破壞細(xì)菌芽孢高抵抗力的研究進(jìn)展

黃筱鈞，徐 慧，白游震，徐志豪

湖北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)部(湖北 恩施 445000)

芽孢是細(xì)菌的特殊結(jié)構(gòu)，細(xì)菌的芽孢對(duì)熱、干燥、輻射、化學(xué)消毒劑及抗菌藥物具有極強(qiáng)的抗性，芽孢是否被破壞是判斷滅菌效果的指標(biāo)。芽孢的高抵抗力與其結(jié)構(gòu)、化學(xué)組成等有關(guān)。細(xì)菌的芽孢是某些外源性感染的重要來(lái)源，破傷風(fēng)、氣性壞疽、炭疽病等都是有芽孢的細(xì)菌感染引起的。煮沸、高壓蒸汽滅菌、高靜壓、高壓二氧化碳是破壞芽孢的常用方法，但這些方法有的對(duì)設(shè)備要求高，有的需要處理較長(zhǎng)時(shí)間，有的不能連續(xù)處理。本文通過(guò)剖析芽孢高抵抗力的基礎(chǔ)，總結(jié)現(xiàn)有破壞芽孢的方法及機(jī)制，提出了我們對(duì)破壞芽孢可能性的思考，以期為探索出穩(wěn)定、高效、易操作的破壞細(xì)菌芽孢的方法提供理論基礎(chǔ)。

1 芽孢高抵抗力的基礎(chǔ)

芽孢的形成受細(xì)菌染色體DNA中芽孢合成相關(guān)基因的控制，與其結(jié)構(gòu)、2,6-吡啶二羧酸鈣鹽(Calcium 2,6-pyridyl-dicarboxylate，DPA-Ca)、α/β小分子酸溶性蛋白(Small acid-soluble proteins，SASP)等化學(xué)組成有關(guān)。

1.1結(jié)構(gòu)學(xué)說(shuō)芽孢由內(nèi)向外依次為核心、內(nèi)膜、芽孢壁、皮質(zhì)、外膜、芽孢殼和芽孢外衣，具有多層膜結(jié)構(gòu)[1-2]。多層膜結(jié)構(gòu)是芽孢高抵抗力的基礎(chǔ)，其共同特點(diǎn)是含水量低、酶活性差。芽孢外衣是形成芽孢后細(xì)菌母細(xì)胞的膜殘留物，它是芽孢抵御外界環(huán)境干擾的第一道屏障；芽孢殼致密而無(wú)通透性，對(duì)大多數(shù)蛋白酶、溶菌酶以及表面活性劑具有強(qiáng)的抵抗作用；外膜對(duì)維持芽孢內(nèi)外平衡有一定的作用；皮質(zhì)主要由肽聚糖組成，結(jié)構(gòu)疏松，能有效保持核心的低水分狀態(tài)，對(duì)維持芽孢抗性極為重要；芽孢壁也由肽聚糖組成，其主要作用是在萌發(fā)后形成細(xì)胞壁；內(nèi)膜通透性低，可阻止化學(xué)藥物進(jìn)入核心[3-5]。

