黃芩素調(diào)控miR-378a-5p對脂多糖誘導(dǎo)的心肌細胞損傷和凋亡的影響

韓福星 王高頻（山東省煙臺市毓璜頂醫(yī)院心內(nèi)科，煙臺 264001）

膿毒癥是重癥監(jiān)護病房的危重癥，病死率高，嚴重影響患者的生活質(zhì)量。在嚴重膿毒癥患者中，多臟器功能障礙特別是心肌功能障礙經(jīng)常發(fā)生。研究表明線粒體氧化應(yīng)激、細胞凋亡、炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致心肌組織結(jié)構(gòu)、功能破壞的主要因素［1-2］。因此，具有抗氧化、抗炎、抗凋亡的藥物對膿毒癥心肌細胞損傷具有保護作用。黃芩素是中草藥黃芩中的重要黃酮類化合物，研究表明黃芩素在亞急性期通過減少神經(jīng)炎癥和神經(jīng)損傷能夠改善缺血再灌注所致的腦損傷［3］。黃芩素還可能通過清除氧自由基保護大鼠心肌缺血損傷以及心肌細胞體外氧化損傷［4］。微小RNA（miRNAs）是一類長度為19～25個核苷酸的非編碼RNA，其通過調(diào)節(jié)靶mRNA 的翻譯或降解在膿毒癥心肌病發(fā)生和進展中具有功能作用［5-6］。研究指出在心肌缺血再灌注損傷小鼠中miR-378a-5p 表達增加［7］。下調(diào)miR-378a-5p 表達還可減弱乙醇誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡［8］。然而，黃芩素、miR-378a-5p 對膿毒癥心肌細胞損傷的影響未見報道。本研究以脂多糖（lipopoly saccharide，LPS）誘導(dǎo)大鼠心肌細胞H9C2 建立膿毒癥心肌細胞損傷模型［9］，旨在探討黃芩素對LPS 誘導(dǎo)的H9C2 細胞損傷和凋亡的保護作用，并闡明其機制是否與調(diào)控miR-378a-5p表達有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠心肌細胞H9C2 購自中科院上海生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所；黃芩素購自（批號111595-201808，純度97.9%，采用二甲基亞砜溶液，使用前稀釋至所需濃度）中國食品藥品檢定研究院；LPS購自北京博蕾德生物科技公司；miR-378a-5p模擬物（mimics）及其對照品（miR-con）購自上海吉瑪制藥公司；細胞計數(shù)試劑盒（CCK-8）、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）/碘化丙啶（PI）細胞凋亡檢測試劑盒購自北京百奧萊博公司；乳酸鹽脫氫酶（LDH）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測試劑盒、丙二醛（MDA）含量檢測試劑盒、TNF-α、IL-6 檢測試劑盒購自北京索萊寶生物公司；羊抗兔IgG 二抗購自上海碧云天生物公司；兔抗鼠細胞周期蛋白D1（CyclinD1）、細胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子1A（p21）、B 細胞淋巴瘤（Bcl-2）、Bcl 相關(guān)x 蛋白（Bax）、β 肌動蛋白（β-actin）單克隆抗體購自中國Abcam 公司；miRNA 提取試劑盒、miRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、miRNA 熒光定量PCR 試劑盒購自南京諾唯贊生物公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)、模型構(gòu)建 DMEM 培養(yǎng)基復(fù)蘇H9C2 細胞，置于含5%CO2、37℃濕潤培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞融合度為80%時按照1∶3 比例傳代培養(yǎng)。參照文獻［9］采用LPS 終濃度為含1μg/ml的培養(yǎng)液孵育H9C2細胞24 h建立膿毒癥心肌細胞損傷模型。

