牛婷婷，張淼潔，原 霖，張 寧，高夢(mèng)錦，張小元，朱連德

（北京中科基因技術(shù)股份有限公司，北京 102600）

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS），又稱“豬藍(lán)耳病”，是一種嚴(yán)重影響全球養(yǎng)豬業(yè)的疫病。該病病原為有囊膜的RNA病毒，可引起感染豬發(fā)熱、厭食，妊娠母豬晚期流產(chǎn)、早產(chǎn)、產(chǎn)死胎/弱胎和木乃伊胎等繁殖障礙癥狀，以及各種年齡豬（特別是仔豬）的呼吸困難。豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）分為基因Ⅰ型（歐洲株）與Ⅱ型（美洲型），極易變異和演化，呈現(xiàn)毒株的多樣性與致病性的差異，其變異主要集中于非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp2編碼區(qū)、結(jié)構(gòu)蛋白ORF5，同時(shí)毒株之間也存在一定的重組現(xiàn)象。

文章對(duì)2018-2020年我國部分地區(qū)的樣品進(jìn)行回溯性調(diào)查研究，從PRRSV抗體、核酸檢測(cè)以及分子遺傳變異3個(gè)方面進(jìn)行了檢測(cè)和分析，希望了解近期我國豬繁殖與呼吸綜合征的流行病學(xué)變化情況，為該病的防控和區(qū)域凈化提供數(shù)據(jù)支持。樣品

陽性場(chǎng)：只要場(chǎng)內(nèi)樣品檢出1例陽性樣品，該場(chǎng)為陽性場(chǎng)

場(chǎng)陽性率：陽性場(chǎng)次數(shù)/被檢場(chǎng)次數(shù)×100%

場(chǎng)內(nèi)個(gè)體陽性率：被檢場(chǎng)場(chǎng)內(nèi)陽性樣品總數(shù)/被檢場(chǎng)檢測(cè)樣品總數(shù)×100%

樣品陽性率：所有被檢樣品檢測(cè)結(jié)果為陽性數(shù)量/檢測(cè)份數(shù)×100%

1.3.2 統(tǒng)計(jì)方法

根據(jù)被檢豬場(chǎng)規(guī)模的差異，將被檢豬場(chǎng)分成規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)（存欄≥3 000頭）和散戶（存欄＜3 000頭），用Epi info7軟件計(jì)算不同組別的OR（Odds Ratio，比值比）、95%CI（Confi dence interval，置信區(qū)間）和P值，分析各組間的抗體及核酸陽性率差異。

1.3.3 空間分布

用Power BI軟件制作所有被檢樣品來源地區(qū)在我國的分布情況。

1 PRRSV抗體檢測(cè)

1.1 樣品來源

樣品來自于2018-2020年我國24個(gè)省份3 525個(gè)不同規(guī)模豬場(chǎng)共計(jì)106 924份血清樣品。

1.2 檢測(cè)方法

抗體檢測(cè)采用ELISA方法，使用商品化試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，詳細(xì)操作步驟及結(jié)果判定按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 分析指標(biāo)

1.3.1 指標(biāo)定義

陽性樣品：檢測(cè)結(jié)果為陽性的

1.4 抗體檢測(cè)結(jié)果及分析

2018-2020年P(guān)RRS抗體不同地區(qū)場(chǎng)內(nèi)及個(gè)體抗體平均陽性率分別為88.9%與70.6%。從不同年份看，2018-2020年場(chǎng)陽性率分別為95%、92%、86%，樣品陽性率分別為79%、77%、64%，均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(見圖1）。

圖1 2018-2020年P(guān)RRSV抗體陽性率分布圖

與前兩年相比，2020年場(chǎng)內(nèi)個(gè)體陽性率中位數(shù)較低，為78.57%，但是分布更為離散，提示不同場(chǎng)點(diǎn)的場(chǎng)內(nèi)個(gè)體抗體陽性率差異較大（見圖2）。

圖2 2018-2020年場(chǎng)內(nèi)個(gè)體抗體陽性率分布圖

從不同季度看，PRRSV抗體的樣品陽性率分布未呈現(xiàn)出季節(jié)性的特征，但自2020年第一季度起呈持續(xù)降低趨勢(shì)（見圖3）。

圖3 2018-2020年不同季度PRRSV抗體樣品陽性率

從不同區(qū)域看，2018年、2019年各地區(qū)場(chǎng)陽性率、樣品陽性率差異不大；2020年，場(chǎng)陽性率華中區(qū)最高（88.3%）、華南區(qū)最低（58.7%），樣品陽性率西北區(qū)最高（75%）、西南區(qū)最低（24%）（見圖4）。