1.2化學(xué)學(xué)說(shuō)核心區(qū)包含芽孢的遺傳物質(zhì)、酶系統(tǒng)、蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)。芽孢含水量低，菌體蛋白在熱力作用下，不易變性。芽孢形成過(guò)程中能合成一些特殊的酶，這些酶具有很強(qiáng)的耐熱性。此外，還有兩種能提高芽孢抵抗力的特殊成分：DPA-Ca、SASP。DPA-Ca提高芽孢抵抗力的可能原因：①細(xì)菌在不利環(huán)境中，通過(guò)基因調(diào)控，生成大量賴(lài)氨酸生物合成通路的中間產(chǎn)物——DPA[6]。細(xì)菌一方面大量吸收外界環(huán)境中的Ca2+，另一方面抑制Ca2+流出，大量DPA與Ca2+在細(xì)菌內(nèi)形成螯合物——DPA-Ca，DPA-Ca能降低芽孢核心區(qū)的水分，通過(guò)保護(hù)細(xì)菌蛋白質(zhì)及其DNA，提高芽孢對(duì)外界的抵抗力[7]。②DPA由一個(gè)吡啶環(huán)和兩個(gè)羧基構(gòu)成，羧基上的氫原子被鈣離子取代形成DPA-Ca螯合物。DPA及DPA-Ca中存在水分子，它與吡啶環(huán)中的氮原子和羧基中的C=O形成氫鍵，水中氧原子與DPA中的O—H也會(huì)形成氫鍵，因此分子間的相互作用很強(qiáng)，使得芽孢的熱穩(wěn)定性提高[8]。③DPA-Ca在芽孢內(nèi)常以晶體的形式存在，相當(dāng)于一個(gè)“庫(kù)存”，熱環(huán)境中，在解離酶作用下，解離成DPA與Ca2+，DPA與芽孢中的蛋白質(zhì)結(jié)合，改變其構(gòu)型，從而增強(qiáng)熱穩(wěn)定性[9]。④在芽孢中，Ca2+既是酶的激活劑又是多種耐熱酶的熱穩(wěn)定劑，Ca2+在解離酶作用于DPA-Ca時(shí)被釋放，同時(shí)促進(jìn)解離作用。除此之外，Ca2+作用于芽孢膜時(shí)，能降低膜的通透性，穩(wěn)定芽孢膜；作用于蛋白質(zhì)時(shí)，可以穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，從而增強(qiáng)芽孢的抵抗力[10]。SASP與DNA結(jié)合后使DNA結(jié)構(gòu)和光化學(xué)性質(zhì)改變，提高芽孢對(duì)紫外線(xiàn)輻射的耐受力[11]。田晶晶等[12]研究發(fā)現(xiàn)凝結(jié)芽孢桿菌的芽孢形成具有環(huán)境pH值依賴(lài)性，中性偏堿的環(huán)境有利于芽孢化啟動(dòng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，添加適量的碳酸鈣，能促進(jìn)芽孢形成。

1.3滲透調(diào)節(jié)皮層膨脹學(xué)說(shuō)皮質(zhì)層位于外膜和芽孢壁之間，外膜相當(dāng)于一層屏障，對(duì)水和陽(yáng)離子的通透性較差，而且皮質(zhì)層含有大量帶有負(fù)電荷的肽聚糖，由于異種電荷相互吸引，核心區(qū)的低價(jià)陽(yáng)離子進(jìn)入皮質(zhì)層，使得皮質(zhì)層的滲透壓升高，通過(guò)滲透壓差的作用吸收核心內(nèi)部的水分。又因?yàn)樗谋葻崛荽螅谕饨鐪囟劝l(fā)生變化時(shí)，能抵御部分外界傳遞的熱量，具有一定的抵抗性。另一方面，由于DPA-Ca和蛋白質(zhì)等大分子化合物束縛了皮質(zhì)層中的水分，使自由水與結(jié)合水的比值大幅度降低，保持了核心區(qū)低水分的狀態(tài)，從而導(dǎo)致酶活性降低，達(dá)到維持芽孢正常生理微環(huán)境的目的[13]。

2 破壞芽孢的方法

芽孢對(duì)物理、化學(xué)和生物因素具有強(qiáng)大的抵抗力，是芽孢在食品安全和醫(yī)療衛(wèi)生等領(lǐng)域造成危害的基礎(chǔ)。破壞芽孢的方法可分為物理方法和化學(xué)方法。

2.1物理方法在不改變芽孢分子結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用高溫、高壓或二者結(jié)合等物理方法可以達(dá)到降低芽孢抵抗力的目的。劉東紅等[14]利用超聲波與高壓同時(shí)作用于芽孢，發(fā)現(xiàn)與單用比較，DPA的釋放率更高，DPA的大量丟失降低了其對(duì)芽孢的保護(hù)作用，從而降低芽孢熱抗性。Schottroff F等[15]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)熱處理能提高芽孢對(duì)電場(chǎng)的敏感性，電場(chǎng)也能提高芽孢對(duì)熱處理的敏感性，電場(chǎng)和熱處理聯(lián)合可以加強(qiáng)對(duì)枯草芽孢桿菌野生型(PS533)芽孢的滅活作用。研究發(fā)現(xiàn)，CO2(20MPa)和高溫(84～86℃)聯(lián)合作用可以破壞枯草芽孢桿菌芽孢的內(nèi)膜，阻斷芽孢萌發(fā)后的生長(zhǎng)，間接起到破壞芽孢的作用[16-17]。章中等[10]使用化學(xué)萌發(fā)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)使用DPA誘導(dǎo)劑時(shí)芽孢萌發(fā)率最高(約95%)，萌發(fā)后芽孢內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，成為類(lèi)似營(yíng)養(yǎng)體的結(jié)構(gòu)，此時(shí)細(xì)菌失去高抵抗力，繼而在超高壓作用下，這種結(jié)構(gòu)會(huì)受到嚴(yán)重破壞，達(dá)到殺滅芽孢的目的。萌發(fā)的芽孢通過(guò)超高壓處理后全部死亡，說(shuō)明誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)再結(jié)合超高壓滅菌能有效殺滅芽孢。