1.2.2 轉(zhuǎn)染和實驗分組 將對數(shù)期H9C2 細胞接種6 孔板，細胞融合度為60%按照Lipofectamine 2000 說明書將miR-378a-5p mimics、miR-con 分別轉(zhuǎn)染至H9C2 細胞，轉(zhuǎn)染48 h 后實時定量PCR 檢測轉(zhuǎn)染效果。未進行處理的H9C2 記為對照（Con）組；LPS 組參照上述建模方法；用含10、20、40 μmol/L黃芩素的培養(yǎng)液分別孵育H9C2 細胞24 h，再用含1μg/ml LPS 的培養(yǎng)液孵育細胞24 h 依次記為LPS+10μmol/L黃芩素組、LPS+20μmol/L黃芩素組、LPS+40μmol/L 黃芩素組。用含20μmol/L 黃芩素的培養(yǎng)液孵育轉(zhuǎn)染miR-con、轉(zhuǎn)染miR-378a-5p mimics 的H9C2細胞24 h，再用含1μg/ml LPS的培養(yǎng)液孵育細胞24 h 依次記為LPS+20 μmol/L 黃芩素+miR-con組、LPS+20μmol/L黃芩素+miR-378a-5p組。

1.2.3 CCK-8 法測定細胞活力 將轉(zhuǎn)染或未轉(zhuǎn)染H9C2 細胞接種96 孔板，按照1.2.2 分組方法給予LPS 和/或黃芩素處理，結(jié)束后更換為新鮮培養(yǎng)液，各孔中加入10 μl CCK-8 溶液繼續(xù)培養(yǎng)2.5 h，使用酶標儀分析各孔在450 nm 處光密度值以表示細胞活力。細胞存活率（%）=實驗組OD 值/對照組OD值×100%

1.2.4 流式細胞術(shù)檢測凋亡 磷酸鹽緩沖液洗滌各組H9C2 細胞2 次，用1×結(jié)合緩沖液調(diào)整密度為2×105個/ml的單細胞懸液。取500μl細胞懸液至流式管，分別加入10 μl 的Annexin V-FITC、5 μl 的PI進行暗室染色15 min。1 h 內(nèi)采用流式細胞儀分析細胞凋亡情況。

1.2.5 試劑盒檢測MDA、TNF-α 和IL-6 水平以及LDH、SOD 和GSH-Px 活性 細胞按照1.2.2 分組進行處理后，分別收集上清液和細胞。按照LDH、TNF-α、IL-6 檢測試劑盒說明書測定LDH 釋放量以及TNF-α、IL-6 分泌量。加入提取液，超聲破碎細胞并收集上清液，參照MDA、SOD 和GSH-Px 檢測試劑盒測定MDA含量、SOD和GSH-Px活性。

1.2.6 Western blot分析CyclinD1、p21、Bcl-2和Bax蛋白表達 用RIPA 緩沖液從H9C2 細胞中提取總蛋白。取等量蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白分離后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜。室溫下，膜采用5%脫脂牛奶封閉1 h 后，再用1∶1 000 稀釋的一抗溶液孵育膜2 h，隨后用1∶1 500 稀釋的二抗溶液孵育膜1 h。加入增強化學(xué)發(fā)光試劑進行顯色反應(yīng)，Image J軟件分析各條帶灰度值，目的蛋白表達量以對應(yīng)蛋白和內(nèi)參β-actin灰度值比值表示。

1.2.7 實時定量PCR 檢測miR-378a-5p 表達miRNA 提取試劑盒分離細胞中總RNA，再用miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、miRNA qPCR Mix 進行反轉(zhuǎn)錄、實時定 量PCR 反應(yīng)，2-ΔΔCt法分析miR-378a-5p 表達量。miR-378a-5p 正向引物5'-CTCCTGACTCCAGGTCCTGT-3'，反向引物5'-CTCAACTGGTGTGGGGA-3'；內(nèi)參基因U6正向引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進行統(tǒng)計分析。所有實驗獨立重復(fù)3 次，實驗數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布以表示。使用單向方差分析和SNK-q檢驗分析多組間差異，獨立樣本t檢驗分析兩組間差異。P＜0.05被認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃芩素對LPS處理的H9C2細胞增殖和凋亡的影響 與Con 組比較，LPS 組H9C2 細胞CyclinD1 和Bcl-2 蛋白表達量、細胞存活率顯著降低，而p21 和Bax 蛋白表達量、凋亡率顯著升高（P＜0.05）；與LPS組比較，LPS+10 μmol/L 黃芩素組、LPS+20 μmol/L黃芩素組、LPS+40 μmol/L 黃芩素組H9C2 細 胞CyclinD1 和Bcl-2 蛋白表達量、細胞存活率顯著升高，而p21 和Bax 蛋白表達量、凋亡率顯著降低（P＜0.05）。且LPS+10μmol/L 黃芩素組、LPS+20μmol/L黃芩素組、LPS+40μmol/L 黃芩素組3 組間上述指標比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1和圖1。

