水平轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(Wangetal.,2018;Klockoetal.,2018)。土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的一個重要組成部分，參與土壤結(jié)構(gòu)形成、分解有機質(zhì)和礦物質(zhì)，與植物根部營養(yǎng)吸收密切相關(guān)。因此，轉(zhuǎn)基因植物的外源基因可能通過水平轉(zhuǎn)移整合到土壤微生物的基因組中，從而改變其遺傳特性與功能(Luetal.,2018)。例如，轉(zhuǎn)基因西瓜(Citrulluslanatus)中35S啟動子基因存在向土壤微生物轉(zhuǎn)移的可能(Keese,2008)，在轉(zhuǎn)Bt玉米(Zeamays)、棉花(Gossypium)等作物的土壤中檢測到了不同水平的Bt 蛋白(Stotzky,2005;Icozetal.,2008)。但也有研究發(fā)現(xiàn)，外源基因發(fā)生水平轉(zhuǎn)移的頻率低于自然轉(zhuǎn)化的頻率，從而給環(huán)境帶來的風(fēng)險可以忽略(Keese,2008)，如對成熟期雄性轉(zhuǎn)Bt基因歐洲黑楊(Populusnigra)人工林基因流頻率和距離研究發(fā)現(xiàn)，距轉(zhuǎn)Bt楊樹人工林0 m處產(chǎn)生Bt種子的頻率為0～0.15%，500 m處產(chǎn)生Bt種子的頻率為0～0.02%，在自然條件下，轉(zhuǎn)Bt楊樹人工林通過花粉或種子產(chǎn)生的基因流水平極低(Huetal.,2017)。另外，外源基因表達對轉(zhuǎn)基因植物目標性狀改變有可能影響相關(guān)代謝途徑產(chǎn)物的積累，從而通過植物落葉、根系等對根際土壤微生物及其群落的多樣性產(chǎn)生潛在影響(Dauduetal.,2009;Gaoetal.,2014)。如轉(zhuǎn)基因水稻(Oryzasativa)生長旺盛時期土壤中細菌數(shù)量顯著增加(陳曉雯等,2011);轉(zhuǎn)MdSOS2L1基因蘋果(Malusdomestica)植株根際微生物多樣性研究表明，轉(zhuǎn)基因與野生型植株根際微生物群落豐富度和多樣性存在較大差異，轉(zhuǎn)MdSOS2L1植株根際酸桿菌門(Acidobacteria)豐度增加較多，藍藻門(Cyanophyta)、放線菌門(Actinobacteria)豐度略有下降，同時，轉(zhuǎn)基因植株根際土壤的蘋果酸、檸檬酸、草酸含量明顯升高，轉(zhuǎn)基因植株根際微生物的差異極有可能與MdSOS2L1基因介導(dǎo)的有機酸分泌有關(guān)(王曉娜等，2018)。因此，土壤微生物的種類和數(shù)量通?？勺鳛檗D(zhuǎn)基因植物生態(tài)安全性檢測的重要指標。目前有關(guān)轉(zhuǎn)基因植物系統(tǒng)生態(tài)安全性監(jiān)測研究多集中在大豆(Glycinemax)、玉米、棉花、水稻等農(nóng)作物方面(Icozetal.,2008;Keetal.,2014;Lietal.,2017)。轉(zhuǎn)基因林木雖有研究，但多以苗期或幼齡的轉(zhuǎn)Bt、Cry1A、Cry3A等基因林木為主，并未發(fā)現(xiàn)外源基因向土壤微生物轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象(胡建軍等,2004;侯英杰等,2009;魏冰等,2009;張雁等,2012;李霞等,2011;Tranetal.,2018;Zuoetal.,2018;孫偉博等,2020)，對成齡期轉(zhuǎn)基因林木監(jiān)測研究較少(Zhuetal.,2016;朱文旭等,2017;Huetal.,2017;呂威等,2018)。與集約化程度較高的農(nóng)作物相比，轉(zhuǎn)基因林木栽培環(huán)境復(fù)雜、生長周期長、經(jīng)營管理相對粗放，且多為風(fēng)媒傳粉，因此，對成齡期轉(zhuǎn)基因林木試驗林的土壤微生物進行長期持續(xù)性監(jiān)測非常必要。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選取轉(zhuǎn)抗逆轉(zhuǎn)錄因子基因(JERF36)銀中楊(Populusalba×P.berolinensis)——抗逆1號楊(ABJ01)及非轉(zhuǎn)基因銀中楊(9#，對照)為研究材料，抗逆1號楊(ABJ01)是本實驗室早期通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將連有35S啟動子和NOS終止子的JERF36基因?qū)脬y中楊中，并且通過PCR、RT-PCR、Southern 雜交等分子檢測獲得外源基因成功整合并穩(wěn)定表達的轉(zhuǎn)基因銀中楊，其中JERF36基因是從番茄(Lycopersiconesculentum)中克隆獲得的茉莉酸乙烯應(yīng)答元件基因，編碼AP2/EREBP類植物轉(zhuǎn)錄因子，能專一結(jié)合GCC-box，在植物中能夠激活下游抗逆相關(guān)基因表達，提高抗逆性。報告基因nptⅡ來自于細菌，編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶，能賦予細胞抗卡那霉素能力(Lietal.,2009)。抗逆1號楊已獲得環(huán)境釋放及生產(chǎn)性試驗行政許可，與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ障啾?，其形態(tài)未發(fā)生明顯變化，抗旱耐鹽性顯著提高，于2015年獲得國家植物新品種保護權(quán)。