2.2化學(xué)方法化學(xué)方法改變芽孢分子結(jié)構(gòu)也可以達(dá)到降低芽孢抵抗力的目的。霍春芳等[18]發(fā)現(xiàn)稀土離子與Ca2+半徑相近，可取代DPA-Ca上Ca2+的結(jié)合位點(diǎn)，與DPA形成更穩(wěn)定的配合物。與此同時(shí)，芽孢內(nèi)大量的Ca2+順濃度梯度滲透出菌體，降低其抗性及活性，達(dá)到抑菌的效果，甚至可以殺滅細(xì)菌。鄧小虹等[19]利用多種化學(xué)消毒劑(3 000 mg/L氯氧三嗪、100 mg/L二氧化氯、2%堿性戊二醛、環(huán)氧乙烷)處理手機(jī)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示采用化學(xué)消毒劑浸泡方式處理難以達(dá)到理想的滅菌效果，相對(duì)而言，環(huán)氧乙烷滅菌效果更好，但需要專(zhuān)業(yè)的設(shè)備，所以該方法存在局限性。董蓉等[20]發(fā)現(xiàn)在強(qiáng)堿的脅迫下，芽孢多層膜結(jié)構(gòu)受損，強(qiáng)堿進(jìn)入芽孢內(nèi)部破壞核酸和蛋白質(zhì)等結(jié)構(gòu)，同時(shí)造成芽孢膜通道受損，導(dǎo)致芽孢釋放出DPA-Ca，最終造成芽孢耐受性下降。Kumar M等[21]以嗜熱脂肪芽孢桿菌為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，研究發(fā)現(xiàn)磷酸鹽可以加速芽孢中Ca2+的流失，降低芽孢的耐熱性，此方法可用于乳制產(chǎn)品的防腐。黃現(xiàn)青等[22]研究發(fā)現(xiàn)Surfactin可破壞芽孢壁的完整性、與DNA結(jié)合，從而滅活蠟樣芽孢桿菌的芽孢。Abraham JP等[23]利用體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)天然黃酮類(lèi)苷、黃芩苷對(duì)艱難梭菌毒素合成、產(chǎn)孢及芽孢萌發(fā)的作用，結(jié)果顯示黃芩苷的亞抑制濃度可以作用于產(chǎn)孢相關(guān)基因(spo0A、spoIIR、si-gH、spoIIA、spoIIID、CD2494)，影響芽孢的生成，還能抑制芽孢的生長(zhǎng)。王濤等[6]誘導(dǎo)枯草芽孢桿菌成為L(zhǎng) 型并傳代培養(yǎng)獲得穩(wěn)定L 型純培養(yǎng)物，研究顯示枯草芽孢桿菌穩(wěn)定L 型不再形成芽孢。

3 破壞芽孢的可能機(jī)制

破壞芽孢可以從破壞其本身的熱穩(wěn)定性出發(fā)，還可以從誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)方面著手，降低其抵抗力；阻止芽孢萌發(fā)，使細(xì)菌長(zhǎng)時(shí)間處于休眠狀態(tài)，阻斷細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖；同時(shí)，從基因角度破壞芽孢也是值得關(guān)注的方向。

3.1破壞芽孢的熱穩(wěn)定性目前，氮酮在醫(yī)藥、化妝品、農(nóng)業(yè)等行業(yè)有很高的使用率，得益于其促滲透作用。作為高效促滲透劑，氮酮除了對(duì)細(xì)菌繁殖體有抑菌作用外，對(duì)厭氧芽孢桿菌屬的芽孢也具有抑制作用，常溫下氮酮可以明顯提高芽孢的滲透性。研究發(fā)現(xiàn)，氮酮與乙醇共同作用芽孢比單獨(dú)使用乙醇效果更好[24-25]。因此，這種不需要高溫和高壓等嚴(yán)格條件，通過(guò)氮酮增加脂質(zhì)的流動(dòng)性，促進(jìn)破壞DPA-Ca的物質(zhì)進(jìn)入芽孢，是降低芽孢熱穩(wěn)定性的基礎(chǔ)。

