◎ 楊 坤，劉桂瓊，管春成，龍姜柳，顧 陽

（黔東南州食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，貴州 凱里 556012）

腌魚是貴州省黔東南州侗族地區(qū)特色傳統(tǒng)發(fā)酵型魚產(chǎn)品，是稻田鯉魚通過去除內(nèi)臟、食鹽腌制后，加入辣椒粉、醪糟、白酒等輔料混合均勻于壇子密封自然發(fā)酵3個(gè)月以上，制成一種風(fēng)味獨(dú)特、味道鮮美的民族特色食品[1-2]。因其有助消化和特有的酸辣甜風(fēng)味等特點(diǎn)，具有很好的市場前景。

氟蟲腈又名銳勁特，由法國羅納-普朗克公司研發(fā)，其通過作用于昆蟲γ-氨基丁酸受體，干擾昆蟲的中樞神經(jīng)引起昆蟲神經(jīng)和肌肉過度興奮直至死亡，從而達(dá)到殺蟲作用[3-4]。氟蟲腈主要用于防治水稻、玉米及其他經(jīng)濟(jì)作物的蟲害，被眾多農(nóng)藥專家推薦為替代高毒有機(jī)磷農(nóng)藥的選擇之一，成為防治蟲害的新主力[5-7]。氟蟲腈是一種化學(xué)結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定的農(nóng)藥，使用后經(jīng)光照、水解等作用會(huì)產(chǎn)生氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜和氟甲腈等毒性極高的代謝產(chǎn)物[8]。氟蟲腈雖已被國內(nèi)外禁用，但近年來仍存在農(nóng)藥隱性添加而導(dǎo)致氟蟲腈陽性檢出的現(xiàn)象，歐洲16國等地更是爆出了大規(guī)模的氟蟲腈污染雞蛋的食品安全事件，造成惡劣的食品安全事故[9]。

目前，食品中氟蟲腈及其代謝物的檢測方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜法[10]、液相色譜法[11]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[12]，其前處理方法有QuEChERS法[13-14]和PRiME HLB法[15]，但這些文獻(xiàn)主要以茶葉、水果蔬菜、豬肉為研究對象，沒有專門針對有關(guān)魚類產(chǎn)品中氟蟲腈及其代謝物的分析。本文旨在研究不同的樣品前處理方法對發(fā)酵腌魚中氟蟲腈及其代謝物的凈化效果和基質(zhì)效應(yīng)的影響，建立一種高效簡便的分析腌魚中氟蟲腈及代謝物的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法（Ultra High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，UPLCMS/MS），以期為魚類產(chǎn)品中氟蟲腈及其代謝物的快速分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

6批次腌魚購置于凱里市，5批次購置于黎平縣，4批次購置于錦屏縣，4批次購置于從江縣，3批次購置于榕江縣。

氟蟲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜和氟甲腈等4種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度均為100 mg·L-1，壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司；甲醇，色譜純，德國Merck公司；甲酸，色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；乙酸銨，優(yōu)級純，國藥化學(xué)試劑有限公司；氯化鈉，優(yōu)級純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；無水硫酸鎂，優(yōu)級純，國藥化學(xué)試劑有限公司；C18，40～63 μm，安捷倫科技；N-丙基乙二胺（PSA）40～63 μm，安捷倫科技；試驗(yàn)用水為超純水；PPRiME HLB固相萃取柱（6 mL，300 mg）。

1.2 儀器與設(shè)備

4000+型質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)，美國AB SCIEX公司；Agilent 1290型液相色譜儀，美國Agilent公司；Milli-Q型純水機(jī)，美國Millipore公司；ML104型電子天平，梅特勒-托利多（上海）儀器公司；Multi Reax型多位試管振蕩器，德國Heidolph公司；3-18k型高速冷凍離心機(jī)，德國Sigma公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 溶液的配制

（1）標(biāo)準(zhǔn)使用液的配制。吸取100 mg·L-1氟蟲腈及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)溶液1.00 mL于同一容量瓶中，用甲醇定容至10 mL，配制成10.00 mg·L-1混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，該溶液可在4 ℃下避光保存3個(gè)月。使用前，吸取0.10 mL于100 mL容量瓶中，用初始流動(dòng)相稀釋至刻度，配制質(zhì)量濃度為10.0 ng·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