1.2 試驗地概況及樣品采集

試驗林位于北京市房山區(qū)韓村河?xùn)|營苗圃(115°58′E，39°37′N)，2006年春季造林，轉(zhuǎn)基因株系及其對照均按隨機區(qū)組，正方形種植100株(行10 株、列10 株)，株行距為2 m × 2 m，造林總面積為0.66 hm2。試驗地的地勢、地貌、氣溫、降雨、植被、栽培管理等自然條件和人為管理均一致，整個試驗階段林地不進行任何肥水及噴施農(nóng)藥管理。

分別于2015年5—8月、2016年5—10月及2017年5—10月每月中旬取樣1次，選擇連續(xù)3天以上晴天的上午在試驗林地內(nèi)使用土鉆鉆取非根際土壤。隨機選取抗逆1號楊(ABJ01)和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?9#)各3株進行取樣，以植株為中心，每株選取與主干50 cm距離的東南西北4個點進行取土，去除表層腐殖質(zhì)層，留取 10～20 cm土柱，將土樣中的石塊和植物的根殘體等雜物去掉，裝入無菌的封口袋中混合均勻，放在冰盒內(nèi)帶回實驗室，4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。該土壤樣品用于研究微生物?shù)量變化。2017年7月分別隨機選取抗逆1號楊(ABJ01)和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?9#)各10株采集幼嫩葉片，并按非根際土壤取樣方法采集林下雜草，每種雜草取2～3片葉子混合；同時采集試驗林地旁(約10 m)行道樹毛白楊(Populustomentosa)、歐美楊(Populus×euramericana)雌株樹下自然生長的實生楊樹幼苗葉片，延路每隔10 m取1次樣品，取樣10次，每株楊樹幼苗取3～5片葉子混合。樣品用冰盒帶回實驗室，置于-80 ℃ 低溫冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試驗方法

1.3.1 植物及土壤基因組DNA的提取 采用 DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen,Germany)提取抗逆1號楊(ABJ01)、非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?9#)、林下雜草以及試驗林旁行道樹下楊樹幼苗葉片基因組DNA；使用 PowerSoil? DNA Isolation Kit(Mobio,America)提取2017年7月非根際土壤中微生物的總DNA，具體操作參照試劑盒使用手冊。

1.3.2 細菌基因組DNA的提取 選取2017年7月采集的抗逆1號楊(ABJ01)、非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?9#)土壤樣本的10-1土壤懸濁液涂布在含卡那霉素濃度50 mg·L-1的細菌選擇培養(yǎng)基平板中篩選抗性菌株，共獲得2株。分別挑取其單菌落使用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，吸取5 mL處于對數(shù)生長期的菌液5 000 r·min-1離心1 min，棄上清。采用細菌基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN,China)提取2個菌株的基因組DNA。

1.3.3 土壤及細菌DNA質(zhì)量檢測 以土壤微生物總DNA和細菌DNA為模板，去離子水為陰性對照。以細菌16S rRNA通用引物(上游引物：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′；下游引物：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)進行PCR擴增，反應(yīng)條件為94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，預(yù)期擴增片段長度為468 bp。

1.3.4 外源基因水平轉(zhuǎn)移情況檢測 以上述提取的所有DNA為模板，質(zhì)粒DNA為陽性對照，去離子水為陰性對照。根據(jù)JERF36序列設(shè)計特異引物(上游引物：5′-CTCCCTTGAACATTGCTTG-3′；下游引物：5′-TGATTGCCCGTCAACATAC-3′)進行PCR擴增，反應(yīng)條件為95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共30個循環(huán)；最后72 ℃ 延伸10 min，預(yù)期擴增片段長度為278 bp。