芽孢中加入DPA后，能夠誘導(dǎo)其萌發(fā)，萌發(fā)率可達(dá)到95%。此時(shí)芽孢的內(nèi)部結(jié)構(gòu)變成了類(lèi)似營(yíng)養(yǎng)體的結(jié)構(gòu)，在這個(gè)過(guò)程中DPA-Ca轉(zhuǎn)變成DPA和Ca2+[10]。DPA中的羧基在一定條件下可以與乙醇中的羥基發(fā)生酯化反應(yīng)，生成酯類(lèi)和水。在反應(yīng)過(guò)程中加入干燥劑等物質(zhì)使水減少，DPA的消耗因此增加，當(dāng)維持芽孢熱穩(wěn)定性的DPA減少時(shí)，芽孢的熱穩(wěn)定性會(huì)降低，但此過(guò)程對(duì)反應(yīng)的條件要求高。

芽孢中的DPA-Ca是配合物，稀土離子與Ca2+半徑相近，稀土離子與氧、氮、硫的配位能力大于Ca2+。在Ca2+與有機(jī)配體通過(guò)氧、氨、硫形成的配合物中，稀土離子易于取代Ca2+的結(jié)合位點(diǎn)，使Ca2+流出芽孢，失去提高熱穩(wěn)定性的作用。還可以用其他形成配位鍵比Ca2+強(qiáng)的Cu2+等取代Ca2+，從而與DPA生成新的物質(zhì)，使解離酶無(wú)法發(fā)揮作用，DPA失去保護(hù)蛋白質(zhì)的能力，同時(shí)加入可以與Ca2+形成沉淀的離子讓Ca2+失去作用，使芽孢熱穩(wěn)定性降低。

以上兩種破壞機(jī)制還可以從滲透調(diào)節(jié)皮層膨脹學(xué)說(shuō)角度來(lái)解釋。DPA-Ca在皮層中可以固定水分，降低核心區(qū)的水分，從而提高芽孢的熱穩(wěn)定性。當(dāng)DPA-Ca受到破壞，無(wú)法束縛住芽孢皮層內(nèi)的水分，就有可能導(dǎo)致核心區(qū)水分增加，在外界熱力作用時(shí)，皮層無(wú)法起到類(lèi)似隔絕熱力的作用，核心區(qū)溫度上升，芽孢熱穩(wěn)定性下降。

3.2阻止芽孢萌發(fā)芽孢是細(xì)菌的休眠形式，這種狀態(tài)對(duì)外界不產(chǎn)生危害，只有當(dāng)芽孢萌發(fā)后，形成繁殖體，進(jìn)行新陳代謝，才會(huì)引起食物腐敗、致病等。因此阻止芽孢萌發(fā)，使其停留在休眠狀態(tài)，等同于破壞了芽孢。

在芽孢正常萌發(fā)的過(guò)程中，核心區(qū)會(huì)釋放DPA-Ca，它能激活皮層中的細(xì)胞溶解酶，進(jìn)而水解肽聚糖，添加誘導(dǎo)劑DPA，能迅速誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)，因此DPA是芽孢萌發(fā)過(guò)程中的一種關(guān)鍵物質(zhì)，破壞DPA就能阻止芽孢萌發(fā)，使細(xì)菌處于類(lèi)似深休眠的狀態(tài)。

DNA既是生物遺傳信息的載體，也控制著生物的新陳代謝，在芽孢中SASP是保護(hù)芽孢DNA的酸溶性蛋白，使其免受紫外線(xiàn)等輻射。通過(guò)改變或破壞SASP，紫外線(xiàn)等輻射可以破壞DNA，進(jìn)而阻止芽孢的萌發(fā)。