圖1 黃芩素對LPS處理的H9C2細胞增殖、凋亡的影響Fig.1 Effects of baicalein on proliferation and apoptosis of H9C2 treated with LPS

表1 黃芩素對LPS處理的H9C2細胞增殖、凋亡的影響（，n=3）Tab.1 Effects of baicalein on proliferation and apoptosis of H9C2 cells treated with LPS（，n=3）

表1 黃芩素對LPS處理的H9C2細胞增殖、凋亡的影響（，n=3）Tab.1 Effects of baicalein on proliferation and apoptosis of H9C2 cells treated with LPS（，n=3）

Note：Compared with Con group，1）P＜0.05；compared with LPS group，2）P＜0.05；compared with LPS +10 μmol/L baicalein group，3）P＜0.05；compared with LPS+20μmol/L baicalein group，4）P＜0.05.

2.2 黃芩素對LPS 處理的H9C2 細胞氧化應(yīng)激及炎癥因子分泌的影響 與Con 組比較，LPS 組H9C2細胞MDA 水平、LDH 釋放量、TNF-α 和IL-6 分泌量顯著升高，SOD 和GSH-Px 活性顯著降低（P＜0.05）；與LPS 組比較，LPS+10 μmol/L 黃芩素組、LPS+20μmol/L 黃芩素組、LPS+40μmol/L 黃芩素組H9C2細胞MDA 水平、LDH 釋放量、TNF-α 和IL-6 分泌量顯著降低，SOD 和GSH-Px 活性顯著升高（P＜0.05）。且LPS+10μmol/L 黃芩素組、LPS+20μmol/L 黃芩素組、LPS+40μmol/L 黃芩素組3 組間上述指標比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 黃芩素對LPS處理的H9C2細胞氧化應(yīng)激及炎癥因子分泌的影響（，n=3）Tab.2 Effects of baicalein on oxidative stress and inflammatory factor secretion in H9C2 cells treated with LPS（，n=3）

表2 黃芩素對LPS處理的H9C2細胞氧化應(yīng)激及炎癥因子分泌的影響（，n=3）Tab.2 Effects of baicalein on oxidative stress and inflammatory factor secretion in H9C2 cells treated with LPS（，n=3）

Note：Compared with Con group，1）P＜0.05；compared with LPS group，2）P＜0.05；compared with LPS +10 μmol/L baicalein group，3）P＜0.05；compared with LPS+20μmol/L baicalein group，4）P＜0.05.

2.3 黃芩素對LPS 處理的H9C2 中miR-378a-5p 表達的影響 與Con 組比較，LPS 組H9C2 細胞miR-378a-5p 表達量顯著升高（P＜0.05）；與LPS 組比較，LPS+10μmol/L黃芩素組、LPS+20μmol/L黃芩素組、LPS+40 μmol/L 黃芩素組H9C2 細胞miR-378a-5p表達量顯著降低（P＜0.05）。且LPS+10μmol/L 黃芩素組、LPS+20 μmol/L 黃芩素組、LPS+40 μmol/L 黃芩素組3 組間上述指標比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 黃芩素對LPS 處理的H9C2 中miR-378a-5p 表達的影響（，n=3）Tab.3 Effects of baicalein on expression of miR-378a-5p in H9C2 treated with LPS（，n=3）

表3 黃芩素對LPS 處理的H9C2 中miR-378a-5p 表達的影響（，n=3）Tab.3 Effects of baicalein on expression of miR-378a-5p in H9C2 treated with LPS（，n=3）

Note：Compared with Con group，1）P＜0.05；compared with LPS group，2）P＜0.05；compared with LPS+10 μmol/L baicalein group，3）P＜0.05；compared with LPS+20 μmol/L baicalein group，4）P＜0.05.