1.3.5 土壤微生物數(shù)量測定 采用稀釋平板法培養(yǎng)土樣中的細菌、真菌、放線菌。稱取 10 g 土壤樣品倒入裝有90 mL無菌水和無菌小玻璃珠(10粒)的三角瓶中，置于搖床上(200 r·min-1)室溫振蕩30 min，隨后用無菌水稀釋土壤懸濁液(使用移液槍準確吸取0.1 mL土壤懸浮液注入0.9 mL的無菌水中即得到終濃度為10-1土壤懸濁液)，其中，細菌稀釋液終濃度分別為10-3、10-4、10-5的土壤懸濁液，放線菌稀釋液終濃度分別為10-2、10-3、10-4的土壤懸濁液，真菌稀釋液終濃度分別為10-1、10-2、10-3的土壤懸濁液。吸取50 μL稀釋懸濁液均勻涂在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(培養(yǎng)細菌)、馬丁(Martin)孟加拉紅-鏈霉素培養(yǎng)基(培養(yǎng)真菌)、改良淀粉銨鹽培養(yǎng)基(培養(yǎng)放線菌)上，放線菌置于28 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)，細菌和真菌置于35 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)。2天后統(tǒng)計真菌的菌落數(shù)，2～4天后統(tǒng)計細菌的菌落數(shù)，5天左右統(tǒng)計放線菌菌落數(shù)。每個菌種每個濃度培養(yǎng)3次。同時稱取50 g的待測土樣，用牛皮紙信封裝好，放于烘箱中，105 ℃烘烤，烘至恒質(zhì)量后稱質(zhì)量，計算土壤含水量，從而計算出每克干土中土壤微生物的菌落數(shù)，菌落數(shù)=(菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù))/[接種量毫升數(shù)×(1-含水量)]。采用SPSS 17.0 軟件進行方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源基因JERF36的水平轉(zhuǎn)移

采用外源基因JERF36的特異性引物分別對抗逆1號楊(ABJ01)、非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?9#)、林下雜草、林下土壤、試驗林旁行道樹下楊樹實生苗葉片、土壤中篩選出的抗性菌株基因組DNA進行PCR檢測(圖1A)，采用細菌16S rRNA通用引物對林下土壤、土壤中篩選出的抗性菌株基因組DNA進行PCR檢測(圖1B)。結(jié)果顯示，在抗逆1號楊(ABJ01)的基因組DNA中能擴增出JERF36目的片段(278 bp)，而非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?9#)、林下雜草、林下土壤、試驗林旁行道樹下楊樹實生苗葉片以及2個抗性菌株基因組DNA均沒得到擴增產(chǎn)物，且在土壤及菌株DNA，均能檢測到微生物DNA，說明土壤及抗性菌株基因組DNA質(zhì)量合格。以上說明種植11年后，JERF36基因仍穩(wěn)定存在于轉(zhuǎn)基因植株基因組中，并未發(fā)現(xiàn)向林地土壤、周邊雜草等發(fā)生水平轉(zhuǎn)移。

圖1 外源基因JERF36 PCR檢測Fig.1 PCR detection of exogenous gene JERF36A:外源基因JERF36 PCR檢測(1：非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?#；2：林下雜草；3：林下土壤總DNA；4：試驗林旁行道樹下楊樹實生苗葉片；5：抗性菌株1；6：抗性菌株2；7：轉(zhuǎn)基因植株ABJ01；CK+：質(zhì)粒陽性對照；CK-：去離子水陰性對照)；B:16S rRNA PCR檢測(H：去離子水陰性對照；1：林下土壤總DNA 1；2：林下土壤總DNA 2；3：抗性菌株1；4：抗性菌株2；M：DNA marker)。A:PCR detection of exogenous gene JERF36 (1:Non-transgenic control 9#;2:Understory weed;3:Total DNA in soil;4:Seedling leaves of roadside poplar beside the test field;5:Kanamycin-resistant strain 1;6:Kanamycin-resistant strain 2;7:Transgenic poplar ABJ01;CK+:Plasmid positive control;CK-:Deionized water negative control);B:PCR detection of 16S rRNA(M:DNA marker;H:Deionized water negative control;1:Total DNA in soil 1;2:Total DNA in soil 2;3:Kanamycin-resistant strain 1;4:Kanamycin-resistant strain 2).