3.3誘導(dǎo)芽孢成為繁殖體誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)有多種方法，其中外源性DPA、L-丙氨酸、肌苷和陽(yáng)離子表面活性劑等均可作為誘導(dǎo)劑。芽孢萌發(fā)成繁殖體后，就喪失了對(duì)外界脅迫的抗性，通過(guò)普通的高溫、高壓、濕熱、輻射和化學(xué)消毒劑等可殺滅繁殖體，極大地降低殺菌難度。實(shí)驗(yàn)研究證明[26]單因素誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)時(shí)，外源性DPA誘導(dǎo)芽孢的萌發(fā)率明顯高于其他誘導(dǎo)因素，但不能使全部芽孢萌發(fā)，具有潛在危害性；多種誘導(dǎo)劑組合時(shí)，與DPA搭配的組合反而不如單獨(dú)使用DPA的誘導(dǎo)效果好，有的組合反而降低芽孢的萌發(fā)率，甚至不萌發(fā)。因此，有針對(duì)性、合理地搭配誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)成為繁殖體是降低殺滅芽孢條件的前提。

3.4從基因角度阻止細(xì)菌產(chǎn)芽孢芽孢是細(xì)菌在不利環(huán)境下形成的一種特殊結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)變化需要細(xì)菌基因的控制。細(xì)菌芽孢化的第一步是Spo0A蛋白發(fā)生磷酸化[27]。Spo0A受多種調(diào)節(jié)因子的調(diào)控，其中蛋白激酶KinA可以使Spo0A前體SpoF磷酸化形成Spo0A，Spo0A磷酸化后可激活細(xì)菌芽孢化。蛋白質(zhì)Sda與KinA結(jié)合，阻止KinA磷酸化而抑制Spo0A的活化[27]。所以，通過(guò)誘導(dǎo)編碼基因sda表達(dá)蛋白質(zhì)Sda，可以抑制Spo0A的形成，細(xì)菌就無(wú)法芽孢化。

3.5從基因角度降低芽孢的抵抗力芽孢的高抵抗力是在細(xì)菌形成芽孢時(shí)逐步具有的。在芽孢形成后期，細(xì)菌合成SASP，當(dāng)其與DNA結(jié)合后，結(jié)構(gòu)和光化學(xué)性質(zhì)改變，因此芽孢耐受類(lèi)似輻射作用的能力增強(qiáng)，并且穩(wěn)定DNA結(jié)構(gòu)，免受部分物理因素的破壞。研究表明SASP由多基因家族ssp編碼合成[28]。改造ssp基因家族，抑制蛋白質(zhì)SASP的合成，芽孢對(duì)紫外線(xiàn)等輻射的耐受性降低，通過(guò)紫外線(xiàn)就極易殺滅芽孢。DPA是細(xì)菌賴(lài)氨酸生物合成通路的中間產(chǎn)物，天冬氨酸依次在天冬氨酸激酶、天冬氨酸-β-半醛脫氫酶、二氫吡啶二羧酸合成酶、二氫吡啶二羧酸還原酶的催化作用下生成DPA[29]。因此，調(diào)控上述任意一種酶的相關(guān)基因，抑制其催化功能，阻止合成通路，可間接地降低DPA含量，從而降低芽孢抵抗力。

4 小結(jié)

破壞芽孢的方法多樣，從芽孢的特殊成分DPA-Ca入手，減少其在核心的含量是一種重要且有效的途徑，可以解決破壞芽孢需要高溫高壓等嚴(yán)格條件的問(wèn)題；從芽孢多層膜結(jié)構(gòu)中的皮質(zhì)入手，皮質(zhì)的破壞無(wú)法保證核心區(qū)的低水分狀態(tài)，從而降低芽孢的熱穩(wěn)定性；從阻止或誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)角度入手，是兩個(gè)相反方向破壞芽孢的重要方法。在食品加工和發(fā)酵工業(yè)都要徹底消滅細(xì)菌芽孢，關(guān)于芽孢耐熱機(jī)制和萌發(fā)機(jī)制尚未完全清楚，極大地制約了簡(jiǎn)單、高效殺滅芽孢的方法研究。在深入研究機(jī)制的基礎(chǔ)上，充分利用現(xiàn)代生物工程技術(shù)，從基因、蛋白質(zhì)角度探索破壞芽孢的方法，可大大提高破壞芽孢的效率，有效減少芽孢萌發(fā)引起的食品腐敗、釋放毒素等危害，更好地保障人類(lèi)健康。