2.4 過表達miR-378a-5p 效率檢測 miR-378a-5p組H9C2 細胞中miR-378a-5p 表達量較miR-con 組顯著升高（P＜0.05，表4）。

表4 過表達miR-378a-5p效率檢測（，n=3）Tab.4 Detection of efficiency of overexpression of miR-378a-5p（，n=3）

Note：Compared with miR-con group，1）P＜0.05.

2.5 過表達miR-378a-5p逆轉(zhuǎn)黃芩素對LPS處理的H9C2 細胞增殖和凋亡的影響 與LPS+20 μmol/L黃芩素組、LPS+20μmol/L 黃芩素+miR-con 組比較，LPS+20 μmol/L 黃芩素+miR-378a-5p 組H9C2 細 胞CyclinD1 和Bcl-2 蛋白表達量、細胞存活率顯著降低，而p21 和Bax 蛋白表達量、凋亡率顯著升高（P＜0.05）。見圖2和表5。

表5 過表達miR-378a-5p逆轉(zhuǎn)黃芩素對LPS處理的H9C2細胞增殖和凋亡的影響（，n=3）Tab.5 Overexpression of miR-378a-5p reverses effect of baicalein on proliferation and apoptosis of H9C2 cells treated with LPS（，n=3）

表5 過表達miR-378a-5p逆轉(zhuǎn)黃芩素對LPS處理的H9C2細胞增殖和凋亡的影響（，n=3）Tab.5 Overexpression of miR-378a-5p reverses effect of baicalein on proliferation and apoptosis of H9C2 cells treated with LPS（，n=3）

Note：Compared with LPS+20μmol/L baicalein group，1）P＜0.05；compared with LPS+20μmol/L baicalein+miR-con group，2）P＜0.05.

圖2 過表達miR-378a-5p 可以逆轉(zhuǎn)黃芩素（20 μmol/L）對LPS處理的H9C2中增殖、凋亡的影響Fig.2 Overexpression of miR-378a-5p can reverse effect of baicalein（20 μmol/L）on proliferation and apoptosis of H9C2 treated with LPS

2.6 過表達miR-378a-5p逆轉(zhuǎn)黃芩素對LPS處理的H9C2 細胞氧化應(yīng)激和炎癥因子分泌的影響 與LPS+20 μmol/L 黃芩素組、LPS+20 μmol/L 黃芩素+miR-con組比較，LPS+20μmol/L黃芩素+miR-378a-5p組H9C2 細胞MDA 水平、LDH 釋放量、TNF-α 和IL-6分泌量顯著升高，SOD 和GSH-Px 活性顯著降低（P＜0.05，表6）。

表6 過表達miR-378a-5p逆轉(zhuǎn)黃芩素對LPS處理的H9C2細胞氧化應(yīng)激和炎癥因子分泌的影響（，n=3）Tab.6 Overexpression of miR-378a-5p reverses effect of baicalein on oxidative response and secretion of inflammatory factors in H9C2 cells treated with LPS（，n=3）

表6 過表達miR-378a-5p逆轉(zhuǎn)黃芩素對LPS處理的H9C2細胞氧化應(yīng)激和炎癥因子分泌的影響（，n=3）Tab.6 Overexpression of miR-378a-5p reverses effect of baicalein on oxidative response and secretion of inflammatory factors in H9C2 cells treated with LPS（，n=3）

Note：Compared with LPS+20μmol/L baicalein group，1）P＜0.05；compared with LPS+20μmol/L baicalein+miR-con group，2）P＜0.05.