2.2 林下土壤微生物的數(shù)量

分別對9年生(2015年)、10年生(2016年)、11年生(2017年)抗逆1號楊(ABJ01)及非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?9#)林下土壤中微生物總數(shù)量進行檢測并統(tǒng)計分析(圖2A)。3年連續(xù)性觀測顯示，各年份成齡抗逆1號楊與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ臻g林下土壤中微生物總數(shù)量均無顯著差異；不同年份間的抗逆1號楊和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏牧窒峦寥牢⑸飻?shù)量均略有差異，但無明顯變化規(guī)律。其中6—8月是土壤中微生物快速增長期，其總量呈現(xiàn)2015年>2016年>2017年；而3個年份間6—8月氣溫并無顯著差異(圖2B)，但降雨天數(shù)差異明顯且呈現(xiàn)2015年(44天)>2016年(37天)>2017年(31天)(圖2B)。在2016年和2017年的9—10月土壤中微生物總量、氣溫迅速下降，但在2016年9—10月的降雨天數(shù)維持穩(wěn)定，2017年降雨天數(shù)先下降后上升，2017年9—10月試驗林中土壤微生物總數(shù)量顯著高于2016年。由此推測可能由于降雨差異導(dǎo)致土壤濕度變化，進而造成不同年份間抗逆1號楊和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏牧值赝寥牢⑸飻?shù)量差異，而抗逆1號楊未對林地土壤微生物總量造成影響。

圖2 9～11年生(2015—2017年)楊樹林地土壤微生物總數(shù)量以及不同月份氣溫和降雨天數(shù)Fig.2 Total number of microorganisms of 9-11 year-old(2015-2017)poplar test field and the temperature and raining days in different months9#:非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?ABJ01:轉(zhuǎn)基因植株。下同。不同小寫字母表示不同月份微生物數(shù)量在0.05水平上存在顯著性差異;“*”表示不同年份間微生物數(shù)量在0.05水平上存在顯著性差異。9#:Non-transgenic plants;ABJ01:Transgenic plants.The same below.Different lowercase letters indicate significant differences in the number of microorganisms in different months at the 0.05 level;“*”means significant differences in the number of microorganisms in different years at the 0.05 level.

分別對9年、10年、11年生抗逆1號楊(ABJ01)及非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?9#)林地土壤中細菌、真菌和放線菌數(shù)量進行檢測并統(tǒng)計分析(圖3)。結(jié)果表明：9年、10年、11年生抗逆1號楊和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ樟值赝寥?大類微生物數(shù)量在樹木生長季呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢，其中在生長旺季的7月和8月林地土壤微生物數(shù)量最高，顯著高于開始生長階段(5月和6月)和停止生長階段(9月和11月)。3個年份中，細菌和放線菌的數(shù)量均在每年的8月達到最高值；9年生、10年生抗逆1號楊和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ樟值赝寥乐姓婢鷶?shù)量也在8月達到最高值，11年生的林地土壤中真菌數(shù)量在7月峰值最高。抗逆1號楊與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ臻g林地土壤中3大類微生物數(shù)量均無顯著差異，變化趨勢一致。表明抗逆1號楊未對林地土壤中細菌、真菌和放線菌數(shù)量造成影響，而其中的微小差異可能是由氣候等其他因素造成的。

圖3 9～11年生(2015—2017年)林地土壤細菌、真菌和放線菌數(shù)量Fig.3 Total numbers of bacteria,actinomycetes,and fungi in soil of 9-11 years old (2015—2017)poplar test fieldA：9年生楊樹5—8月土壤微生物數(shù)量；B：10年生楊樹5—10月土壤微生物數(shù)量；C：11年生楊樹5—10月土壤微生物數(shù)量。不同小寫字母表示不同月份微生物數(shù)量在0.05水平上存在顯著性差異。A：Total number of soil microorganisms in 9-year-old poplar plantation from May to August;B：Total number of soil microorganisms in 10-year-old poplar plantation from May to October;C：Total number of soil microorganisms in 11-year-old poplar plantation from May to October.Different lowercase letters indicate significant differences in the number of microorganisms in different months at the 0.05 level.