圖4 2018-2020年我國不同區(qū)域PRRSV抗體陽性率分布圖

從不同養(yǎng)殖場(chǎng)類型來看，規(guī)模場(chǎng)場(chǎng)陽性率88.1%，散戶場(chǎng)陽性率89.2%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，規(guī)模場(chǎng)和散戶的場(chǎng)陽性率未發(fā)現(xiàn)顯著差異（見表1）。

表1 PRRSV抗體在不同養(yǎng)殖規(guī)模場(chǎng)分布差異

2 PRRSV核酸檢測(cè)

2.1 樣品來源

樣品來自于2018-2020年我國27個(gè)省份3 981個(gè)不同規(guī)模豬場(chǎng)（場(chǎng)次）的23 708份樣品，樣品類型為組織、豬全血、精液、唾液、精液等。

2.2 檢測(cè)方法及指標(biāo)

核酸檢測(cè)采用RT-PCR和qPCR方法，使用商品化試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，詳細(xì)操作步驟及結(jié)果判定按照試劑盒說明書進(jìn)行。

統(tǒng)計(jì)分析指標(biāo)同1.3。

2.3 PRSSV核酸檢測(cè)結(jié)果及分析

2018年到2020年，PRRSV核酸的場(chǎng)陽性率逐年降低，分別為45.4%、27.8%、22.9%；樣品陽性率也呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，2018年最高，為22.1%，2019年、2020年分別為11.8%和13.9%，較2018年有較大幅度降低（見圖5）。

圖5 2018-2020年我國PRRSV抗體陽性率分布圖

從不同季度看，除2018年外，其余年份第4季度樣品陽性率較高（見圖6）。

圖6 2018-2020年不同季度PRRSV核酸樣品陽性率分布圖

從不同區(qū)域看（見圖7），不同地區(qū)場(chǎng)陽性率、樣品陽性率差異較大；2020年，場(chǎng)陽性率東北區(qū)最高（30%）、華南區(qū)最低（6.2%）；樣品陽性率東北區(qū)最高（21.7%），華南區(qū)（1.8%）、西南區(qū)最低（1.5%）。

圖7 2018-2020年我國不同區(qū)域PRRSV核酸陽性率分布圖

從不同養(yǎng)殖場(chǎng)類型看，規(guī)模場(chǎng)樣品陽性率為14.6%，散戶樣品陽性率為13.8%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，不同養(yǎng)殖類型場(chǎng)點(diǎn)的樣品陽性率存在一定差異（見表2）。

表2 PRRSV平均個(gè)體核酸陽性率在不同宿主中分布差異

3 PRRSV分子生物學(xué)分析

共對(duì)336份樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，獲得73條基因序列，將ORF5與NSP2片段序列通過DNASTAR軟件的MegAlign功能與GenBank上已發(fā)表的國內(nèi)外流行PRRSV參考毒株進(jìn)行序列比對(duì)，構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹，進(jìn)行同源性分析。

經(jīng)測(cè)序分析（見表3、圖8），PRRSV NADC30-like毒株占比53%，PRRSV高致病型毒株占比22%，PRRSV經(jīng)典型毒株占比10%，PRRSV歐洲型毒株占比4%，PRRSV重組毒株占比11%，重組毒株主要來源于華南地區(qū)。

圖8 2018-2020年我國不同區(qū)域PRRSV核酸陽性率分布圖

表3 2018-2020年國內(nèi)部分地區(qū)PRRSV分離毒株分型占比情況

從毒株類型來看（見表4、圖9），2019年和2020年毒株類型呈現(xiàn)出多樣性，主要為NADC30-like株，其次為高致病型毒株，重組毒株、經(jīng)典型毒株、歐洲型毒株并存。2018年因數(shù)據(jù)來源局限性，分離獲得毒株主要為NADC30-like。

表4 2018-2020年國內(nèi)部分地區(qū)PRRSV分離毒株分型占比情況 %

圖9 2019-2020年國內(nèi)部分地區(qū)PRRSV分離毒株分型占比情況

PRRSV ORF5基因進(jìn)化樹分析：所獲ORF5基因序列43條，其中，有40株為美洲型，3株歐洲型。其中，以HENAN-XINX、NADC30為代表株的lineage1的14株、以CH-1a、JXA1為代表株的lineage8（sublineage8.7） 的 15株、lineage5（sublineage5.1）5株，其代表株為VR2332和BJ-4，QYYZ為代表的lineage3的有6株。LV毒株為代表的genotypeⅠ有3株。