（2）基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。移取5份空白樣品凈化溶液1.00 mL于5 mL離心管中。再分別加入混合標(biāo)準(zhǔn)使用液 25.0 μL、50.0 μL、100.0 μL、200.0 μL和500.0 μL，氮吹至近干，加入流動(dòng)相初始液1.00 mL溶解，配制成質(zhì)量濃度為 0.25 ng·mL-1、0.50 ng·mL-1、1.00 ng·mL-1、2.00 ng·mL-1和 5.00 ng·mL-1的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，現(xiàn)配現(xiàn)用，過濾膜后待測。

1.3.2 樣品處理方法

稱取2.0 g（精確至0.01 g）腌魚樣品至50 mL離心管中加5 mL水渦旋混合5 min，再加入乙腈10.0 mL、4 g無水硫酸鎂和1 g氯化鈉，渦旋提取10 min，10 000 r·min-1冷凍離心5 min，吸取2.0 mL乙腈提取液于含有150 mg無水硫酸鎂、50 mg PSA和50 mg C18的凈化管中渦旋凈化1 min，靜置后取1.00 mL上清液于5 mL離心管中氮吹至近干，加入流動(dòng)相初始液1.00 mL溶解，過濾膜后待測。

1.3.3 儀器條件

（1）色譜條件。BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫35 ℃；進(jìn)樣體積2 μL；流速0.30 mL·min-1；流動(dòng)相A為含0.1%甲酸的5 mmoL·L-1乙酸銨溶液，B為含0.1%甲酸的甲醇溶液。洗脫程序：0～2.5 min，40%A；2.5～3.5 min，20%A；3.5～5.0 min，20%A；5.0～ 5.1 min，40%A，5.1～7.0 min，40%A。

（2）質(zhì)譜條件。電噴霧負(fù)離子源（ESI-）模式；離子噴射電壓-4 500 V；去溶劑溫度550 ℃；氣簾氣壓力138 kPa；碰撞氣壓力41 kPa；輔助氣1壓力414 kPa；輔助氣2壓力379 kPa；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測（Multiple Reaction Monitoring，MRM）模式，其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件優(yōu)化

氟蟲腈與其代謝物的化學(xué)結(jié)構(gòu)極為接近，酸度系數(shù)為-4.0～-6.0，且極性均偏弱[12]。查閱其他文獻(xiàn)均選擇BEH C18色譜柱作為分離柱[8-14]，本文分別對乙腈-水、乙腈-5 mmoL·L-1乙酸銨溶液、甲醇-水、甲醇-5 mmoL·L-1乙酸銨溶液、0.1%甲酸的甲醇和0.1%甲酸的5 mmoL·L-1乙酸銨溶液為流動(dòng)相進(jìn)行研究，當(dāng)以0.1%甲酸的甲醇和0.1%甲酸的5 mmoL·L-1乙酸銨溶液作為流動(dòng)相時(shí)，4種化合物具有較好的分離效果和靈敏度。因此，選擇0.1%甲酸的甲醇和0.1%甲酸的5 mmoL·L-1乙酸銨溶液作為流動(dòng)相。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

分別配制0.2 μg·mL-1的各化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用蠕動(dòng)泵持續(xù)注入質(zhì)譜儀對氟蟲腈及其代謝物的質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行確認(rèn)。氟蟲腈及其代謝物中含有多種鹵代基團(tuán)，在負(fù)離子源上具有更高的強(qiáng)度[12]。因此，可對4種化合物進(jìn)行負(fù)離子電噴霧母離子（Q1）掃描，確定其母離子，再進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描（MS2），每個(gè)化合物選擇2對響應(yīng)值高的特征離子對作為定量及定性離子對，并對質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后結(jié)果見表1。

表1 質(zhì)譜參數(shù)表

2.3 前處理技術(shù)的優(yōu)化

2.3.1 提取條件的選擇

氟蟲腈及其代謝物極性偏弱，在提取過程中易溶于乙腈溶液中，QuEChERS法自誕生以來主要研究應(yīng)用于植物源性食品，成為農(nóng)藥殘留檢測的首選。因此，本試驗(yàn)主要以腌魚為基質(zhì)研究QuEChERS前處理凈化優(yōu)化。試驗(yàn)使用乙腈作為提取溶劑，比對不同鹽析劑進(jìn)行提取的效率。以含量為2.5 μg·kg-1的加標(biāo)樣品，分別按以下方法進(jìn)行提取。方法1，加0.1%甲酸-乙腈溶液10 mL提取。方法2，加乙腈溶液10 mL提取。方法3，加水5 mL分散，再加乙腈溶液10 mL提取，5 g氯化鈉鹽析。方法4，加水5 mL分散，再加乙腈溶液10 mL提取，4 g無水硫酸鎂和1 g氯化鈉鹽析。其提取液直接上機(jī)測試，氟蟲腈及其代謝物的回收率對比如圖1所示。