通過對不同年份間細菌、真菌和放線菌的比例分析(圖4)發(fā)現(xiàn)，3個年份中，抗逆1號楊和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ樟值赝寥乐?類微生物的比例相似，從高到低依次是細菌、放線菌和真菌；不同年份間3類微生物所占比例略有差異，但并沒有出現(xiàn)某一類微生物急速增加或降低的現(xiàn)象。說明抗逆1號楊并沒有破壞主要微生物種類之間的平衡。

圖4 不同年份(2015—2017年)林地土壤中微生物比例Fig.4 Proportions of microorganisms in plantation soil in different years(2015—2017)不同小寫字母表示不同年份間微生物比例在0.05水平上存在顯著性差異。The different lowercase letters mean significant deference of the microbial proportion in different years at the 0.05 level.

綜上所述，對試驗林內(nèi)抗逆1號楊與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ赵诔升g期后的連續(xù)監(jiān)測顯示，試驗林地土壤微生物的數(shù)量和種類平衡并未發(fā)現(xiàn)顯著變化，而環(huán)境變化如降雨差異可能是不同年份微生物數(shù)量差異的主要原因，抗逆1號楊與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ樟值匚⑸飻?shù)量略微差異需要結(jié)合環(huán)境因素做進一步研究分析。

3 討論

隨著越來越多轉(zhuǎn)基因植物的大面積田間種植，其對生態(tài)環(huán)境的影響一直備受矚目。而外源基因在轉(zhuǎn)基因受體植物中，特別是多年生林木中是否會發(fā)生逃逸現(xiàn)象是檢測轉(zhuǎn)基因植物安全性的首要問題(Frankenhuyzenetal.,2004)。盡管早期研究發(fā)現(xiàn)一些轉(zhuǎn)基因林木中存在外源基因沉默現(xiàn)象(Jouaninetal.,2000;Kumaretal.,2001)，但眾多研究表明外源基因能在轉(zhuǎn)基因林木中穩(wěn)定存在并表達。例如，對5年生轉(zhuǎn)基因741楊[Populusalba×(P.davidiana+P.simonii)×P.tomentosa]田間檢測發(fā)現(xiàn)，外源基因Cry1Ac、Cry3A仍能穩(wěn)定表達，未發(fā)現(xiàn)丟失和沉默現(xiàn)象(Zuoetal.,2018)；轉(zhuǎn)基因雜種山楊(Populustremula×P.tremuloides)在溫室生長18年后，外源基因rolC依然穩(wěn)定表達，并未出現(xiàn)外源基因丟失和沉默現(xiàn)象(Fladungetal.,2013)；經(jīng)過7年田間試驗的轉(zhuǎn)Bt基因歐洲黑楊(Populusnigra)的外源基因仍存在于轉(zhuǎn)基因楊的基因組中(胡建軍等，2004)；轉(zhuǎn)基因長春花(Catharanthusroseus)在5年后依然檢測到外源基因rolA、rolB、rolC的存在和穩(wěn)定表達(Vermaetal.,2015)。本試驗使用外源基因特異引物對轉(zhuǎn)基因銀中楊(抗逆1號楊)和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?銀中楊)的基因組DNA進行PCR檢測結(jié)果表明，抗逆1號楊在田間種植11年后，外源基因仍穩(wěn)定存在于轉(zhuǎn)基因楊樹的基因組中，未發(fā)生外源基因丟失現(xiàn)象。