PRRSV NSP2基因進(jìn)化樹分析：所獲 NSP2基因序列30條，與HUN4、JXA1和TJM毒株等國內(nèi)流行毒株屬于同一進(jìn)化分支且遺傳關(guān)系較近，均屬于PRRSV美洲Ⅳ型基因亞型，其中與TJM毒株遺傳進(jìn)化關(guān)系最為接近，與歐洲型代表毒株遺傳進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)。

通過核酸檢測(cè)結(jié)果與分子生物學(xué)分析顯示，2018-2020年我國部分地區(qū)豬群感染PRRSV較為普遍。主要是美洲型毒株lineage（NADC30-like）與 lineage8（HP-PRRSV）。 感染豬群存在不同譜系PRRSV毒株混合感染，且呈現(xiàn)不同程度的變異。

4 小結(jié)

本調(diào)查結(jié)果顯示：1）對(duì)106 924 份豬血清PRRSV抗體檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，2018年樣品陽性率為79.0%，2019年為76.8%，2020年為64.9%，整體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。2）對(duì)23 708份樣品PRRSV核酸檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，每年第4季度樣品陽性率均高于當(dāng)前前3季度，呈現(xiàn)出季節(jié)性特征。3）基因序列分析顯示，PRRSV流行毒株主要為美洲型毒株lineage1（NADC30-like）與 lineage8（HP-PRRSV)。感染豬群存在不同譜系PRRSV毒株混合感染，且呈現(xiàn)不同程度的變異。43例樣品的ORF5 基因序列與美洲型代表毒株同源達(dá)78.8%～100.0%，其中與LV和LENA 毒株同源性低，為51.8%、21.7%，與其他各型代表毒株的同源性均在78.8%以上；30例樣品NSP2 基因序列與美洲型代表毒株同源達(dá) 78.5%～99.4%，其中與JXA1毒株同源性最高，達(dá)99.4%，而與其他各型代表毒株的同源性均在 88.4%以下。

5 討論

從調(diào)查情況來看，PRRS在我國仍然呈現(xiàn)廣泛流行，防控形勢(shì)總體平穩(wěn)，但不同地區(qū)呈現(xiàn)一定差異，不同豬場(chǎng)之間的感染情況差異較大。該病臨床上主要表現(xiàn)為繁殖障礙、呼吸道疾病及豬群繼發(fā)感染。對(duì)于PRRS的診斷，可以通過流行病學(xué)特點(diǎn)以及臨床癥狀做出初步診斷，但是由于亞臨床癥狀以及繼發(fā)感染普遍存在，該病的鑒別診斷需要通過實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)后方可確定。PRRSV屬于RNA病毒，在感染壓力和外環(huán)境影響下，其基因序列的變異和重組，導(dǎo)致毒株種類眾多，不同毒株的致病力不同，臨床情況復(fù)雜，防控難度加大。因此，對(duì)于PRRSV毒株類型的變化及其病原生態(tài)學(xué)，需要持續(xù)監(jiān)測(cè)其演變情況。對(duì)于養(yǎng)殖場(chǎng)來說，通過對(duì)豬場(chǎng)毒株的基因類型進(jìn)行測(cè)序分析，結(jié)合整體情況制定合適的防控方案，做好生物安全措施，適時(shí)開展凈化，減少因免疫抑制病引發(fā)的繼發(fā)性細(xì)菌感染，是有效防控PRRS，降低豬場(chǎng)損失的必要措施。

5.1 PRRSV抗體檢測(cè)陽性率持續(xù)降低

我國PRRS的抗體陽性率普遍較高，這與疫苗的普遍使用有直接關(guān)系。但是，2018-2020年度PRRSV抗體呈整體下降趨勢(shì)，特別是2020年，從第1季度到第4季度，抗體陽性率持續(xù)下降。自從2018年非洲豬瘟在我國暴發(fā)之后，豬場(chǎng)為盡量降低豬群應(yīng)激，采取了減少疫苗使用種類及頻次的措施，生物安全措施較好的部分種豬場(chǎng)開始進(jìn)行PRRS凈化，對(duì)陽性豬只進(jìn)行了檢測(cè)、淘汰等措施，這可能是導(dǎo)致抗體陽性率持續(xù)降低的原因之一。東北、華東以及西北3個(gè)地區(qū)PRRSV的抗體陽性率相差不大，均在70%以上；而華中、華北地區(qū)PRRSV抗體陽性率次之，在61%～69%之間，而西南地區(qū)PRRSV抗體陽性率最低，為26.3%。西南地區(qū)PRRSV抗體陽性率最低的一個(gè)原因是缺失2018年的樣品數(shù)據(jù)，導(dǎo)致其平均抗體陽性率較低，因此該數(shù)據(jù)結(jié)果與其他區(qū)域不具備可比性。