由圖1可知，方法4中4 g無水硫酸鎂和1 g氯化鈉作為鹽析劑的提取效果最佳，這是因?yàn)榫彌_液更促進(jìn)鹽析脫水，使化合物分配更易從水相轉(zhuǎn)移至有機(jī)相，從而提高溶劑的提取效率。

圖1 不同提取方法氟蟲腈及其代謝物的提取效率對比圖

2.3.2 凈化條件的選擇

腌魚是一類發(fā)酵后的水產(chǎn)品，除含有大量脂肪和蛋白質(zhì)外，還含有少量辣椒素、色素等雜質(zhì)。QuEChERS凈化包主要有GCB、C18和PSA 3種吸附劑，文獻(xiàn)[3]已驗(yàn)證GCB易吸附4種農(nóng)藥，50 mg C18+50 mg PSA組合在禽蛋和蛋制品上具有較好的凈化效果。因此，本試驗(yàn)在其基礎(chǔ)上考察了PRiME HLB、QuEChERS和PRiME HLB結(jié)合QuEChERS等方式在腌魚基質(zhì)中的凈化效果，各取2 mL提取液于PRiME HLB柱、QuEChERS凈化包和PRiME HLB結(jié)合QuEChERS凈化包中凈化，接收1.00 mL凈化液后氮吹近干并用流動(dòng)相初始液復(fù)溶至1.00 mL，過0.22 μm濾膜上機(jī)。從圖2可知，PRiME HLB凈化4種目標(biāo)化合物的回收率為74.76%～92.94%，PRiME HLB結(jié)合QuEChERS凈化4種目標(biāo)化合物的回收率81.45%～113.69%，QuEChERS凈化除了氟蟲腈亞砜回收率為83.27%外，其他3種目標(biāo)化合物回收率在86.05%～98.65%，回收效果滿意。因此，本研究采用QuEChERS凈化法對腌魚樣品進(jìn)行前處理。

圖2 不同凈化條件氟蟲腈及其代謝物的回收率比對圖

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限與定量限

在儀器工作條件下對基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進(jìn)行測定，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以其相對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，在0.25～10.00 ng·mL-1呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均＞0.999；在1.0 ～ 10.0 μg·kg-1，氟蟲腈及其代謝物的回收率為91.79%～109.84%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.91%～3.39%（n=6）；以3倍信噪比（S/N）和10倍信噪比計(jì)算檢出限和定量限，方法檢出限和定量限分別為0.2～0.4 μg·kg-1和 0.8 ～ 1.2 μg·kg-1，結(jié)果見表3。

表3 線性參數(shù)、檢出限和定量限表

2.5 精密度和回收試驗(yàn)

在 腌 魚 基 質(zhì) 空 白 樣 品 中 分 別 按 1.0 μg·kg-1、3.0 μg·kg-1、10.0 μg·kg-13 水平進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn)，每個(gè)添加水平重復(fù)測定6次來測定回收率，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，3個(gè)添加水平下腌魚樣品中氟蟲腈及其代謝物的平均回收率為91.79%～109.84%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.91%～3.39%。說明該方法符合腌魚中氟蟲腈及其代謝物殘留檢測的檢驗(yàn)方法要求。

表4 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果表（n=6）

2.6 樣品分析

按照試驗(yàn)方法對22批次腌魚進(jìn)行檢測，除了1批次腌魚樣品檢出氟蟲腈砜陽性離子且低于檢出限外，其他腌魚均未檢出。

3 結(jié)論

本文系統(tǒng)地研究了3種不同的樣品前處理方法對發(fā)酵腌魚中氟蟲腈及其代謝物的凈化效果和基質(zhì)效應(yīng)影響，建立了UPLC-MS/MS同時(shí)測定腌魚中氟蟲腈及其代謝物殘留的分析方法。結(jié)果表明該方法簡便、靈敏，各檢測指標(biāo)均滿足分析檢測的要求，且適用于腌魚中氟蟲腈及其代謝物殘留的快速定性、定量分析。