基因水平轉(zhuǎn)移現(xiàn)象在原核生物中廣泛存在，在真核生物中也有一些相關(guān)報道(Kyndtetal.,2015;Quispe-Huamanquispeetal.,2019;Matveevaetal.,2019)。林木生長周期長，轉(zhuǎn)基因樹木種植大田后，每年試驗林中產(chǎn)生大量根茬、落葉、花粉、果實等，經(jīng)過多年累積，外源基因可能通過根際分泌物、土壤微生物降解和吸收有機物的過程進入土壤體內(nèi)，影響周圍土壤環(huán)境中的微生物群落結(jié)構(gòu)及其多樣性等(Gaoetal.,2014;Aslametal.,2017;Figueredoetal.,2018)。因此外源基因是否發(fā)生水平轉(zhuǎn)移，土壤中微生物的種類、群落數(shù)量等是否發(fā)生變化是對轉(zhuǎn)基因林木進行安全性評價的重要方面。對包含3 種編碼不同抗性蛋白的外源基因(PeTLP、Cry1Ac、AtGols)的轉(zhuǎn)基因南林895楊試驗林進行安全性評估，未發(fā)現(xiàn)外源基因向土壤微生物中轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象(孫偉博等,2020)。5年生轉(zhuǎn)基因741楊的生態(tài)安全性評價表明，在土壤和林下雜草中未檢測到外源基因，外源基因沒有發(fā)生基因轉(zhuǎn)移，多年生轉(zhuǎn)基因楊樹對土壤理化性質(zhì)和土壤微生物群落結(jié)構(gòu)沒有產(chǎn)生影響，微生物群落結(jié)構(gòu)主要受地理位置和季節(jié)變化的影響(Zuoetal.,2018)。大田種植12年后轉(zhuǎn)基因毛白楊暫未對土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量造成顯著影響(呂威等,2018)。轉(zhuǎn)Bt基因棉花根際土壤微生物的活性并不受Bt蛋白的影響，其主要的影響因素是土壤的鹽分(Luoetal.,2017)。本實驗室早期研究顯示，8年生轉(zhuǎn)多基因歐美楊 (Populus×euramericana‘Guariento’)未發(fā)現(xiàn)外源基因轉(zhuǎn)移，其與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩g林地土壤細菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)無顯著差異，其對土壤微生物系統(tǒng)沒有明顯的影響，轉(zhuǎn)基因楊樹的土壤微生物數(shù)量主要受季節(jié)變化影響(朱文旭等，2015；2017；Zhuetal.,2016)。對不同區(qū)域抗逆1號楊及非轉(zhuǎn)基因?qū)φ諆?nèi)生菌多樣性研究表明，外源基因?qū)氩⑽磳鼓?號楊根、莖中內(nèi)生菌(細菌和真菌)群落結(jié)構(gòu)及多樣性產(chǎn)生影響，微生物的群落結(jié)構(gòu)主要取決于土壤pH值和有機質(zhì)含量(Wangetal.,2019)。本試驗也未在抗逆1號楊試驗林內(nèi)的雜草和林地土壤微生物基因組中檢測到外源基因。由于本試驗材料在轉(zhuǎn)JERF36基因的同時引進了報告基因nptⅡ，為了進一步驗證土壤中抗卡那霉素的細菌是否被整合上外源基因，本試驗篩選出2個抗性菌株，但均未得到外源基因的擴增產(chǎn)物，充分表明外源基因未發(fā)生水平轉(zhuǎn)移。此外，抗逆1號楊與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ樟值赝寥乐械募毦驼婢鷶?shù)量無顯著差異；放線菌僅在2015年(楊樹9年生)的7月份略有差異，可能是環(huán)境變化引起，隨后的2年中均無顯著差異。也進一步證實11年生抗逆1號楊并未對土壤微生物的種類、數(shù)量造成顯著影響。

此外，還有通過檢測試驗林內(nèi)根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)、表層土凋落物、花粉中外源基因表達等方面對多年生轉(zhuǎn)基因楊樹對土壤環(huán)境的安全性進行檢測，但均未發(fā)現(xiàn)顯著影響。如在內(nèi)蒙古地區(qū)轉(zhuǎn)基因試驗林地內(nèi)的轉(zhuǎn)基因銀中楊安全性檢測顯示，轉(zhuǎn)基因銀中楊并未影響其根際土壤微生物的數(shù)量及主要類群的數(shù)量(呂秀華,2017；2018)；種植13年的轉(zhuǎn)基因三倍體毛白楊枯落物中的外源基因暫未水平轉(zhuǎn)移到根際土壤可培養(yǎng)細菌基因組中(呂威等,2019)。雖然上述研究并未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因楊樹對根際土壤等產(chǎn)生顯著影響，但本研究中并未進行相關(guān)方面安全性檢測，因此在今后的研究中可加強本試驗林在該方面的相關(guān)檢測內(nèi)容，以期更加全面地進行轉(zhuǎn)基因楊樹試驗林的安全性檢測，為轉(zhuǎn)基因林木安全性評價提供依據(jù)。

4 結(jié)論

轉(zhuǎn)基因林木對生態(tài)的影響是一個長期而復(fù)雜的過程，目前尚沒有公認的評估轉(zhuǎn)基因植物生態(tài)安全性的方法和標準。本試驗對轉(zhuǎn)JERF36基因銀中楊生態(tài)安全性的初步分析表明，外源基因在轉(zhuǎn)基因銀中楊中穩(wěn)定存在，沒有發(fā)現(xiàn)向周邊環(huán)境水平轉(zhuǎn)移，并未發(fā)現(xiàn)外源基因?qū)雽α值赝寥牢⑸锏臄?shù)量和群落結(jié)構(gòu)造成影響。森林中土壤微生物的組成和結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，關(guān)于轉(zhuǎn)基因林木生態(tài)及生物安全性監(jiān)測需要進行更加系統(tǒng)、全面和長期的研究。