3 討論

黃芩素是黃芩的主要活性成分之一，其通過抗氧化、抗凋亡、抗炎、保護線粒體機制具有廣泛的心臟保護作用。文獻證實黃芩素通過抑制活性氧產(chǎn)生、鈣離子超載保護心肌細胞免受溶血磷脂酰膽堿引起的細胞凋亡［10］。泛素E3 連接酶膜相關(guān)鋅指蛋白5（MARCH5）在調(diào)節(jié)線粒體動力學(xué)和線粒體自噬方面起著關(guān)鍵作用，黃芩素還通過穩(wěn)定細胞中MARCH5 表達能夠減輕心肌細胞凋亡和氧化損傷［11］。TNF-α和IL-6是參與炎癥啟動和調(diào)節(jié)的促炎細胞因子，本研究發(fā)現(xiàn)LPS處理H9C2細胞后TNF-α和IL-6 分泌量顯著增加，而黃芩素處理顯著抑制LPS 誘導(dǎo)的TNF-α 和IL-6 分泌，這與CHEN 等［12］報道黃芩素的抗炎作用一致。此外，黃芩素對氣道損傷、肝損傷均表現(xiàn)出抗炎作用［13-14］。LDH 是細胞質(zhì)中的特異性心肌酶，當(dāng)細胞損傷時釋放到細胞外，通過檢測LDH 水平可有效地反映心肌細胞損傷程度［15］。進一步分析發(fā)現(xiàn)黃芩素處理顯著增加LPS誘導(dǎo)的H9C2細胞的活力，減少細胞凋亡，抑制LDH 釋放，抑制脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA 產(chǎn)生，并提高抗氧化酶SOD 和GSH-Px 活性。此外，本研究發(fā)現(xiàn)黃芩素處理顯著增加促增殖蛋白CyclinD1、抗凋亡蛋白Bcl-2表達量，降低增殖抑制蛋白p21、凋亡促進蛋白Bax 的表達量，這與黃芩素的促增殖、抗凋亡作用吻合。以上研究表明黃芩素可保護H9C2 細胞免受LPS誘導(dǎo)的炎癥、氧化損傷和凋亡。

多項研究證實黃芩素通過調(diào)控miRNA 表達進而發(fā)揮抗腫瘤、抗纖維化作用［16-17］。例如黃芩素通過下調(diào)miR-183 表達抑制骨肉瘤細胞增殖和侵襲［18］；黃芩素還通過調(diào)控miR-21表達抑制成纖維細胞增殖和膠原蛋白產(chǎn)生進而抑制瘢痕形成［19］。miRNA 的表達失調(diào)已被證實與心臟發(fā)育、心肌損傷等生理病理過程相關(guān)，但黃芩素是否通過調(diào)控miRNA 表達發(fā)揮心肌保護作用未見報道［20］。本研究中LPS 處理后H9C2 細胞中黃芩素miR-378a-5p表達量顯著增加，而黃芩素處理顯著降低受損H9C2 細胞中miR-378a-5p 表達水平，提示黃芩素的心肌保護作用可能與調(diào)控miR-378a-5p 表達有關(guān)。深入研究顯示，轉(zhuǎn)染miR-378a-5p mimics 上調(diào)miR-378a-5p表達顯著減弱黃芩素對LPS誘導(dǎo)下H9C2細胞活力、凋亡、炎癥反應(yīng)以及氧化損傷的影響，說明黃芩素可能通過下調(diào)miR-378a-5p 進而保護H9C2細胞免受LPS誘導(dǎo)的炎癥、氧化損傷和凋亡。

綜上所述，本研究證實黃芩素可減輕LPS 誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡、炎癥反應(yīng)和氧化損傷，其機制可能與下調(diào)受損心肌細胞miR-378a-5p表達有關(guān)，這開發(fā)黃芩素用于膿毒癥心肌病治療提供了理論依據(jù)。