5.2 與非洲豬瘟在我國發(fā)生前相比，PRRSV核酸陽性率呈現(xiàn)明顯的降低趨勢(shì)

2018-2020年共收集到7個(gè)區(qū)域27個(gè)省份不同規(guī)模豬場(chǎng)樣品進(jìn)行核酸檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)分析顯示，PRRSV核酸陽性率整體呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)，場(chǎng)陽性率由2018年的45.4%下降到2020年的22.9%，樣品陽性率由2018年的22.1%下降到2020年的13.9%。與2018年非洲豬瘟在我國發(fā)生之前相比，PRRS流行與發(fā)生比較平穩(wěn)。隨著生物安全管理被納入豬場(chǎng)的核心工作，豬場(chǎng)生物安全體系不斷完善，車輛洗消、人員管控、引入豬只隔離檢測(cè)等措施的實(shí)施，在很大程度上降低了病毒性疫病對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境的污染，也大幅度降低了PRRSV的污染面，豬場(chǎng)感染率呈現(xiàn)明顯的下降態(tài)勢(shì)，在PRRS防控方面顯現(xiàn)出了積極成效。

從時(shí)間特征來看，第4季度核酸陽性率高于前3季度。因冬春季節(jié)氣候原因，在豬場(chǎng)管理相對(duì)薄弱的情況下容易發(fā)生呼吸道、消化道疾病，且PRRSV 對(duì)熱和干燥敏感，在熱和干燥的條件下能夠迅速失活，適應(yīng)潮濕和陰冷環(huán)境的理化特性，造成PRRS流行與季節(jié)有一定的相關(guān)，但由于此次調(diào)查數(shù)據(jù)僅為2018-2020年我國部分地區(qū)收集的樣品，部分地區(qū)和年份樣品數(shù)量較少，不能完全代表全國疫病流行情況，僅作為臨床疫病防控參考，是否有顯著差異仍需持續(xù)監(jiān)測(cè)才可以進(jìn)一步證實(shí)。

5.3 PRRSV遺傳變異情況復(fù)雜，多種類型毒株共存，主要流行毒株為NADC30-like

調(diào)查結(jié)果顯示，目前我國豬群主要流行的仍然為美洲型毒株lineage1（NADC30-like），高致病型毒株、重組毒株、經(jīng)典型毒株、歐洲型毒株等多種毒株類型共存。近年來，PRRSV新亞群逐步增多且出現(xiàn)毒株重組現(xiàn)象，本次調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)的毒株中重組毒株占比為11%。雖然目前PRRSV 基因組變異與致病性增強(qiáng)或減弱之間的關(guān)系仍不明確，但常常由于新毒株的傳入而造成豬場(chǎng)PRRS不穩(wěn)定，這些重組不僅導(dǎo)致新的PRRSV基因型出現(xiàn)，使病原鑒定的復(fù)雜性提高，而且一定程度上影響了PRRSV的毒力，同時(shí)也使該類毒株的致病性發(fā)生改變，給防控帶來很大挑戰(zhàn)。此外，自2016年新毒株NADC34-like毒株在美國首次報(bào)道后，該毒株逐漸在世界范圍內(nèi)流行開來，2017年，NADC34-like PRRSV在我國首次報(bào)道，NADC34-like毒株屬于Sublineage1.5的一員，已在我國多個(gè)地方取代高致病性PRRSV（HP-PRRSV）成為主要的流行株，對(duì)國內(nèi)也存在嚴(yán)重的威脅，因此，我們必須對(duì)NADC34-like毒株加強(qiáng)監(jiān)測(cè)力度，做好防控措施。同時(shí)近期美國豬群主要流行毒株P(guān)RRSV 1-4-4變異株Lineage 1C毒株，也不容忽視。通過不斷跟蹤毒株的變異情況，分析毒株的變異方向，可提早預(yù)測(cè)PRRS的流行趨勢(shì)，減少其造成的經(jīng)濟(jì)損失。

通過2018-2020年中國多地區(qū)PRRS流行病學(xué)回溯性調(diào)查，對(duì)我國部分地區(qū)的樣品PRRSV抗體、核酸檢測(cè)以及分子遺傳變異3個(gè)方面進(jìn)行檢測(cè)和分析，了解了PRRS在我國流行變化情況，為PRRS防控和下一步區(qū)域凈化提供了一定的數(shù)據(jù)參考。